Visualisation de l’innervation immunoréactive du peptide lié au gène de la calcitonine du dura mater crânien de rat avec immunofluorescence et traçage neuronal

Résumé

Ici nous présentons un protocole pour visualiser la corrélation spatiale du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) - fibres nerveuses immunoreactive et vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente avec CGRP et phalloidin, respectivement. En outre, l’origine de ces fibres nerveuses a été tracée rétrograde avec un traceur neural fluorescent.

Résumé

Le but de cette étude était d’examiner la distribution et l’origine du peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) - fibres nerveuses sensorielles immunoreactive du mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction (3D) tridimensionnelle et la technique de tracé rétrograde. Ici, les fibres nerveuses et les vaisseaux sanguins ont été souillés utilisant l’immunofluorescence et les techniques histochimiques avec CGRP et le phalloïdine fluorescent, respectivement. La corrélation spatiale des fibres nerveuses CGRP-immuoreactive dural et des vaisseaux sanguins ont été démontrées par reconstruction 3D. Pendant ce temps, l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive ont été détectées par technique neurale de traçage avec le fluorogold (FG) du secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs). En outre, les caractéristiques chimiques des neurones FG-marqués dans le TG et le DRGs ont été également examinées ainsi que CGRP utilisant de doubles immunofluorescences. Profitant de l’échantillon transparent de tout-montage et de la reconstruction 3D, on lui a montré que les fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et les artérioles phalloidin-étiquetées fonctionnent ensemble ou formant séparément un réseau neurovascular dural dans une vue 3D, alors que les neurones FG-marqués étaient trouvés dans les branches ophtalmiques, maxillaires, et mandibulaires de TG, aussi bien que le C2-3 DRGs ipsilateral du côté de l’application de traceur dans laquelle certains des neurones FG-marqués ont présenté avec l’expression CGRP-immunoreactive. Avec ces approches, nous avons démontré les caractéristiques distributionnelles des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive autour des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura, aussi bien que l’origine de ces fibres nerveuses de TG et de DRGs. Du point de vue de la méthodologie, il peut fournir une référence valable pour comprendre la structure neurovascular compliquée du mater crânien de dura sous l’état physiologique ou pathologique.

Introduction

La dura mater crânienne est la couche la plus externe des méninges pour protéger le cerveau et contient des vaisseaux sanguins abondants et différents types de fibres nerveuses^1,2. De nombreuses études ont montré que le dura mater crânien sensibilisé peut être le facteur clé conduisant à l’apparition de maux de tête, impliquant la vasodilatation et l’innervation anormales^3,4,5. Ainsi, la connaissance de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura est importante pour comprendre la pathogénie des maux de tête, particulièrement pour la migraine.

Bien que l’innervation de dura ait été précédemment étudiée avec l’immunohistochemistry conventionnel, la corrélation spatiale des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura ont été moins étudiées^6,7,8,9. Afin d’indiquer la structure neurovasculaire dural plus en détail, le peptide gène-connexe de calcitonine (CGRP) et la phalloïdine ont été choisis comme marqueurs pour souiller respectivement les fibres nerveuses dural et les vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura de tout-monter avec l’immunofluorescence et l’histochimie fluorescente^10. Il peut s’agir d’un choix optimal pour obtenir une vue tridimensionnelle (3D) de la structure neurovasculaire. En plus, le fluorogold (FG) a été appliqué sur le secteur autour de l’artère méningitique moyenne (MMA) dans le mater crânien de dura pour déterminer l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive, et tracé au ganglion de trigeminal (TG) et aux ganglions dorsaux cervicaux (C) de racine (DRGs), alors que les neurones FG-labeled étaient plus loin examinés ainsi que CGRP utilisant l’immunofluorescence.

Le but de cette étude était de fournir un outil efficace pour étudier la structure neurovascular dans le mater crânien de dura pour l’innervation CGRP-immunoreactive et son origine. En tirant parti du mater transparent de dura de tout-monter et en combinant l’immunofluorescence, le tracé rétrograde, les techniques confocale, et la reconstruction 3D, nous nous attendions à présenter une vue 3D originale de la structure neurovascular dans le mater crânien de dura. Ces approches méthodologiques peuvent être encore servies pour explorer la pathogénie de différents maux de tête.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Institut d’acupuncture et de moxibustion de l’Académie chinoise des sciences médicales (numéro de référence D2018-09-29-1). Toutes les procédures ont été effectuées conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Douze rats mâles adultes Sprague-Dawley (poids 220 ± 20 g) ont été utilisés dans cette étude. Les animaux [numéro de licence SCXK (JING) 2017-0005] ont été fournis par les National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervation de la dura mater crânienne de rat

1. Perfusions
   1. Injecter par voie intrapéritonéale une surdose de solution de tribromoéthanol (250 mg/kg) au rat pour induire l’euthanasie.
   2. Une fois que l’haleine s’arrête, perfuser transcardiaquement avec 100 mL de solution saline normale à 0,9 %, suivie de 250 à 300 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate de 0,1 M (PB, pH 7,4).
   3. Après perfusion, retirez la peau de la tête et ouvrez le crâne pour exposer la dura mater et la face dorsale du cerveau. Disséquer ensuite la dura mater crânienne le long du tronc cérébral jusqu’au bulbe olfactif dans le motif de montage entier(Figure 1). Effectuer une post-fixation dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 2 h, puis cryoprotéger dans du saccharose à 25 % dans du PB 0,1 M pendant plus de 24 h à 4 °C.
2. Immunohistochimie de fluorescence pour le mcrp et le étiquetage de la phalloïde
   REMARQUE: Une combinaison de la souillure fluorescente de CGRP et du phalloidin a été appliquée pour indiquer la corrélation spatiale des fibres nerveuses dural et des vaisseaux sanguins dans le mater crânien de dura de rat dans le modèle de tout-monter.
   1. Rincer la dura mater crânienne dans 0,1 M PB pendant environ 1 min.
   2. Incuber le mater de dura dans une solution de blocage contenant 3% sérum d’âne normal et 0,5% Triton X-100 dans 0,1 M PB pendant 30 min.
   3. Transférer la dura mater dans l’anticorps anti-CGRP de souris (1:1000) dans 0,1 M PB contenant 1% de sérum d’âne normal et 0,5% de Triton X-100 pendant la nuit à 4 °C^11.
   4. Laver la dura mater trois fois en PB 0,1 M le lendemain.
   5. Incuber le dura mater dans une solution mélangée d’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 anti-âne (1:500) et de phalloïde 568 (1:1000) dans 0,1 M PB contenant 1% de sérum d’âne normal et 0,5% de Triton X-100 pendant 1,5 h à température ambiante (26 °C).
   6. Laver la dura mater trois fois en PB 0,1 M.
   7. Coupez les bords et montez-les sur des lames de microscope (voir la table des matériaux).
   8. Mettez des lamelle avec 50% de glycérine avant l’observation.
3. Observation et enregistrement
   1. Observez les échantillons fluorescents sous un microscope fluorescent ou un système d’imagerie confocale.
   2. Prenez les images de la dura mater à monture entière par un microscope fluorescent équipé d’un appareil photo numérique (4x, NA: 0,13), et utilisez un temps d’exposition de 500 ms. Les mosaïques d’images de la dura mater ont été complétées par un logiciel de microscope fluorescent (voir table des matériaux).
   3. Prenez des images des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et des vaisseaux sanguins phalloïdine-marqués dans le mater de dura utilisant un microscope confocal. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission étaient de 488 nm (vert) et de 594 nm (rouge). Le trou d’épingle confocal est de 110 (20x) et 105 μm (40x). La résolution de capture d’image est de 640 x 640 pixels.
   4. Capturez 20 images dans des images de 2 μm de chaque section épaisse de 40 μm et effectuez l’intégration d’image unique dans la mise au point avec un système logiciel associé au traitement d’image confocale pour l’analyse 3D comme suit : Définir le plan focal de départ | Définir le plan focal d’extrémité | Définir la taille de l’étape | Choisissez le motif de profondeur | | de capture d’image Série Z.
   5. Utilisez un logiciel de retouche photo pour ajuster la luminosité et le contraste des images afin d’optimiser la visualisation. Faites attention à ne pas supprimer les données des images.

2. Étude de traçage rétrograde avec FG

1. Interventions chirurgicales
   1. Déterminer la zone de coordonnées d’intérêt chez le rat crânien dura mater.
   2. Préparez une micro-seringue de 10 μL et testez-la avec de la paraffine liquide.
   3. Anesthésier les rats avec une solution de tribromoéthanol (150 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par le manque de réponse au pincement des pincements.
   4. Rasez la tête du rat avec un rasoir électrique.
   5. Mettez des barres d’oreille émoussées au rat et placez-le sur le dispositif stéréotaxique. Ensuite, mettez le porte-bouche et appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux.
   6. Nettoyez le site chirurgical de la peau de la tête à l’aide de 10% d’iode povidone suivi de 75% d’éthanol.
   7. Faites une incision le long de la ligne médiane du cuir chevelu.
   8. Enlever brutalement le périoste et les tissus musculaires du crâne à l’aide d’applicateurs stériles à bout de coton(figure 1A).
   9. Percez un petit trou (~5-7 mm) à l’aide d’une perceuse à bavure avec un trépan à pointe ronde (#106) sur les os pariétal et temporel gauches au-dessus du MMA^12,et assurez-vous que le mater crânien dura a été maintenu intact(Figure 1B).
   10. Construire une berge autour du trou avec du silicate dentaire pour limiter la propagation du traceur(figure 1C).
   11. Ajouter 2 μL de 2% FG dans le trou autour de MMA avec une micro-seringue de 10 μL (Figure 1D).
   12. Couvrez le trou avec un petit morceau d’éponge hémostatique.
   13. Mettez un morceau de film de paraffine sur le trou et scellez les bords avec de la cire d’os pour éviter la fuite de traceur et pour éviter de contaminer les tissus environnants.
   14. Suturer la plaie avec du fil stérile.
   15. Gardez les rats dans une zone chaude jusqu’à ce qu’ils aient complètement récupéré.
   16. Retournez les rats dans leurs cages et ajoutez un antibiotique et un analgésique dans l’eau potable.
2. Perfusions et sections
   1. Après 7 jours de survie, perfuser ces rats comme mentionné ci-dessus dans les procédures décrites à la section 1.1.
   2. Disséquer les DRG TG et C1-4, puis les post-fixer et les cryoprotéger comme mentionné ci-dessus à la section 1.1.3(Figure 1F).
   3. Couper le TG et les DRG à l’épaisseur de 30 μm sur un système de microtome cryostat dans la direction sagittale et monté sur des lames de verre revêtues de silane.
3. Doubles immunofluorescences pour le FG- et CGRP-étiquetage dans le TG et les DRG
   REMARQUE: Bien que le FG-étiquetage puisse être directement observé avec l’éclairage UV sous la lampe au mercure sans coloration supplémentaire^13,14,15,16,les neurones marqués avec FG ont été examinés plus avant dans TG et DRGs cervicaux utilisant de doubles immunofluorescences avec FG et CGRP pour révéler les origines des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive dural dans le TG et les DRG.
   1. Encerclez les sections avec le stylo histochimique.
   2. Incuber les sections pendant 30 minutes dans une solution bloquante contenant 3% de sérum d’âne normal et 0,5% de Triton X-100 dans 0,1 M PB.
   3. Transférer les échantillons dans la solution d’anti-fluorogold de lapin (1:1000) et d’anticorps anti-CGRP de souris (1:1000) dans 0,1 M PB contenant 1% de sérum d’âne normal et 0,5% de Triton X-100 pendant la nuit à 4 °C.
   4. Laver les sections trois fois dans 0,1 M PB le lendemain.
   5. Incuber dans une solution mixte d’anticorps secondaire anti-lapin Alexa Fluor 594 (1:500) et anti-souris Alexa Fluor 488 (1:500) d’âne dans 0,1 M PB contenant 1% de sérum d’âne normal et 0,5% de Triton X-100 pendant 1,5 h à température ambiante.
   6. Laver et appliquer des lamelle de couverture sur les sections en tant que procédures décrites aux étapes 1.2.6 et 1.2.8.
4. Observation et enregistrement
   1. Prenez des images des neurones marqués FG dans TG et DRGs sous éclairage UV par microscope fluorescent équipé d’un appareil photo numérique.
   2. Capturez des images des neurones marqués FG et CGRP dans TG et DRG sous un microscope fluorescent équipé d’un appareil photo numérique.
   3. Utilisez le logiciel d’édition pour ajuster la luminosité et le contraste des images et pour ajouter des étiquettes dans les images.

Résultats

Structure neurovasculaire de la dure-mère crânienne
Après la souillure histochimique immunofluorescente et fluorescente avec CGRP et phalloïdine, des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive et des artérioles dural phalloïdine-marqués et des tissus conjonctifs ont été clairement démontrés dans tout le mater crânien de dura de montage entier dans un modèle 3D(figure 2C,D, E, F). Il a été montré que les fibres ne...

Discussion

Dans cette étude, nous avons avec succès démontré la distribution et l’origine des fibres nerveuses CGRP-immunoreactive dans le mater crânien de dura utilisant l’immunofluorescence, la reconstruction 3D et les approches neurales de traçage avec l’anticorps CGRP et le traceur neural FG, fournissant les preuves histologiques et chimiques pour mieux comprendre le réseau neurovascular dural.

Comme on le savait, cgrp joue un rôle essentiel dans la pathogénie de la migraine

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen by Thermo Fisher Scientific	A21202	Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	Version 1.1	Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system	Olympus	FV1200
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	Protect from light
Fluorescent imaging system	Olympus	BX53
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a	Olympus	Version 4.2	Confocal image processing software system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	Molecular Probes	A12380	Protect from light
Photoshop and  Illustration	Adobe	CS6	Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	National Institutes for Food and Drug Control	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm