JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לדמיין מתאם מרחבי של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי mater באמצעות immunofluorescence והיסטוכימיה פלואורסצנטית עם CGRP ו phalloidin, בהתאמה. בנוסף, מקורם של סיבי עצב אלה היה מדרדר נעוצים במעקב עצבי פלואורסצנטי.

Abstract

מטרת מחקר זה הייתה לבחון את ההתפלגות והמקור של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב חושיים של דורה דורה גולגולתית באמצעות immunofluorescence, תלת מימדי (3D) שחזור טכניקת מעקב מדרדר. כאן, סיבי העצב וכלי הדם היו מוכתמים באמצעות כשל חיסוני וטכניקות היסטוכימיה עם CGRP ופאלואידין פלואורסצנטי, בהתאמה. המתאם המרחבי של סיבי עצב CGRP-immuoreactive dural וכלי דם הוכחו על ידי שחזור 3D. בינתיים, המקור של סיבי העצבים CGRP-immunoreactive זוהו על ידי טכניקת מעקב עצבי עם fluorogold (FG) מהאזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב דורה גולגולתי מאטר כדי גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) גרעיני שורש הגב (DRGs). בנוסף, המאפיינים הכימיים של נוירונים עם תווית FG ב- TG ו- DRGs נבדקו גם יחד עם CGRP באמצעות immunofluorescences כפול. תוך ניצול דגימת ההרה כולה השקופה ושחזור תלת-ממדי, הוכח כי סיבי עצב CGRP-immunoreactive ועורקים עם תווית פאלודין פועלים יחד או יוצרים בנפרד רשת נוירו-וסקולרית דוראלית בתצוגה תלת-ממדית, בעוד נוירונים FG שכותרתו נמצאו בענפים עיניים, maxillary, ו mandibular של TG, כמו גם C2-3 DRGs ipsilateral לצד של יישום מעקב שבו חלק נוירונים FG שכותרתו הציג עם ביטוי CGRP-immunoreactive. עם גישות אלה, הדגמנו את המאפיינים ההפצתיים של סיבי עצב CGRP-immunoreactive סביב כלי הדם ב דורה גולגולתי מאטר, כמו גם את המקור של סיבי עצב אלה מ TG ו DRGs. מנקודת המבט של המתודולוגיה, זה עשוי לספק התייחסות חשובה להבנת המבנה המוחי המסובך של דורה גולגולתי מאטר תחת המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי.

Introduction

ה דורה מאטר גולגולתי הוא השכבה החיצונית ביותר של קרום המוח כדי להגן על המוח ומכיל כלי דם בשפע וסוגים שונים של סיבי עצב1,2. מחקרים רבים הראו כי דורה דורה גולגולתית רגישה עשויה להיות הגורם העיקרי המוביל להתרחשות של כאבי ראש, מעורבים vasodilation חריגה innervation3,4,5. לכן, הידע של מבנה neurovascular ב דורה הגולגולתי mater חשוב להבנת הפתוגנזה של כאבי ראש, במיוחד עבור מיגרנה.

למרות innervation דורה נחקרה בעבר עם אימונוהיסטוכימיה קונבנציונאלי, המתאם המרחבי של סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי מאטר נחקרו פחות6,7,8,9. על מנת לחשוף את המבנה הנוירו-וסקולרי הדוראלי ביתר פירוט, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP) ופאלואידין נבחרו כסמנים להכתמת סיבי העצבים וכלי הדם של דוראלי בכל הר דורה גולגולתי עם כשל חיסוני והיסטוכימיה פלואורסצנטית10. זה עשוי להיות בחירה אופטימלית כדי לקבל תצוגה תלת מימדית (3D) של מבנה neurovascular. בנוסף, fluorogold (FG) יושם על האזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב dura הגולגולתי מאטר כדי לקבוע את המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive, ועקבות גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) שורש הגב הגרעיני (DRGs), בעוד נוירונים FG שכותרתו נבדקו יחד עם CGRP באמצעות immunofluscence.

מטרת מחקר זה הייתה לספק כלי יעיל לחקירת המבנה המוחי בדורה הגולגולתי עבור innervation CGRP-immunoreactive ומקורו. על ידי ניצול היתרון של הר דורה מאטר שקוף כולו ושילוב של immunofluorescence, מעקב מדרדר, טכניקות confocal, ושחזור 3D, ציפינו להציג תצוגה תלת-ממדית חדשנית של המבנה הנוירו-וסקולרי בדורה מאטר הגולגולתי. גישות מתודולוגיות אלה עשויות לשמש עוד יותר לחקר הפתוגנזה של כאבי ראש שונים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ומוקסיבושציה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (מספר סימוכין D2018-09-29-1). כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון, ד.C,1996). במחקר זה נעשה שימוש ב-12 חולדות זכרות בוגרות Sprague-Dawley (משקל 220 ± 20 גרם). בעלי חיים [מספר רישיון SCXK (JING) 2017-0005] סופקו על ידי המכונים הלאומיים לבקרת מזון ותרופות.

1. פנימיות של עכברוש גולגולת דורה מאטר

  1. פשטות פרפוסיות
    1. Intraperitoneally להזריק מנת יתר של פתרון tribromoethanol (250 מ"ג /ק"ג) לחולדה כדי לגרום המתת חסד.
    2. ברגע שהנשימה מפסיקה, transcardially לחלחל עם 100 מ"ל של 0.9% מלוחים נורמלי ואחריו 250-300 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב 0.1 M חוצץ פוספט (PB, pH 7.4).
    3. לאחר זלוף, להסיר את העור הראש ולפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את הדורה מאטר ואת הצד הגבי של המוח. לאחר מכן לנתח את דורה דורה גולגולתי לאורך גזע המוח אל נורת הריח בתבנית כל ההר (איור 1). בצע לאחר קיבעון ב 4% paraformaldehyde עבור 2 שעות, ולאחר מכן cryoprotect ב 25% סוכרוז ב 0.1 M PB עבור יותר מ 24 שעות ב 4 °C (69 °F).
  2. אימונוהיסטוכימיה של פלואורסצנטיות לתיוג CGRP ופאלואידין
    הערה: שילוב של כתמים פלואורסצנטיים של CGRP ו phalloidin הוחל כדי לחשוף את המתאם המרחבי של סיבי עצב dural וכלי דם בחולדה דורה דורה מאטר בתבנית כל ההר.
    1. יש לשטוף את הדורה מאטר הגולגולתי ב-0.1 M PB למשך כדקה.
    2. דגירה דורה מאטר בתמיסת חסימה המכילה 3% סרום חמור נורמלי 0.5% טריטון X-100 ב 0.1 M PB במשך 30 דקות.
    3. להעביר את דורה מאטר לתוך העכבר נגד CGRP נוגדן (1:1000) ב 0.1 M PB המכיל 1% סרום חמור נורמלי ו 0.5% טריטון X-100 לילה ב 4 °C11.
    4. לשטוף את דורה מאטר שלוש פעמים ב 0.1 M PB למחרת.
    5. דגירה דורה מאטר בתמיסה מעורבת של חמור נגד העכבר אלקסה פלואור 488 נוגדן משני (1:500) ו phalloidin 568 (1:1000) ב 0.1 M PB המכיל 1% סרום חמור נורמלי 0.5% טריטון X-100 עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר (26 °C (26 °F).
    6. לשטוף את דורה מאטר שלוש פעמים ב 0.1 M PB.
    7. חותכים את הקצוות ומרכיבים אותו על שקופיות מיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים).
    8. לשים על coverslips עם 50% גליצרין לפני התצפית.
  3. תצפית והקלטה
    1. שימו לב לדגימות הפלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מערכת הדמיה קונפוקלית.
    2. צלם את התמונות של הדורה מאטר הר כולו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית (4x, NA: 0.13), והשתמש בזמן חשיפה של 500 אלפיות השנייה. פסיפסי התמונה של הדורה מאטר הושלמו עם תוכנה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראה טבלת חומרים).
    3. צלם תמונות של סיבי העצבים ה-CGRP-immunoreactive וכלי הדם המסומנים בפאלואידין בדורא מאטר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. אורכי הגל של העירור והפליטה היו 488 ננומטר (ירוק) ו-594 ננומטר (אדום). חור סיכה confocal הוא 110 (20x) ו 105 מיקרומטר (40x). הרזולוציה של לכידת תמונה היא 640 x 640 פיקסלים.
    4. לכוד 20 תמונות ב- 2 מסגרות מיקרומטר מכל מקטע בעובי 40 מיקרומטר ובצע שילוב תמונה יחיד במוקד עם מערכת תוכנה משויכת לעיבוד תמונה קונפוקלית לניתוח תלת-ממדי כדלקמן: הגדר את התחל מישור מוקד | הגדרת | מישור מוקד סיום הגדרת גודל שלב | בחר | תבנית עומק לכידת תמונה | סדרת Z.
    5. השתמש בתוכנה לעריכת תמונות כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות של תמונות כדי למטב את הפריט החזותי. שים לב לא להסיר נתונים מהתמונות.

2. מחקר מעקב מדרדר עם FG

  1. הליכים כירורגיים
    1. לקבוע את אזור הקואורדינטות של עניין בחולדה גולגולת דורה מאטר.
    2. הכינו מזרק מיקרו 10 μL ובדקו אותו עם פרפין נוזלי.
    3. הרדמה את החולדות עם פתרון tribromoethanol (150 מ"ג / קילוגרם) באמצעות הזרקה תוך אישית. בדוק את העומק בהרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטת בוהן.
    4. לגלח את ראשו של החולדה עם סכין גילוח חשמלי.
    5. שים מוטות אוזניים קהים לחולדה והנח אותו על המכשיר הסטריאוטאקסי. ואז לשים את מחזיק הפה ולהחיל משחה עיניים על העיניים.
    6. נקה את האתר הכירורגי של עור הראש באמצעות 10% יוד povidone ואחריו 75% אתנול.
    7. לעשות חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת.
    8. הסר בבוטות את רקמות הפרוסטאום והשרירים מהגולגולת באמצעות אפליקטורים סטריליים בעלי קצהכותנה (איור 1A).
    9. לקדוח חור קטן (~ 5-7 מ"מ) באמצעות מקדחה בר עם סיבית עגולה (#106) על עצמות הקודקוד השמאלית ואת הזמן מעל MMA12, ולוודא כי דורה מאטר הגולגולת נשמר שלם (איור 1B).
    10. בנה גדה סביב החור עם מלט סיליקט דנטלי כדי להגביל את התפשטות מכשיר המעקב (איור 1C).
    11. הוסף 2 μL של 2% FG לתוך החור סביב MMA עם מזרק מיקרו 10 μL (איור 1D).
    12. מכסים את החור עם חתיכה קטנה של ספוג hemostatic.
    13. שים חתיכת סרט פרפין על החור ולאטום את הקצוות עם שעווה בעצמות כדי למנוע דליפה של tracer כדי למנוע זיהום לרקמות שמסביב.
    14. לתפור את הפצע עם חוט סטרילי.
    15. שמור את החולדות באזור חם עד שהם התאוששו לחלוטין.
    16. החזירו את החולדות בחזרה לכלובים שלהן והוסיפו אנטיביוטיקה ומשככי כאבים למי השתייה.
  2. פשטות ומקטעים
    1. לאחר 7 ימי הישרדות, לחלחל חולדות אלה כאמור לעיל בהליכים בסעיף 1.1.
    2. לנתח את TG ו- C1-4 DRGs, ולאחר מכן לאחר לתקן ולהקריא אותם כאמור בסעיף 1.1.3 (איור 1F).
    3. חותכים את TG ו DRGs בעובי של 30 מיקרומטר על מערכת microtome cryostat בכיוון sagittal רכוב על שקופיות זכוכית מצופה סילאן.
  3. תווי חיסון כפולים לתיוג FG ו-CGRP ב-TG וב-DRGs
    הערה: למרות FG-labeling ניתן לראות ישירות עם תאורת UV תחת מנורת כספית ללא כתמים נוספים13,14,15,16, הנוירונים שכותרתו עם FG נבדקו עוד יותר TG ו DRGs צוואר הרחם באמצעות immunofluorescences כפול עם FG ו CGRP לחשיפת מקורותיו של סיבי עצב CGRP-immunoreactive dural ב TG ו DRGs.
    1. הקיפו את החלקים בעט ההיסטוכימי.
    2. דגירה את החלקים במשך 30 דקות בתמיסת חסימה המכילה 3% סרום חמור נורמלי ו 0.5% טריטון X-100 ב 0.1 M PB.
    3. להעביר את הדגימות לתוך הפתרון של ארנב אנטי fluorogold (1:1000) ועכבר נגד CGRP נוגדן (1:1000) ב 0.1 M PB המכיל 1% סרום חמור נורמלי 0.5% טריטון X-100 לילה ב 4 °C (69 °F).
    4. לשטוף את החלקים שלוש פעמים ב 0.1 M PB למחרת.
    5. דגירה בתמיסה מעורבת של חמור נגד ארנב אלקסה פלואור 594 (1:500) וחמור נגד עכבר אלקסה פלואור 488 (1:500) נוגדן משני ב 0.1 M PB המכיל 1% סרום חמור נורמלי 0.5% טריטון X-100 עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
    6. לשטוף ולהחיל coverslips על הסעיפים כמו ההליכים בשלבים 1.2.6 ו 1.2.8.
  4. תצפית והקלטה
    1. צלם תמונות של הנוירונים המסומנים ב- FG ב- TG ו- DRGs תחת תאורת UV על-ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית.
    2. לכוד תמונות של תאי העצב המסומנים ב- FG ו- CGRP ב- TG ו- DRGs תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית.
    3. השתמש בתוכנת העריכה כדי לכוונן את הבהירות והניגודיות של תמונות ולהוסיף תוויות בתמונות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מבנה נוירו-וסקולרי של הדורה מאטר הגולגולתי
לאחר כתמים היסטוכימיים אימונופלואורסצנטיים ופלואורסצנטיים עם CGRP ופלאודין, סיבי עצב CGRP-immunoreactive ועורקים דוראליים עם תווית פאלודין ורקמות חיבור הוכחו בבירור לאורך כל ההר דורה דורה גולגולתי בדפוס תלת-ממדי(א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

במחקר זה, הדגמנו בהצלחה את ההתפלגות ואת המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive בדורא מאטר הגולגולתי באמצעות immunofluorescence, שחזור תלת מימדי וגישות מעקב עצבי עם נוגדן CGRP ומעקב עצבי FG, מתן ראיות היסטולוגיות וכימיות כדי להבין טוב יותר את הרשת neurovascular dural.

כפי שהיה ידוע, CGRP ממלא תפקיד קריטי בפתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי הפרויקט של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (קוד פרויקט מס ' 2019YFC1709103; מס ' 2018YFC1707804) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (קוד פרויקט מס ' 81774211; מס ' 81774432; מס ' 81801561).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)Invitrogen by Thermo Fisher ScientificA21202Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrumentNarishigeSR-50
CellSens DimensionOlympusVersion 1.1Software of fluorescent microscope
Confocal imaging systemOlympusFV1200
Fluorogold (FG)Fluorochrome52-9400Protect from light
Fluorescent imaging systemOlympusBX53
Freezing microtomeThermoMicrom International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2aOlympusVersion 4.2Confocal image processing software system
Micro DrillSaeyang MicrotechMarathon-N7
Mouse anti-CGRPAbcamab81887RRID: AB_1658411
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin 568Molecular ProbesA12380Protect from light
Photoshop and  IllustrationAdobeCS6Photo editing software
Rabbit anti- FluorogoldAbcamab153RRID: AB_90738
Sprague DawleyNational Institutes for Food and Drug ControlSCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slidesThermo#4951PLUS-00125x75x1mm

References

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6(2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861(2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

167fluorogold

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved