Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Resumen

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Resumen

Las moscas de la arena son los vectores naturales de las especies de Leishmania, parásitos protozoos que producen un amplio espectro de síntomas que van desde lesiones cutáneas hasta patología visceral. Descifrar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos es de importancia primordial para una mejor comprensión de la transmisión de Leishmania a sus huéspedes. Entre los parámetros que controlan la competencia de vectores de mosca de arena (es decir, su capacidad para transportar y transmitir patógenos), se demostró que los parámetros intrínsecos a estos insectos desempeñaban un papel clave. La respuesta inmune de los insectos, por ejemplo, afecta la competencia de vectores de mosca de arena a Leishmania. El estudio de estos parámetros se ha visto limitado por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos organismos no modelo. La regulación genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA) es posible, pero además de ser técnicamente desafiante, el silenciamiento conduce a sólo una pérdida parcial de la función, que no se puede transmitir de generación en generación. La mutagénesis dirigida por la tecnología CRISPR/Cas9 fue recientemente adaptada a la mosca de arena Phlebotomus papatasi. Esta técnica conduce a la generación de mutaciones transmisibles en un locus elegido específicamente, lo que permite estudiar los genes de interés. El sistema CRISPR/Cas9 se basa en la inducción de roturas de ADN de doble hebra dirigidas, posteriormente reparadas por la Unión Final No Homologosa (NHEJ) o por la Reparación Impulsada por Homología (HDR). NHEJ consiste en un cierre simple de la rotura y con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción / eliminación. Por el contrario, HDR utiliza la presencia de una molécula de ADN donante que comparte homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Aquí, presentamos un método de microinyección de embriones de mosca de arena para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 utilizando NHEJ, que es la única técnica de modificación del genoma adaptada a los vectores de mosca de arena hasta la fecha.

Introducción

Las enfermedades transmitidas por vectores son una de las principales amenazas para la salud pública en la evolución constante. Cientos de especies vectoriales repartidas entre familias filogengénicas muy distintas (por ejemplo, mosquitos, garrapatas, pulgas) son responsables de la transmisión de un gran número de patógenos microbianos, lo que resulta en más de 700.000 muertes humanas al año, según la Organización Mundial de la Salud. Entre los insectos vectoriales, las moscas de arena de fenbotomina (Diptera, Psicodidae) constituyen un vasto grupo, con 80 especies vectoriales probadas que exhiben rasgos fenotípicos distintos y capacidades vectoriales que se encuentran en diferentes regiones geográficas. Son vectores para los parásitos protozoicos del género Leishmania,causando alrededor de 1,3 millones de nuevos casos de Leishmaniases y entre 20.000 y 30.000 muertes al año. Los resultados clínicos de leishmaniases son diversos, con síntomas que van desde lesiones cutáneas autolimitantes hasta difusión visceral que es fatal en ausencia de tratamiento.

Las moscas de arena son insectos estrictamente terrestres. Su ciclo de vida, relativamente largo en comparación con otros Diptera, dura hasta tres meses, dependiendo de diferentes parámetros como la temperatura, la humedad y la nutrición. Consta de una etapa embrionaria (6 a 11 días), cuatro etapas larvarias (con una duración total de 23 a 25 días) y una etapa pupal (9 a 10 días) seguida de metamorfosis y luego la edad adulta. Las moscas de la arena requieren un ambiente húmedo y cálido para la cría. Tanto los machos como las hembras se alimentan de azúcares, obtenidos en la naturaleza a partir de néctares de flores. Sólo las hembras son alimentadoras de sangre, ya que requieren proteínas obtenidas de la harina de sangre para la producción de huevos^1.

Un enfoque importante de la investigación es identificar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos que conducen al desarrollo de infecciones transmisibles. Al igual que con otros insectos vectoriales, se ha demostrado que los parámetros intrínsecos a las moscas de arena afectan su competencia vectorial, que se define como su capacidad para transportar y transmitir patógenos a sus huéspedes. Por ejemplo, la expresión de galectinas por el Phlebotomus papatasi sand fly midgut cells, actuando como receptores que reconocen componentes de la superficie del parásito, puede influir directamente en su competencia vectorial para Leishmania major^2,3. La vía de respuesta inmune de insectos, Inmunodeficiencia (IMD), también es crucial para la competencia vectorial de mosca de arena Phlebotomus papatasi para Leishmania major⁴. Un papel crítico para las vías de respuesta inmune de insectos vectoriales en el control de su transmisión de patógenos infecciosos se ha notificado de manera similar en los mosquitos Aedes aegypti ^5,6,7, en la mosca de la tsetse Glossina morsitans^8,y en Anopheles gambiae mosquitos^9,10.

Los estudios de las interacciones entre mosca de la arena/Leishmania se han visto limitados por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos insectos. Sólo se había realizado la regulación de la bajada genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA)^11,12,13,14 hasta hace poco. La técnica, limitada por la mortalidad asociada con la microinyección de las hembras adultas, conduce sólo a una pérdida parcial de la función, que no puede transmitirse de generación en generación.

La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la investigación genómica funcional en organismos no modelo como las moscas de arena. Modificado desde el sistema inmune adaptativo en prokaryotes para la defensa contra bacteriófagos^15,16, el sistema CRISPR Cas9 se ha adaptado rápidamente como una herramienta de edición del genoma para organismos eucariotas superiores, incluyendo insectos. El principio de la edición del genoma objetivo CRISPR/Cas9 se basa en la complementariedad de un ARN guía único (sgRNA) a un locus genómico específico. La nucleasa Cas9 se une al sgRNA y crea una rotura de ADN de doble hebra (dsDNA) en el ADN genómico donde el esgRNA se asocia con su secuencia complementaria. El complejo Cas9-sgRNA se guía a la secuencia de destino por 17 a 20 bases complementarias en el sgRNA al locus elegido, la rotura dsDNA puede ser reparada por dos vías independientes: unión final nohomóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR)^17. La reparación de NHEJ implica un cierre simple de la rotura, pero con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción/eliminación. La reparación del ADN a través de HDR utiliza una molécula de ADN de donante que comparte la homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Los insectos poseen ambas máquinas.

La tecnología CRISPR/Cas9 puede generar mutaciones en un locus elegido, a través de la vía de reparación del NHEJ; o para estrategias de edición del genoma más complejas, como knock-ins o reporteros de expresión, a través de la vía HDR con una plantilla de donante adecuada. En moscas de arena, se generaron alelos mutantes nulos del factor de respuesta inmune Sabor a través de CRISPR mediado por NHEJ en Phlebotomus papatasi⁴. También se inyectaron embriones de mosca de arena en otro estudio con una mezcla CRISPR/Cas9 dirigida al gen que codifica el amarillo. Aún así, no se produjeron adultos portadores de la mutación^18. Aquí describimos un método detallado de mosca de arena dirigida mutagénesis por CRISPR/Cas9 mediada por NHEJ, con un enfoque particular en la microinyección embrionaria, un paso crítico del protocolo.

Protocolo

El uso de ratones como fuente de sangre para la alimentación de moscas de arena se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Los invertebrados no están cubiertos por las directrices de los NIH.

1. Preparación de la aguja (Figura 1)

1. Tire de agujas y bisel como se describe en Meuti y Harrell¹⁹. Brevemente, tire de agujas en un extractor de micropipette de vidrio de doble etapa, utilizando capilares de vidrio borosilicato.
2. Afilar las agujas al biselar húmedo en el biselador de micropipette, utilizando una piedra extra fina.

2. Colección de embriones y micromanipulación (Figura 2)

1. Cinco días antes del día de la inyección, las hembras de arena de ensangrendero se realizan rutinariamente para el mantenimiento de colonias. Para obtener más información sobre los procedimientos de cría de colonias de moscas de arena y el material requerido, consulte Abogado et al.¹ Mantenga los insectos en incubadoras al 70% de humedad y a 26 °C, durante todo su desarrollo.
   1. Un día después de la alimentación en la sangre, capturar hembras alimentadas con sangre por grupos de 100-150 en macetas de yeso con un puerto lateral. Mantener a las hembras alimentándolas con solución de azúcar (30% sacarosa – suficiente volumen para remojar una pequeña bola de algodón) que es habitual para el mantenimiento de colonias.
2. En el día 2-3 después de la alimentación en la sangre, NO humedezca las ollas de yeso. Mantener a las hembras en un sustrato seco evitará la puesta prematura de huevos, ya que las hembras prefieren poner huevos en un ambiente húmedo.
3. El día 5 después de la lactancia sanguínea, realice la recolección de embriones, la micromanipulación y la microinyección. Introduzca un papel de filtro húmedo en la cámara de puesta de huevos. Los embriones recién colocados no tienen un corion completamente desarrollado y parecen blancos. Utilice papel de filtro negro durante el procedimiento para facilitar la visualización de los embriones blancos.
4. Transfiera un pequeño grupo de hembras de la olla de yeso a la cámara de puesta de huevos a través de los puertos laterales usando un aspirador de boca. La presencia de un sustrato húmedo (el papel filtrante) induce a las hembras a oviposit.
5. Después de 30-60 min, recupere cuidadosamente el papel filtrante con embriones recién colocados de la cámara. Guarde el papel filtrante y los embriones en una placa de Petri durante un tiempo de hasta 3 horas. Durante este tiempo, evalúe regularmente el nivel de humedad del papel filtrante para asegurarse de que permanece húmedo. Durante este tiempo, repita los pasos 2.4 a 2.6 con nuevos grupos de hembras y recoja tantos embriones como sea posible.
6. Preparar diapositivas de microscopio para la inyección: recoger manualmente los huevos uno por uno con un pincel muy fino y transferirlos cuidadosamente a otro pedazo de papel de filtro negro húmedo colocado en un tobogán de microscopio cubierto con un tubo de cubierta de vidrio.
   1. Agregue agua al papel filtrante, suficiente para mantener los embriones húmedos, pero no haciendo que floten lejos de la cubierta o siendo succionados bajo la cubierta. Alinee los embriones contra la mancha. La mancha de cubierta actúa como un backstop que impide que los huevos se desvíen durante la inyección.

3. Inyecciones de embriones (Figura 3)

1. Inicie las inyecciones de 2,5 a 3 horas después del inicio de la recogida de huevos. Realice inyecciones a temperatura ambiente y humedad ambiental del laboratorio.
2. Asegúrese de que los embriones alineados tengan suficiente agua para que se mantengan húmedos.
   NOTA: Es fundamental que los embriones se mantengan húmedos durante las inyecciones. Si no están húmedos durante el proceso de inyección, las inyecciones se vuelven difíciles porque la aguja tiene problemas para perforar el embrión. La cantidad correcta de agua es el punto en el que los embriones tienen un menisco de agua a su alrededor, pero la mancha de cubierta no está flotando en la parte superior del agua causando que los embriones empujen debajo de la cubierta. Es fundamental controlar la cantidad de agua alrededor de los embriones durante las inyecciones. Agregue agua según sea necesario para mantener los embriones húmedos.
3. Agregue el agua cuidadosamente mojando un cepillo con agua y transfiriendo el agua a la parte posterior del papel filtrante. La adición de agua de esta manera permite añadir agua de una manera lenta y controlada para que se agregue lo suficiente para mantener los embriones húmedos. Demasiada agua puede hacer que los embriones floten fuera de la alineación, lo que dificulta la inyección de los embriones.
4. Mezcla de inyección de carga posterior en la aguja de microinjeción. Añadir aproximadamente 0,5 a 1 μL de mezcla de inyección en la aguja utilizando un relleno de aguja de borosilicato dibujado a mano, también se pueden utilizar puntas de pipete de carga de gel. La mezcla de inyección se compone de uno o varios ARN guía (80 ng/μL cada uno) diseñado para dirigirse a un locus específico mezclado con proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).
5. A partir de la presión de inyección a 30 psi, presione el disparador de inyección para expulsar el aire de la punta de la aguja. Esto forzará la mezcla de inyección a la punta de la aguja permitiendo que la mezcla de inyección fluya. En este punto, aumente lentamente la presión constante/de retención hasta que el material de inyección comience a fluir, luego vuelva a bajar la presión constante/de retención para que esté justo debajo del punto de la mezcla de inyección que fluye desde la aguja. El ajuste cerrado debe entregar suficiente material de inyección para que se pueda ver una pequeña cantidad de material para entrar en el embrión.
   NOTA: Inicialmente se probó la inyección de embriones de mosca de arena bajo aceite de halocarbono similar a otros protocolos utilizados para drosophila y mosquitos, sin embargo, el porcentaje de supervivencia para estas inyecciones fue muy bajo. La supervivencia se mejoró cambiando a inyecciones en papel filtrante húmedo como se describió anteriormente.
6. Inserte la aguja en el lado del embrión. Utilice la mancha de cubierta detrás del embrión como un backstop que ayudará a la aguja a perforar el embrión. Entregue una pequeña cantidad de mezcla de inyección en el embrión antes de extraer suavemente la aguja.
7. Inmediatamente después de retirar la aguja, presione el inyector para extraer cualquier material rellenado de la punta de la aguja. Esto ayudará a evitar que la aguja se obstruya.
8. Proceda al siguiente embrión. Entre cada inyección, asegúrese de que el papel filtrante esté húmedo y que la aguja no esté obstruida.
9. Una vez inyectados todos los embriones, cuente el número de embriones inyectados para mantener un recuento corriente.
10. Retire la cubierta añadiendo agua al papel filtrante para que el tapatío flote. En este punto, utilice una sonda (palo aplicador de madera con pasador de insecto pegado a la punta) para mantener el papel filtrante en su lugar mientras se utiliza un dedo para tirar de la mancha de cubierta lejos de los embriones inyectados.
11. Borres el exceso de agua del papel filtrante una vez que se haya eliminado el clip de cubierta.

4. Crianza post-inyección (G₀) (Figura 4)

1. Transfiera el papel filtrante con los embriones encima de varias capas de papel filtrante húmedo colocados en una placa De Petri para mantener la humedad. Mantenga los embriones aquí durante el tiempo necesario para inyectar otros embriones. Los embriones se pueden celebrar durante un máximo de 3 horas como este. Después de la inyección se volverán lentamente marrones.
2. Una vez inyectados todos los embriones, transfiéralos manualmente a macetas de yeso de pequeño tamaño previamente humedecidas. No ponga demasiados embriones en cada maceta y mantenga la distancia entre ellos, para evitar una posible contaminación fúngica entre individuos. Cubra las macetas con una pantalla y guárdelas como se haría normalmente para los huevos de colonia de moscas de arena, mantenidas en incubadoras al 70% de humedad y a 26 °C, durante todo su desarrollo.
3. El día 1 después de la inyección, retire todos los embriones dañados y muertos con un pincel. Añadir 100 μL de ácido propionico del 0,5%, gota a gota, en las macetas de yeso que contienen los embriones inyectados para limitar la contaminación fúngica. La liberación de citoplasma de embriones dañados durante el proceso de inyección es particularmente favorable para el crecimiento fúngico.
4. Revise las macetas de yeso todos los días y retire cualquier embrión malo o muerto. Si el hongo está presente, retire todos los embriones infectados y agregue unas gotas de ácido propionico al 0,5%.
5. Las larvas eclosionan entre el día 8 y 12 después de la inyección. Dos veces al día, transfiera las larvas recién emergidas a nuevas macetas de yeso, en grupos de máximo de 5-10. Agregue una pequeña cantidad de comida y revise la comida 2-3 veces a la semana.
   1. Controle cuidadosamente la cantidad de alimentos larvarios, ya que aumenta demasiado el riesgo de contaminación fúngica. Las larvas de mosca de arena sobreviven mejor en grupos, sin embargo, pueden ser caníbales si no hay suficiente comida.
6. Cuando las larvas pupen, separe por sexo para mantener a las hembras como vírgenes. Si hay muchos sobrevivientes, deseche a los machos y mantenga sólo a las hembras.
   NOTA: Tanto los machos como las hembras pueden llevar y transmitir mutaciones. Sin embargo, como las hembras tienen que ser mantenidas vírgenes antes de que se crucen, es más fácil utilizar sólo las hembras inyectadas G₀ para evitar tener que separar insectos wt por sexo. Los machos G₀ se pueden mantener como refuerzo si el número de sobrevivientes adultos es bajo y en este caso serán apareados con hembras vírgenes wt ordenadas.

5. Selección y cribado de alelos mutantes (Figura 5)

1. Cruza en masa a las hembras G₀ con machos wt en una jaula. Ensangrente por completo, como se haría para el mantenimiento normal de colonias.
2. Un día después de la alimentación en sangre, transfiera cada hembra G₀ con machos de 2-3 wt en tubos de yeso individuales usando un aspirador bucal. Alimente las moscas con azúcar en una pequeña bola de algodón cambiada todos los días y use una jeringa de agua para asegurarse de que la humedad del yeso es adecuada para la puesta de huevos.
3. Después de que las hembras G₀ hayan puesto huevos (correspondientes a G_1),recojan sus cuerpos en tubos Eppendorf individuales y anotados para genotipados posteriores. Mantener los embriones como se suele hacer para las colonias wt.
4. Extraiga el ADN de las hembras G₀ por el método de elección.
5. Examine el ADN en busca de la presencia de mutaciones, por ejemplo diseñando un ensayo de PCR utilizando imprimaciones que rodean la región de los cortes CRISPR esperados.
6. Mantenga sólo los embriones G₁ colocados por las hembras G₀ mostrando evidencia de transformación. Cuando estos embriones G₁ se conviertan en pupas, separe por sexo y mantenga sólo a las hembras. Cruzar las hembras G₁ de la misma hembra G₀ a los machos wt, alimentarlos de sangre, luego transferir en pequeños grupos de 2-3 hembras y 4-5 machos en recipientes de tamaño pequeño.
   NOTA: Todos los individuos G₁ tienen la oportunidad de llevar una mutación única, por lo que si el número de individuos sobrevivientes no es demasiado alto, entonces es mejor cruzar a las hembras G₁ individualmente con machos wt. El caso de varias hembras portadoras de una mutación diferente presente en un mismo tubo es raro, pero puede ocurrir. Si tal caso se observa después del genotipado, las hembras progenies G₂ deben aparearse individualmente a los machos wt. Este esquema de apareamiento evita la posibilidad de múltiples mutaciones en la progenie.
7. Después de la puesta de huevos, recoger los cuerpos femeninos G₁ y examinarlos en busca de mutaciones. Mantenga sólo los tubos donde al menos una hembra mostró evidencia de mutación.
8. Para las generaciones posteriores, haga un solo par en cruces. Después de la puesta de huevos, examine a los padres en busca de presencia de mutación. Repita en cada generación hasta que ambos padres sean homocigóidos por la misma mutación. Una vez identificados, serán los fundadores de un stock mutante homocigógio.

Resultados

El protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 descrito aquí para generar mutantes de mosca de arena se estableció en una publicación anterior⁴. Este enfoque produjo mutagénesis altamente eficiente, ya que 11 de cada 540 individuos sobrevivieron al procedimiento, de los cuales 9 fueron mutantes. Al diseñar guías para la mutación CRISPR/Cas9, un primer paso crítico es secuenciar la región alrededor del área a la que se va a dirigir. La plantilla para la secuenciación debe ser de la cepa que...

Discusión

Presentamos aquí un método de microinjección embrionaria recientemente desarrollado para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 en moscas de arena Phlebotomus papatasi. La microinyección embrionaria para la modificación genética de insectos se desarrolló en Drosophila a mediados de la década de 1980²¹ y ahora se utiliza rutinariamente en una amplia variedad de insectos. Se han desarrollado otros métodos para la entrega de materiales de modificación genética para su u...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Filter Paper 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
Dissecting Microscope	Any brand		For aligning embryos
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Base layer of the microinjection set up Figure 2A
Insect cage	custom made or several commercial options		polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larval food	custom made		a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Used to back fill microinjection needles
Mouth aspirator	John W. Hock Company	Model 612	mouth aspirator with HEPA filter
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microinjection microscope
Ovipots	Nalge company		ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Paint Brush 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Used for aligning embryos
Propionic acid	Sigma-Aldrich	402907	antifungal agent
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-3	Used for making microinjection needles
Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator	Sutter Instruments		Microinjection Controller and Micromanipulator