Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Resumo

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Resumo

Moscas de areia são os vetores naturais da espécie Leishmania, parasitas protozoários produzindo um amplo espectro de sintomas que vão desde lesões cutâneas até patologia visceral. Decifrar a natureza das interações vetor/parasita é de importância primária para uma melhor compreensão da transmissão de Leishmania aos seus hospedeiros. Entre os parâmetros que controlam a competência vetorial da mosca de areia (ou seja, sua capacidade de transportar e transmitir patógenos), parâmetros intrínsecos a esses insetos mostraram-se um papel fundamental. A resposta imune a insetos, por exemplo, impacta a competência vetorial da mosca da areia para a Leishmania. O estudo desses parâmetros tem sido limitado pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses organismos não-modelo. A baixa genética por RNA de pequena interferência (siRNA) é possível, mas além de ser tecnicamente desafiador, o silenciamento leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração. Mutagênese direcionada pela tecnologia CRISPR/Cas9 foi recentemente adaptada para a mosca de areia Phlebotomus papatasi. Essa técnica leva à geração de mutações transmissíveis em um lócus especificamente escolhido, permitindo estudar os genes de interesse. O sistema CRISPR/Cas9 conta com a indução de quebras de DNA de dois fios direcionados, posteriormente reparados por NHEJ (Non-Homólogos End Joining) ou por Homology Driven Repair (HDR). O NHEJ consiste em um simples fechamento da quebra e frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. Em contraste, o HDR usa a presença de uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Aqui, apresentamos um método de microinjeção de embriões de mosca de areia para mutagênese direcionada pelo CRISPR/Cas9 usando NHEJ, que é a única técnica de modificação do genoma adaptada aos vetores de mosca de areia até o momento.

Introdução

As doenças transmitidas por vetores são uma grande ameaça à saúde pública em constante evolução. Centenas de espécies vetoriais espalhadas por famílias filogênicas muito distintas (por exemplo, mosquitos, carrapatos, pulgas) são responsáveis pela transmissão de um grande número de patógenos microbianos, resultando em mais de 700.000 mortes humanas por ano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Entre os insetos vetoriais, as moscas de areia de flebotomina (Diptera, Psychodidae) constituem um vasto grupo, com 80 espécies vetoriais comprovadas exibindo traços fenotípicos distintos e capacidades vetoriais encontradas em diferentes regiões geográficas. São vetores para os parasitas protozoários do gênero Leishmania,causando cerca de 1,3 milhão de novos casos de Leishmanioses e entre 20.000 e 30.000 mortes por ano. Os desfechos clínicos das leishmanioses são diversos, com sintomas que vão desde lesões cutâneas auto-limitantes até disseminação visceral que é fatal na ausência de tratamento.

Moscas de areia são insetos estritamente terrestres. Seu ciclo de vida, relativamente longo em comparação com outros Diptera, dura até três meses, dependendo de diferentes parâmetros, como temperatura, umidade e nutrição. Consiste em um estágio embrionário (6 a 11 dias), quatro estágios larvais (com duração total de 23 a 25 dias) e um estágio pupal (9 a 10 dias) seguido de metamorfose e depois idade adulta. Moscas de areia requerem um ambiente úmido e quente para a criação. Tanto machos quanto fêmeas se alimentam de açúcares, obtidos na natureza a partir de néctars de flores. Apenas as fêmeas são alimentadores de sangue, pois necessitam de proteínas obtidas da farinha de sangue para a produção de ovos¹.

Um foco importante da pesquisa é identificar a natureza das interações vetor/parasita que levam ao desenvolvimento de infecções transmissíveis. Assim como outros insetos vetoriais, parâmetros intrínsecos às moscas de areia têm mostrado impacto em sua competência vetorial, que é definida como sua capacidade de transportar e transmitir patógenos para seus hospedeiros. Por exemplo, a expressão de galectinas pelos phlebotomus papatasi e células midgut de mosca, agindo como receptores reconhecendo componentes da superfície parasita, pode influenciar diretamente sua competência vetorial para Leishmania maior^2,3. A via de resposta imune ao inseto, Immune Deficiency (IMD), também é crucial para a competência vetorial de phlebotomus papatasi para a Leishmania maior⁴. Um papel crítico para as vias de resposta imune a insetos vetoriais no controle de sua transmissão de patógenos infecciosos tem sido relatado da mesma forma nos mosquitos Aedes aegypti ^5,6,7, na mosca tsé-tsé Glossina morsitans⁸, e em Anopheles gárdias mosquitos ^9,10.

Estudos de interações de moscas deareia/Leishmania têm sido limitados pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses insetos. Apenas a desregulamentação genética por RNA de pequena interferência (siRNA) havia sido realizada^11,12,13,14 até recentemente. A técnica, limitada pela mortalidade associada à microinjeção de fêmeas adultas, leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração.

A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a pesquisa genômica funcional em organismos não-modelo, como moscas de areia. Modificado do sistema imunológico adaptativo em procariotes para defesa contra bacteriófagos^15,16, o sistema CRISPR Cas9 foi rapidamente adaptado como uma ferramenta de edição de genomas para organismos eucarióticos superiores, incluindo insetos. O princípio da edição de genoma direcionada do CRISPR/Cas9 baseia-se na complementaridade de um único guia RNA (sgRNA) a um lócus genômico específico. A nuclease Cas9 se liga ao sgRNA e cria uma quebra de DNA de duas vertentes (dsDNA) no DNA genômico onde o sgRNA se associa à sua sequência complementar. O complexo Cas9-sgRNA é guiado à sequência de destino por 17 a 20 bases complementares no sgRNA para o lócus escolhido, o rompimento dsDNA pode então ser reparado por duas vias independentes: junção final nonhomologous (NHEJ) ou reparo direcionado à homologia (HDR)¹⁷. O reparo do NHEJ envolve um simples fechamento do intervalo, mas frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. A reparação de DNA através do HDR usa uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Insetos possuem ambas as máquinas.

A tecnologia CRISPR/Cas9 pode gerar mutações em um lócus escolhido, através da via de reparo NHEJ; ou para estratégias de edição de genomas mais complexas, como knock-ins ou repórteres de expressão, através da via HDR com um modelo de doador apropriado. Em moscas de areia, alelos mutantes nulos do fator de resposta imune Relish foram gerados através de CRISPR mediado por NHEJ em Phlebotomus papatasi⁴. Embriões de mosca de areia também foram injetados em outro estudo com uma mistura CRISPR/Cas9 visando a codificação genética Amarela. Ainda assim, nenhum adulto portador da mutação foi produzido¹⁸. Descrevemos aqui um método detalhado de mutagênese direcionada à mosca-da-areia pelo CRISPR/Cas9 mediado pela NHEJ, com um foco particular na microinjeção do embrião, um passo crítico do protocolo.

Protocolo

O uso de camundongos como fonte de sangue para alimentação de moscas de areia foi realizado de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Os invertebrados não estão cobertos pelas diretrizes do NIH.

1. Preparação da agulha(Figura 1)

1. Puxe agulhas e bisel como descrito em Meuti e Harrell¹⁹. Brevemente, puxe agulhas em um puxador de micropipette de vidro de dois estágios, usando capilares de vidro borossilicato.
2. Afie as agulhas molhadas no beveller de micropipette, usando uma pedra extra fina.

2. Coleta e micromanipulação de embriões (Figura 2)

1. Cinco dias antes do dia da injeção, a alimentação sanguínea e as fêmeas voam fêmeas como realizada rotineiramente para a manutenção da colônia. Para obter detalhes sobre as colônias de moscas de areia que criam procedimentos e material necessário, consulte Lawyer et al.¹ Mantenha os insetos em incubadoras com 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.
   1. Um dia, após a alimentação sanguínea, capture fêmeas alimentadas com sangue por grupos de 100-150 em potes de gesso com uma porta lateral. Mantenha as fêmeas alimentando-as com solução de açúcar (30% de sacarose – volume suficiente para absorver uma pequena bola de algodão) o que é comum para a manutenção da colônia.
2. No dia 2-3 pós alimentação sanguínea, NÃO umedeça os potes de gesso. Manter as fêmeas em um substrato seco evitará a colocação prematura de ovos, uma vez que as fêmeas preferem colocar ovos em um ambiente úmido.
3. No dia 5 pós-alimentação sanguínea, realize a coleta de embriões, micromanipulação e microinjeção. Introduza um papel filtro úmido na câmara de colocação de ovos. Embriões recém-colocados não têm um acorde totalmente desenvolvido e parecem brancos. Use papel filtro preto durante o procedimento para facilitar a visualização dos embriões brancos.
4. Transfira um pequeno grupo de fêmeas da panela de gesso para a câmara de colocação de ovos através das portas laterais usando um aspirador bucal. A presença de um substrato úmido (o papel filtro) induz as fêmeas a oviposit.
5. Depois de 30-60 min, recupere cuidadosamente o papel filtro com embriões recém-colocados da câmara. Mantenha o papel filtro e os embriões em uma placa de Petri por até 3 horas. Durante este tempo, avalie regularmente o nível de umidade do papel filtro para garantir que ele permaneça úmido. Durante esse período, repita as etapas 2.4 a 2.6 com novos grupos de fêmeas e colete o maior número possível de embriões.
6. Prepare slides de microscópio para a injeção: colete manualmente os ovos um a um com um pincel muito fino e transfira-os cuidadosamente para outro pedaço de papel filtro preto úmido colocado em um slide de microscópio coberto com uma mancha de vidro.
   1. Adicione água ao papel filtro, o suficiente para manter os embriões úmidos, mas não fazendo com que flutuem para longe da tampa ou sejam sugados sob a tampa. Alinhe os embriões contra o deslizamento. O deslizamento de cobertura age como um backstop impedindo que os ovos se afastem durante a injeção.

3. Injeções de Embriões(Figura 3)

1. Iniciar injeções de 2,5 a 3 horas após o início da coleta de ovos. Realizar injeções à temperatura ambiente e umidade do laboratório ambiente.
2. Certifique-se de que os embriões alinhados tenham água suficiente para que sejam mantidos úmidos.
   NOTA: É fundamental que os embriões sejam mantidos úmidos durante as injeções. Se não estiverem úmidos durante o processo de injeção, as injeções se tornam difíceis porque a agulha tem problemas para perfurar o embrião. A quantidade correta de água é o ponto em que os embriões têm um menisco de água ao seu redor, mas o deslizamento não está flutuando em cima da água fazendo com que os embriões empurrem sob o deslizamento de cobertura. É fundamental monitorar a quantidade de água ao redor dos embriões durante as injeções. Adicione água conforme necessário para manter os embriões úmidos.
3. Adicione a água cuidadosamente, molhando uma escova com água e transferindo a água para a parte de trás do papel do filtro. Adicionar água desta forma permite que a água seja adicionada de forma lenta e controlada para que apenas o suficiente seja adicionado para manter os embriões úmidos. Muita água pode fazer com que os embriões flutuem para fora do alinhamento, dificultando a injeção dos embriões.
4. Misture a injeção de carga na agulha de microinjeção. Adicione aproximadamente 0,5 a 1 μL de mistura de injeção na agulha usando um enchimento de agulha borossilicato desenhado à mão, as pontas de tubulação de carregamento de gel também podem ser usadas. A mistura de injeção é composta de um ou vários RNA guia (80 ng/μL cada) projetado para atingir um lócus específico misturado com proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).
5. Começando com a pressão de injeção a 30 psi, pressione o gatilho de injeção para expulsar o ar da ponta da agulha. Isso forçará a mistura de injeção à ponta da agulha permitindo que a mistura de injeção flua. Neste ponto, aumente lentamente a pressão de espera/constante até que o material de injeção comece a fluir, em seguida, recue a pressão de espera/constante para que ele fique logo abaixo do ponto da mistura de injeção que flui da agulha. O ambiente fechado deve fornecer apenas material de injeção suficiente para que uma pequena quantidade de material possa ser vista para entrar no embrião.
   NOTA: A injeção de embriões de mosca de areia sob óleo de halocarbono semelhante a outros protocolos usados para Drosophila e mosquitos foi inicialmente testada, porém a porcentagem de sobrevivência dessas injeções foi muito baixa. A sobrevivência foi melhorada com a mudança para injeções em papel filtro úmido como descrito acima.
6. Insira a agulha na lateral do embrião. Use o deslizamento atrás do embrião como um backstop que ajudará a agulha a perfurar o embrião. Entregue uma pequena quantidade de mistura de injeção no embrião antes de remover suavemente a agulha.
7. Imediatamente após a remoção da agulha, pressione o injetor para remover qualquer material reabastecado da ponta da agulha. Isso ajudará a evitar que a agulha entupisse.
8. Vá para o próximo embrião. Entre cada injeção, certifique-se de que o papel do filtro está úmido e que a agulha não está entupida.
9. Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, conte o número de embriões injetados para manter uma contagem de execução.
10. Remova a mancha de cobertura adicionando água ao papel do filtro para que a mancha de cobertura flutue. Neste ponto, use uma sonda (vara aplicadora de madeira com pino de inseto colado na ponta) para manter o papel filtro no lugar enquanto um dedo é usado para puxar a tampa para longe dos embriões injetados.
11. Limpe o excesso de água do papel do filtro uma vez que a mancha de cobertura tenha sido removida.

4. Criação pós-injeção (G₀)(Figura 4)

1. Transfira o papel filtro com os embriões em cima de várias camadas de papel filtro úmido colocado em uma placa de Petri para manter a umidade. Mantenha os embriões aqui durante o tempo necessário para injetar outros embriões. Embriões podem ser mantidos por um máximo de 3 horas como este. Após a injeção, eles vão lentamente ficar marrons.
2. Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, transfira manualmente-os para potes de gesso de pequeno porte previamente umedecidos. Não coloque muitos embriões em cada pote e mantenha distância entre eles, para evitar uma possível contaminação fúngica entre os indivíduos. Cubra os potes com uma tela e armazene-os como normalmente seria feito para ovos de colônia de moscas de areia, mantidos em incubadoras a 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.
3. No primeiro dia pós-injeção, remova todos os embriões danificados e mortos com um pincel. Adicione 100 μL de ácido propiônico de 0,5%, gota a gota, nos potes de gesso contendo os embriões injetados para limitar a contaminação fúngica. A liberação de citoplasma de embriões danificados durante o processo de injeção é particularmente favorável ao crescimento fúngico.
4. Verifique os potes de gesso todos os dias e remova os embriões ruins ou mortos. Se o fungo estiver presente, remova todos os embriões infectados e adicione algumas gotas de ácido propiônico de 0,5%.
5. Larvas eclodem entre os dias 8 e 12 pós-injeção. Duas vezes por dia, transfira as larvas recém-emergidas para novos potes de gesso, em grupos de 5-10 no máximo. Adicione uma pequena quantidade de comida e verifique a comida 2-3 vezes por semana.
   1. Monitore cuidadosamente a quantidade de alimentos larvais, pois aumenta muito o risco de contaminação fúngica. Larvas de mosca de areia sobrevivem melhor em grupos, porém podem ser canibais se não houver comida suficiente.
6. Quando as larvas pupar, separe-as por sexo para manter as fêmeas como virgens. Se houver muitos sobreviventes, descarte os machos e mantenha apenas as fêmeas.
   NOTA: Tanto os machos quanto as fêmeas podem carregar e transmitir mutações. No entanto, como as fêmeas têm que ser mantidas virgens antes de serem cruzadas, é mais fácil usar apenas as fêmeas injetadas do G₀ para evitar ter que separar os insetos wt por sexo. Os machos G₀ podem ser mantidos como reforço se o número de sobreviventes adultos for baixo e, neste caso, será acasalado com fêmeas virgens classificadas.

5. Seleção e triagem de alelos mutantes(Figura 5)

1. Cruze em massa as fêmeas G₀ com machos em uma gaiola. Alimenta-os completamente, como seria feito para a manutenção normal da colônia.
2. Um dia, após a alimentação sanguínea, transfira cada fêmea G₀ com machos de 2-3 wt em tubos individuais de gesso usando um aspirador bucal. Alimente as moscas com açúcar em uma pequena bola de algodão trocada todos os dias e use uma seringa de água para garantir que a umidade do gesso seja adequada para a colocação de ovos.
3. Após as fêmeas G₀ colocarem ovos (correspondentes ao G_1),recolher seus corpos em tubos Eppendorf anotados para genotipagem posterior. Mantenha os embriões como normalmente feito para colônias wt.
4. Extrair o DNA das fêmeas G₀ pelo método de escolha.
5. Trie o DNA para a presença de mutações, por exemplo, projetando um ensaio pcr usando primers em torno da região de cortes crocantes esperados.
6. Mantenha apenas os embriões G₁ colocados por fêmeas G₀ mostrando evidências de transformação. Quando esses embriões G₁ se desenvolverem em pupas, separem-nos pelo sexo e mantenham apenas as fêmeas. Cruze as fêmeas G₁ do mesmo sexo feminino G₀ para os machos, alimenta-os com sangue, depois transfira em pequenos grupos de 2-3 fêmeas e 4-5 machos em recipientes de pequeno porte.
   NOTA: Todos os indivíduos do G₁ têm a chance de carregar uma mutação única, portanto, se o número de indivíduos sobreviventes não é muito alto, então é melhor cruzar as fêmeas G₁ individualmente com os machos wt. O caso de várias fêmeas carregando uma mutação diferente presente em um mesmo tubo é raro, mas pode ocorrer. Se esse caso for observado após a genotipagem, as fêmeas progêneras G₂ devem então ser acasaladas individualmente para os machos wt. Este esquema de acasalamento evita a possibilidade de múltiplas mutações na prole.
7. Após a colocação de ovos, colete os corpos femininos G₁ e trie-os para mutações. Mantenha apenas os tubos onde pelo menos uma fêmea mostrou evidência de mutação.
8. Para gerações posteriores fazer um par único em cruzes. Depois da colocação de ovos, pais de tela para a presença de mutação. Repita em cada geração até que ambos os pais sejam homozigosos para a mesma mutação. Uma vez identificados, eles serão os fundadores de um estoque mutante homozigoso.

Resultados

O protocolo de microinjeção CRISPR/Cas9 descrito aqui para gerar mutantes de moscas de areia foi estabelecido em uma publicação anterior⁴. Essa abordagem produziu mutagênese altamente eficiente, já que 11 dos 540 indivíduos sobreviveram ao procedimento, dos quais 9 eram mutantes. Ao projetar guias para mutação CRISPR/Cas9, um primeiro passo crítico é sequenciar a região ao redor da área a ser alvo. O modelo para sequenciamento deve ser da cepa que será usada como fonte de embriões p...

Discussão

Apresentamos aqui um método de microinjeção de embriões recentemente desenvolvido para mutagênese direcionada por CRISPR/Cas9 em moscas de areia Phlebotomus papatasi. A microinjeção de embriões para modificação genética de insetos foi desenvolvida em Drosophila em meados da década de 1980²¹ e agora é usada rotineiramente em uma grande variedade de insetos. Outros métodos para a entrega de materiais de modificação genética foram desenvolvidos para uso em insetos, ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Filter Paper 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
Dissecting Microscope	Any brand		For aligning embryos
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Base layer of the microinjection set up Figure 2A
Insect cage	custom made or several commercial options		polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larval food	custom made		a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Used to back fill microinjection needles
Mouth aspirator	John W. Hock Company	Model 612	mouth aspirator with HEPA filter
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microinjection microscope
Ovipots	Nalge company		ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Paint Brush 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Used for aligning embryos
Propionic acid	Sigma-Aldrich	402907	antifungal agent
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-3	Used for making microinjection needles
Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator	Sutter Instruments		Microinjection Controller and Micromanipulator