Песчаная муха (Phlebotomus papatasi) Микроинъекция эмбрионов для CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Резюме

В этом протоколе подробно известен этап целевого мутагенеза CRISPR/Cas9 у песчаных мух: сбор эмбрионов, инъекция, выращивание насекомых и идентификация, а также выбор мутаций, представляющих интерес.

Аннотация

Песчаные мухи являются естественными переносчиками для видов лейшмании, простейших паразитов, производящих широкий спектр симптомов, начиная от кизанных поражений и до висцеральной патологии. Расшифровка характера взаимодействия вектора/паразита имеет первостепенное значение для лучшего понимания передачи Лейшмании их хозяевам. Среди параметров, контролирующих компетентность переносчика песчаной мухи (т.е. их способность нести и передавать патогенные микроорганизмы), параметры, присущие этим насекомым, были показаны, чтобы играть ключевую роль. Иммунный ответ насекомых, например, влияет на песок летать вектор компетенции Лейшмании. Изучение таких параметров было ограничено отсутствием методов модификации экспрессии генов, адаптированных для использования в этих не модельных организмах. Ген вниз регулирования путем небольшого вмешательства РНК (siRNA) возможно, но в дополнение к технически сложной задачей, замалчивание приводит лишь к частичной потере функции, которые не могут передаваться из поколения в поколение. Целевой мутагенез по технологии CRISPR/Cas9 был недавно адаптирован к песчаной мухе Phlebotomus papatasi. Этот метод приводит к генерации трансмиссивных мутаций в специально выбранном локусе, что позволяет изучать гены, представляющие интерес. Система CRISPR/Cas9 опирается на индукцию целевых двухтяговых разрывов ДНК, которые впоследствии восстанавливаются либо не гомологичным присоединением к концу (NHEJ), либо Homology Driven Repair (HDR). NHEJ состоит из простого закрытия перерыва и часто приводит к небольшим событиям вставки/удаления. В отличие от этого, HDR использует наличие молекулы донорской ДНК обмена гомологии с целевой ДНК в качестве шаблона для ремонта. Здесь мы представляем метод микроинъекции эмбриона песчаной мухи для целевого мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием NHEJ, который является единственным методом модификации генома, адаптированным к векторам песчаной мухи на сегодняшний день.

Введение

Трансмиссивные болезни представляют собой серьезную угрозу общественному здравоохранению в постоянной эволюции. По данным Всемирной организации здравоохранения, сотни видов переносчиков, распространяемых в очень различных филогенных семьях (например, комары, клещи, блохи), являются причиной передачи огромного количества микробных патогенов, что приводит к более чем 700 000 случаев смерти человека в год. Среди переносчиковых насекомых, флеботомин песчаных мух (Diptera, Psychodidae) составляют обширную группу, с 80 проверенных видов переносчиков, проявляли различные фенотипические черты и векторные возможности, найденные в различных географических регионах. Они являются переносчиками простейших паразитов рода Leishmania,вызывая около 1,3 миллиона новых случаев лейшманиозов и от 20 000 до 30 000 смертей в год. Клинические исходы лейшмании разнообразны, с симптомами, начиная от самоограничения кожных поражений висцерального распространения, которое является фатальным в отсутствие лечения.

Песчаные мухи - это строго наземные насекомые. Их жизненный цикл, относительно длинный по сравнению с другими Diptera, длится до трех месяцев, в зависимости от различных параметров, таких как температура, влажность и питание. Она состоит из одной эмбриональной стадии (от 6 до 11 дней), четырех личиновидных стадий (продолжительностью от 23 до 25 дней) и одной стадии детеныша (от 9 до 10 дней), за которой следуют метаморфозы, а затем взрослая жизнь. Песчаные мухи требуют влажной и теплой среды для выращивания. Как самцы, так и самки питаются сахаром, полученным в дикой природе из цветочных нектаров. Только самки кровоохими, так как они требуют белков, полученных из крови еды для производства яиц¹.

Важным направлением исследований является выявление характера взаимодействия переносчика/паразита, которые приводят к развитию трансмиссивных инфекций. Как и в случае с другими переносчиками насекомых, параметры, присущие песчаным мухам, как было показано, влияют на их векторную компетентность, которая определяется как их способность нести и передавать патогенные микроорганизмы своим хозяевам. Например, экспрессия галектинов phlebotomus papatasi песка летать midgut клетки, выступающие в качестве рецепторов, распознающих компоненты поверхности паразита, может непосредственно влиять на их вектор компетентности для Лейшмании основных^2,3. Путь иммунного ответа насекомых, Иммунодефицит (IMD), также имеет решающее значение для Phlebotomus papatasi песка летать вектор компетенции лейшмании основных⁴. Критическая роль для векторных путей иммунного ответа насекомых в контроле их передачи инфекционных патогенов была также зарегистрирована в комарах Aedes aegypti ^5,6,7, в цеце летают Glossina morsitans⁸, и у комаров Anopheles gambiae ^9,10.

Исследования взаимодействия песчаноймухи/Лейшмании были ограничены отсутствием методов модификации экспрессии генов, адаптированных для использования у этих насекомых. Только ген downregulation малым вмешиваясь RNA (siRNA) был выполнен^11,12,13,14 до недавнего времени. Техника, ограниченная смертностью, связанной с микроинъекцией взрослых самок, приводит лишь к частичной потере функции, которая не может передаваться из поколения в поколение.

Технология CRISPR/Cas9 произвела революцию в функциональных геномных исследованиях в не моделных организмах, таких как песчаные мухи. Измененная из адаптивной иммунной системы в прокариотах для защиты от^{бактериофагов 15,16}, система CRISPR Cas9 была быстро адаптирована в качестве инструмента редактирования генома для превосходных эукариотических организмов, включая насекомых. Принцип целевого редактирования генома CRISPR/Cas9 основан на взаимодополняемости одного направляющей РНК (sgRNA) к определенному геномного локуса. Ядро Cas9 связывается с sgRNA и создает двухструновую ДНК (dsDNA) разрыв в геномной ДНК, где sgRNA ассоциируется с его дополнительной последовательности. Комплекс Cas9-sgRNA направляется к целевой последовательности от 17 до 20 дополнительных баз в sgRNA к выбранному локусу, разрыв dsDNA может быть отремонтирован двумя независимыми путями: nonhomologous присоединением конца (NHEJ) или гомологией направленного ремонта (HDR)¹⁷. Ремонт NHEJ включает в себя простое закрытие перерыва, но часто приводит к небольшим событиям вставки/удаления. ДНК ремонт через HDR использует молекулы донорской ДНК обмена гомологии с целевой ДНК в качестве шаблона для ремонта. Насекомые обладают обоими станками.

Технология CRISPR/Cas9 может генерировать мутации в выбранном локусе через путь ремонта NHEJ; или для более сложных стратегий редактирования генома, таких как стук-ины или выражения репортеров, через путь HDR с соответствующим донорским шаблоном. В песчаных мух, нулевой мутант аллели фактора иммунного ответа Relish были созданы через NHEJ-опосредованного CRISPR в Phlebotomus papatasi⁴. Эмбрионы песчаной мухи были также введены в другом исследовании с смесью CRISPR/Cas9, ориентированной на ген, кодирующий желтый. Тем не менее, ни один взрослый проведения мутации были^{произведены 18}. Мы описываем здесь подробный метод песка летать целевых мутагенез NHEJ-опосредованного CRISPR/Cas9, с особым акцентом на микроинъекции эмбриона, критический шаг протокола.

протокол

Использование мышей в качестве источника крови для кормления песчаными мухами осуществлялось в строгом соответствии с рекомендациями, содержащимися в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения (НИЗ). Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными НИАИД, NIH (протокольный номер LPD 68E). Беспозвоночные не охвачены руководящими принципами NIH.

1. Подготовка иглы (Рисунок 1)

1. Потяните иглы и скошен, как описано в Meuti и^{Харрелл 19}. Короче говоря, тянуть иглы на двухступенчатой стеклянной микропайптер шкив, используя borosilicate стеклянные капилляры.
2. Заострите иглы мокрым скошением на микропипетте beveller, используя дополнительный тонкий камень.

2. Сбор эмбрионов и микроманипуляция(рисунок 2)

1. За пять дней до дня инъекции, кровь корма песка летать женщин, как выполняется регулярно для обслуживания колонии. Для получения подробной информации о песках летать колоний воспитания процедур и необходимых материалов, пожалуйста, обратитесь к юристу и др.^{1 Поддержание} насекомых в инкубаторах при 70% влажности и 26 градусов по Цельсию, в течение всего их развития.
   1. Один день после кровопокоивания, захват сытых кровью женщин группами по 100-150 человек в гипсовых горшках с боковым портом. Поддерживайте самок, кормя их сахарным раствором (30% сахарозы – достаточно объема, чтобы впитать небольшой ватный шарик), который является обычным для обслуживания колонии.
2. Днем 2-3 пост-кормления кровью, не смочить гипсовые горшки. Держать самок на сухом субстрате предотвратит преждевременное откладывать яичко, в виду того что женщины предпочитают положить яичка на влажной окружающей среде.
3. На 5-й день после кровопоколения выполняют сбор эмбрионов, микроманипуляцию и микроинъекцию. Ввемит влажную фильтровальную бумагу в камеру для яйцекладки. Свежеположенные эмбрионы не имеют полностью развитого хориона и выглядят белыми. Используйте черную фильтровальную бумагу во время процедуры для облегчения визуализации белых эмбрионов.
4. Перенесите небольшую группу самок из гипсового горшка в камеру для яйцекладки через боковые порты с помощью аспиратора рта. Наличие влажного субстрата (фильтровальной бумаги) побуждает самок к овипозиту.
5. После 30-60 мин, тщательно извлечения фильтровальной бумаги с недавно заложенных эмбрионов из камеры. Храните фильтровальную бумагу и эмбрионы в чашке Петри до 3 часов. В течение этого времени, регулярно оценить уровень влажности фильтровальной бумаги, чтобы убедиться, что он остается влажным. За это время повторите шаги от 2,4 до 2,6 с новыми группами самок и соберите как можно больше эмбрионов.
6. Подготовьте микроскоп слайды для инъекции: вручную собирать яйца один за другим с очень тонкой кистью и тщательно перенести их на другой кусок влажной черной фильтровальной бумаги, помещенной на слайд микроскопа увенчанный стеклянной крышкой.
   1. Добавить воду в фильтровальную бумагу, достаточно, чтобы сохранить эмбрионы влажными, но не заставляя их уплывать от крышки или всасывается под крышкой. Выстроить эмбрионы против крышки. Крышки действует как backstop предотвращая яичка от свертывать прочь во время впрыски.

3. Инъекции эмбрионов(рисунок 3)

1. Начало инъекций от 2,5 до 3 часов после начала сбора яиц. Выполняйте инъекции при комнатной температуре и влажности лаборатории окружающей среды.
2. Убедитесь, что выровненные эмбрионы имеют достаточно воды, чтобы они были влажными.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно, чтобы эмбрионы были влажными во время инъекций. Если они не влажные во время процесса инъекции, инъекции становятся трудными, потому что игла имеет проблемы пирсинг эмбриона. Правильное количество воды является точкой, в которой эмбрионы имеют мениска воды вокруг них, но coverslip не плавает на верхней части воды в результате чего эмбрионы толкать под крышкой. Очень важно контролировать количество воды вокруг эмбрионов во время инъекций. Добавить воду по мере необходимости, чтобы сохранить эмбрионы влажными.
3. Добавить воду тщательно, смачивая кисть с водой и передачи воды на задний конец фильтровальной бумаги. Добавление воды таким образом позволяет добавить воду в медленной и контролируемой моды, так что достаточно добавляется, чтобы сохранить эмбрионы влажными. Слишком много воды может привести к тому, что эмбрионы выплывут из выравнивания, что затрудняет введение эмбрионов.
4. Задняя инъекция нагрузки смешивается с микроинъекции иглы. Добавить примерно от 0,5 до 1 йл инъекционной смеси в иглу с помощью нарисованного вручную боросиликата иглы наполнителя, гель загрузки пипетки советы также могут быть использованы. Смесь инъекций состоит из одной или нескольких направляющих РНК (80 нг/л каждая), предназначенных для целевой конкретной локус, смешанной с коммерческим рекомбинантным белком Cas9 (300 нг/Л).
5. Начиная с давления инъекции на 30 пси, нажмите на спусковой крючок инъекции, чтобы изгнать воздух из кончика иглы. Это заставит инъекционные смеси на кончик иглы позволяет инъекции смеси течь. В этот момент, медленно увеличить удержание / постоянное давление, пока инъекционный материал начинает течь, а затем отступить от удержания / постоянное давление, так что это чуть ниже точки инъекции смесь течет из иглы. Закрытые настройки должны доставить достаточное количество инъекционного материала, так что небольшое количество материала можно увидеть, чтобы войти в эмбрион.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекции эмбрионов песчаной мухи под галоуглеродным маслом, аналогичные другим протоколам, используемым для Дрозофилы и комаров, были первоначально протестированы, однако процент выживаемости для этих инъекций был очень низким. Выживание было улучшено путем перехода на инъекции на влажной фильтровальной бумаге, как описано выше.
6. Вставьте иглу в сторону эмбриона. Используйте крышку позади эмбриона в качестве backstop, который поможет игле проколоть эмбрион. Доставите небольшое количество инъекций смеси в эмбрион, прежде чем аккуратно удалить иглу.
7. Сразу же после удаления иглы, нажмите инжектор, чтобы удалить любой заполненный материал из кончика иглы. Это поможет предотвратить засорение иглы.
8. Перейти к следующему эмбриону. Между каждой инъекцией убедитесь, что фильтровальную бумагу влажная и игла не засоряется.
9. После того, как все эмбрионы были введены, подсчитайте количество инъекционных эмбрионов, чтобы сохранить работает подсчет.
10. Удалите крышку, добавив воду в фильтровальную бумагу, чтобы обложка плавает. На данный момент, используйте зонд (деревянный аппликатор палку с насекомыми контактный приклеены к кончику), чтобы держать фильтровальную бумагу на месте в то время как палец используется, чтобы вытащить крышку от вводили эмбрионов.
11. Пятно от избыточной воды из фильтровальной бумаги, как только крышки были удалены.

4. После инъекционного воспитания (G₀) (Рисунок 4)

1. Перенесите фильтровальную бумагу с эмбрионами поверх нескольких слоев влажной фильтровальной бумаги, помещенной в чашку Петри для поддержания влажности. Храните эмбрионы здесь в течение времени, необходимого для введения других эмбрионов. Эмбрионы могут быть проведены в течение максимум 3 часов, как это. После инъекции они будут медленно коричневеть.
2. После того, как все эмбрионы были введены, вручную перенести их на ранее увлажненной небольшой размер гипсовых горшков. Не поставить слишком много эмбрионов в каждый горшок и поддерживать расстояние между ними, чтобы избежать возможного грибкового загрязнения между людьми. Обложка горшки с экраном и хранить их, как это обычно делается для песка летать колонии яйца, поддерживается в инкубаторах при 70% влажности и 26 градусов по Цельсию, в течение всего их развития.
3. На 1-й день после инъекции удалите все поврежденные и мертвые эмбрионы с помощью кисти. Добавьте 100 йл 0,5% пропионовой кислоты, капля за каплей, на гипсовые горшки, содержащие инъекционные эмбрионы, чтобы ограничить грибковое загрязнение. Высвобождение цитоплазмы из эмбрионов, поврежденных в процессе инъекций, особенно благоприятно для грибкового роста.
4. Проверьте гипсовые горшки каждый день и удалить любые плохие или мертвые эмбрионы. Если грибок присутствует, удалить все инфицированные эмбрионы и добавить несколько капель 0,5% пропионовой кислоты.
5. Larvae люк между 8 и 12 день после инъекции. Дважды в день перенесите вновь возникшие личинки на новые гипсовые горшки, по группам максимум 5-10. Добавить небольшое количество пищи и проверить пищу 2-3 раза в неделю.
   1. Тщательно следите за количеством личинок пищи, так как слишком сильно повышается риск грибкового загрязнения. Личинки песчаной мухи выживают лучше в группах, однако они могут быть людоедскими, если не хватает пищи.
6. Когда личинки окукливаются, отделить их по полу, чтобы сохранить самок, как девственницы. Если есть много выживших, отказаться от мужчин и держать только женщин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как мужчины, так и женщины могут нести и передавать мутации. Однако, как женщины должны быть сохранены девственницы, прежде чем они должны быть пересечены, легче использовать только G_{0 вводили} женщин, чтобы избежать необходимости отдельных WT насекомых по полу. G_{0 мужчины} могут быть сохранены в качестве резервного копирования, если число взрослых выживших является низким и в этом случае будет в спаривание с отсортированы WT девственных женщин.

5. Отбор и скрининг мутантных аллелей(рисунок 5)

1. Масс-кросс G_{0 женщин} с WT мужчин в клетке. Кровь кормить их в целом, как это было бы сделано для нормального содержания колонии.
2. Один день после кормления крови, передача каждой G_{0 женщины с} 2-3 WT мужчин в отдельных гипсовых трубок с помощью аспиратора рта. Кормите мух с сахаром на небольшой ватный шарик изменился каждый день и использовать шприц воды для обеспечения штукатурки влаги подходит для яйцекладки.
3. После G_{0 женщины} отложили яйца (соответствующие G₁), собирать их тела в отдельных, аннотированных Эппендорф труб для более поздних генотипирования. Поддерживайте эмбрионы, как это обычно делается для колоний WT.
4. Извлекайте ДНК у самок G₀ методом выбора.
5. Скрининг ДНК на наличие мутаций, например, путем разработки ПЦР-анализа с использованием грунтовок, окружающих область ожидаемых сокращений CRISPR.
6. Храните только G_{1 эмбрионов,} заложенных G_{0 женщин,} показывающих доказательства трансформации. Когда эти G_{1 эмбрионы} развиваются в куколки, отделить их по полу и держать только женщин. Пересеки G_{1 женщин} от той же самки G₀ до wt мужчин, кровоохохимими, а затем перенесите небольшими группами по 2-3 самки и 4-5 самцов в контейнеры небольшого размера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все G_{1 лица} имеют возможность нести уникальную мутацию, так что если число выживших лиц не слишком высока, то лучше пересечь G₁ женщин индивидуально с WT мужчин. Случай нескольких женщин, несущих различные мутации присутствует в той же трубке редко, но может произойти. Если такой случай наблюдается после генотипирования, G_{2 потомство} женщины должны быть спариваются индивидуально WT мужчин. Эта схема спаривания позволяет избежать возможности множественных мутаций в потомствах.
7. После яйцекладки, собирать G_{1 женских} тел и экран их для мутаций. Храните только трубки, где по крайней мере одна женщина показала признаки мутации.
8. Для последующих поколений делают одну пару в крестах. После яйцекладки, экран родителей на наличие мутации. Повторяйте на каждом поколении до тех пор пока оба родителя не будут homozygous для такой же перегласовки. После того, как определены, они будут основателями гомозиготных мутантов фонда.

Результаты

Протокол микроинъекции CRISPR/Cas9, описанный здесь для генерации мутантов песчаной мухи, был установлен в предыдущей публикации⁴. Этот подход произвел высокоэффективный мутагенез, так как 11 из 540 человек пережили процедуру, из которых 9 были мутантами. При разработке руководст?...

Обсуждение

Мы представляем здесь недавно разработанный метод микроинъекции эмбриона для целевого мутагенеза CRISPR/Cas9 у песчаных мух Phlebotomus papatasi. Микроинъекция эмбрионов для генетической модификации насекомых была разработана в Дрозофиле в середине 1980-х^{годов 21 и} в настоящее врем?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Filter Paper 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
Dissecting Microscope	Any brand		For aligning embryos
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Base layer of the microinjection set up Figure 2A
Insect cage	custom made or several commercial options		polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larval food	custom made		a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Used to back fill microinjection needles
Mouth aspirator	John W. Hock Company	Model 612	mouth aspirator with HEPA filter
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microinjection microscope
Ovipots	Nalge company		ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Paint Brush 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Used for aligning embryos
Propionic acid	Sigma-Aldrich	402907	antifungal agent
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-3	Used for making microinjection needles
Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator	Sutter Instruments		Microinjection Controller and Micromanipulator