CRISPR/Cas9突然変異誘発のためのサンドフライ(フレボトムスパパタシ)胚微小注射

要約

このプロトコルは、胚の採取、注射、昆虫飼育、同定、および目的の突然変異の選択など、砂ハエにおけるCRISPR/Cas9標的突然変異のステップを詳述する。

要約

サンドハエは リーシュマニア 種の自然ベクターであり、原虫寄生虫は皮病変から内臓病理に至るまで幅広い症状を生み出す。ベクター/寄生虫相互作用の性質を解読することは、 リーシュマニア の宿主への伝達をよりよく理解するために重要である。砂飛ぶベクトル能力を制御するパラメータ(すなわち、病原体を運び、伝達する能力)の中で、これらの昆虫に固有のパラメータが重要な役割を果たすることが示された。昆虫免疫応答は、例えば、 リーシュマニアに対するサンドフライベクター能力に影響を与える。このようなパラメータの研究は、これらの非モデル生物での使用に適応した遺伝子発現修飾の方法の欠如によって制限されている。小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションは可能ですが、技術的に困難であることに加えて、サイレンシングは機能の部分的な損失をもたらし、世代から世代へと伝えることはできません。CRISPR/Cas9技術による標的突然変異誘発は、最近 、フレボトムスパパタシ サンドフライに適応した。この技術は、特異的に選択された遺伝子座における転化可能な突然変異の生成につながり、目的の遺伝子を研究することを可能にする。CRISPR/Cas9システムは、後に非相同エンドジョイングレンス(NHEJ)または相同性駆動修復(HDR)のいずれかによって修復されたターゲット二本鎖DNA切断の誘導に依存しています。NHEJは、休憩の単純なクロージャで構成され、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながります。対照的に、HDRは、標的DNAと相同性を共有するドナーDNA分子の存在を修復のテンプレートとして使用する。ここでは、これまでにサンドフライベクターに適応した唯一のゲノム修飾技術であるNHEJを用いたCRISPR/Cas9による標的変異誘発に対するサンドフライ胚微小注入法を提示する。

概要

ベクター媒介性疾患は、絶え間ない進化における公衆衛生上の大きな脅威です。世界保健機関(WHO)によると、非常に異なる系統形成家族(蚊、ダニ、ノミなど)に広がる何百ものベクター種が膨大な数の微生物病原体の伝染を引き起こし、その結果、年間70万人以上の人が死亡する。ベクター昆虫の中で、フレボトミン砂ハエ(ディプテラ、サイコディダエ)は広大な群を構成し、80種の実証済みベクター種が異なる地理的領域で見られる明確な現象学的形質およびベクター能力を示す。彼らは リーシュマニア属の原虫寄生虫のベクターであり、リーシュマニアーゼの約130万人の新しい症例を引き起こし、年間約20,000〜30,000人の死亡を引き起こす。リーシュマニアーゼ臨床転帰は多様であり、自己制限的な皮病変から治療がない場合には致命的な内臓播種に至るまで症状が広がる。

砂のハエは厳密に地上の昆虫です。他のディプテラと比較して比較的長いライフサイクルは、温度、湿度、栄養などの異なるパラメータに応じて、最大3ヶ月間続きます。それは1つの胚段階(6〜11日)、4つの幼虫段階(合計23〜25日間持続する)と1つのプパル段階(9〜10日)とそれに続く変態と成人から構成される。砂のハエは飼育のために湿気と暖かい環境を必要とします。オスもメスも、花の蜜から野生で得られる糖を食べる。卵の生産^のために血液の食事から得られるタンパク質を必要とするので、女性だけが血液供給剤である。

研究の重要な焦点は、伝染性感染症の発症につながるベクター/寄生虫相互作用の性質を特定することです。他のベクター昆虫と同様に、砂ハエに固有のパラメータは、病原体を宿主に運び、伝染する能力として定義されるベクター能力に影響を与えることを示している。例えば、フレボトムス・パパタシサンドフライミドグ細胞によるガレクチンの発現は、寄生虫表面成分を認識する受容体として作用し、リーシュマニアメジャー^2,3に対するそれらのベクター能力に直接影響を及ぼすことができる。昆虫免疫応答経路は、免疫不全(IMD)、リーシュマニアメジャー⁴のフレボトムスパパタシサンドフライベクター能力にも極めて重要である。感染性病原体の伝染を制御するベクター昆虫免疫応答経路の重要な役割は、Aedes aegypti蚊^5、6、7、ツェツェフライグロッシナ・モルシタン^ス8、アノフェレスガンビア蚊^9、10でも同様に報告されている。

サンドフライ/リーシュマニア相互作用の研究は、これらの昆虫での使用に適応した遺伝子発現修飾法の欠如によって制限されている。最近まで^{11、12、13、14}の小さな干渉RNA(siRNA)による遺伝子のダウンレギュレーションのみが行われていた。この技術は、成人女性の微小注射に関連する死亡率によって制限され、機能の部分的な喪失しか起こらず、世代から世代へと伝達することができない。

CRISPR/Cas9技術は、砂ハエなどの非モデル生物の機能ゲノム研究に革命をもたらしています。バクテリオファージ^15、16に対する防御のために原核生物中の適応免疫系から改変され、CRISPR Cas9システムは昆虫を含む優れた真核生物のゲノム編集ツールとして急速に適応されている。CRISPR/Cas9の標的ゲノム編集の原理は、特定のゲノム遺伝子座に対する単一ガイドRNA(sgRNA)の相補性に基づいています。Cas9ヌクレアーゼはsgRNAに結合し、sgRNAがその相補配列に関連するゲノムDNAに二本鎖DNA(dsDNA)破断を生み出します。Cas9-sgRNA複合体は、sgRNA中の17〜20の相補塩基によって標的配列に導かれ、dsDNAブレークは、次いで2つの独立した経路によって修復することができる:非相同端接合(NHEJ)または相同性指向修復^(HDR)17。NHEJの修復は、休憩の単純な閉鎖を伴うが、頻繁に小さな挿入/削除イベントにつながる。HDRによるDNA修復は、ドナーDNA分子共有相同性を標的DNAとの間で修復用のテンプレートとして使用します。昆虫は両方の機械を持っています。

CRISPR/Cas9技術は、NHEJ修復経路を介して、選択された遺伝子座に突然変異を生成することができます。または、適切なドナーテンプレートを使用してHDR経路を介して、ノックインや発現レポーターなどのより複雑なゲノム編集戦略のために。サンドハエでは、免疫応答因子Relishの ヌル 変異対立体が 、フレボトムス・パパタシ⁴においてNHEJ媒介CRISPRを介して生成された。サンドフライ胚はまた、黄色をコードする遺伝子を標的とするCRISPR/Cas9ミックスを用いた別の研究で注射された。それでも、突然変異を運ぶ成人は¹⁸を産生しなかった。ここでは、NHEJ媒介CRISPR/Cas9による砂飛球標的突然変異誘発の詳細な方法について説明し、特にプロトコルの重要なステップである胚微小注射に焦点を当てる。

プロトコル

砂のフライの供給のための血液源としてマウスを使用するは、国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと使用のためのガイドの勧告に従って厳格に行われました。このプロトコルは、NIAID NIH(プロトコル番号LPD 68E)の動物管理および使用委員会によって承認されました。無脊椎動物はNIHガイドラインの対象とはなりません。

1. 針の準備 (図 1)

1. ムーティとハレル¹⁹に記載されているように針とベベルを引っ張ります。簡単に言えば、二段ガラスのマイクロピペットの引き手に針を引っ張り、ホウケイ酸ガラスの毛細血管を使用する。
2. 余分な細かい石を使用して、マイクロピペットベベラーに濡れたベベルで針を研ぎます。

2. 胚の収集とマイクロマニピュレーション (図 2)

1. 注射日の5日前に、血中の砂はコロニー維持のために日常的に行われるように雌を飛ばす。サンドフライコロニーの飼育手順および必要な材料については、Lawyerら.1インキュベーターの昆虫を湿度70%、26°Cで全開発中^{に維持する} 方法をご覧ください。
   1. ある日、血液を摂食後、サイドポート付きの石膏ポットで100-150のグループによって血液供給された女性を捕獲する。コロニーのメンテナンスのために通常、糖溶液(30%スクロース - 小さな綿のボールを浸すのに十分な量)でそれらを供給することによって、女性を維持します。
2. 2-3日目の送血後は、石膏ポットを湿らせないでください。乾燥した基材にメスを保つことは、女性が湿った環境で卵を産むことを好むので、早期産を防ぎます。
3. 5日目の送食後に、胚の採取、微小改分、および微小注射を行う。産卵室に湿ったろ紙を導入します。寝たての胚は完全に発達した絨毛を持たず、白く見える。白い胚の視覚化を容易にするために手順の間に黒いろ紙を使用してください。
4. 口の吸引器を使用してサイドポートを介して産卵室に石膏ポットから女性の小さなグループを転送します。湿った基質(ろ紙)の存在は、オビポジットに女性を誘導する。
5. 30〜60分後、チャンバーから新しく敷設された胚で濾紙を慎重に取り出します。濾紙と胚をペトリ皿に3時間まで保管します。この間、定期的にフィルターペーパーの水分レベルを評価して、湿った状態を保つようにします。この間、女性の新しいグループでステップ2.4〜2.6を繰り返し、できるだけ多くの胚を収集します。
6. 注入のための顕微鏡のスライドを準備する:手動で非常に細かい絵筆で卵を一つずつ収集し、慎重にガラスカバースリップをトッピング顕微鏡スライドに置かれた湿った黒いフィルター紙の別の部分にそれらを転送します。
   1. 濾紙に水を加え、胚を湿らせたままにするのに十分ですが、カバースリップから離れたり、カバースリップの下に吸い込まれたりしないようにします。カバースリップに対して胚を並べる。カバースリップは、注射中に卵が転がり落ちるのを防ぐバックストップとして機能します。

3. 胚注射 (図 3)

1. 卵の収集開始後2.5〜3時間の注射を開始します。室温および周囲の実験室の湿気で注入を行う。
2. 整列した胚が湿った状態に保たられるように十分な水を持っていることを確認してください。
   注:注射中に胚を湿らせておくのが重要です。注射工程で湿っていないと、注射は、針が胚を突き刺すのに問題があるため困難になる。正しい量の水は、胚が周囲に半月板の水を持っている点ですが、カバースリップは水の上に浮かばず、胚がカバースリップの下に押し込みます。注射中に胚の周りの水の量を監視することが重要です。必要に応じて水を加え、胚を湿らせた状態に保ちます。
3. ブラシを水で濡らし、濾紙の裏端に水を移して、慎重に水を加えます。この方法で水を追加すると、ゆっくりと制御された方法で水を追加できるため、胚を湿らせ続けるのに十分な量が追加されます。水が多すぎると胚が整列して浮き出てしまい、胚を注入するのが難しくなる。
4. バックロード注入はマイクロインジェクション針に混入する。手描きのホウケイ酸ニードルフィラーを使用して、約0.5〜1μLの注射ミックスを針に加え、ゲルローディングピペットチップも使用できます。この注入ミックスは、市販の組換えCas9タンパク質(300 ng/μL)と混合した特定の遺伝子座を標的にするように設計された1つまたは複数のガイドRNA(それぞれ80 ng/μL)で構成されています。
5. 射出圧力を30 psiから始め、注射トリガを押して針の先端から空気を排出します。これにより、注射ミックスが流れるよう注射の針先に強制的にします。この時点で、注入材料が流れ始めるまでホールド/定圧をゆっくりと上げ、針から流れる注入ミックスのポイントのすぐ下になるようにホールド/定圧を下げます。ゲート設定は、少量の材料が胚に入るのを見ることができるように、十分な注入材料を提供する必要があります。
   注: ショウジョウバエ や蚊に使用される他のプロトコルと同様のハロカーボンオイルの下での砂フライ胚の注入は、最初はテストされましたが、これらの注射の生存率は非常に低かった。上記のように湿った濾紙上の注射に切り替えることによって生存率が向上した。
6. 胚の側面に針を挿入します。胚を突き刺すために針を助けるバックストップとして胚の後ろのカバースリップを使用してください。針を穏やかに取り除く前に、少量の注射ミックスを胚に送り込みます。
7. 針を取り外した直後に、注射器を押して、針先から詰め戻り材料を取り除きます。これは、針が詰まるのを防ぐのに役立ちます。
8. 次の胚に進みます。各注射の間に、濾紙が湿っていて、針が詰まっていることを確認してください。
9. すべての胚が注入されたら、注入された胚の数を数え、ランニング集計を維持します。
10. カバースリップが浮くように濾紙に水を加えてカバースリップを取り外します。この時点で、プローブ(昆虫のピンを先端に接着した木製アプリケータースティック)を使用してフィルターペーパーを所定の位置に保持し、指を使用して注入された胚からカバースリップを引き離します。
11. カバースリップが取り除かれたら、濾紙から余分な水を消します。

4. 射出後の飼育 (G₀₎(図 4)

1. 湿った濾紙のいくつかの層の上に胚を入れた濾紙をペトリ皿に入れ、湿度を維持します。他の胚を注入するために必要な時間の間、胚をここに保管してください。胚は、このような最大3時間保持することができる。注射後、彼らはゆっくりと茶色になります。
2. すべての胚が注入されたら、手動で以前に湿らせた小さなサイズの石膏ポットに移します。各ポットにあまりにも多くの胚を入れて、それらの間の距離を維持しないでください, 個人間の可能な真菌汚染を避けるために.鍋をスクリーンで覆い、開発全体の間に湿度70%と26°Cのインキュベーターに維持されるサンドフライコロニーの卵のために通常行われるようにそれらを保存します。
3. 1日目の注射後、損傷した胚と死んだ胚をすべてペイントブラシで取り除きます。0.5%プロピオン酸の100 μLを加えて、注入された胚を含む石膏ポットに滴下して、真菌汚染を制限します。注射プロセス中に損傷を受けた胚からの細胞質の放出は、真菌の成長に特に有利である。
4. 毎日石膏ポットをチェックし、悪いまたは死んだ胚を削除します。真菌が存在する場合は、感染したすべての胚を除去し、0.5%プロピオン酸の数滴を追加します。
5. 8日目から12日目の注射後の幼虫ハッチ。1日2回、新たに出現した幼虫を5〜10のグループで新しい石膏ポットに移します。少量の食べ物を加え、週に2〜3回食べ物をチェックしてください。
   1. 幼虫の食物の量を注意深く監視し、真菌汚染のリスクを大きく高めます。サンドフライ幼虫は、十分な食べ物がない場合、彼らはカニバリズムすることができますが、グループでより良い生き残ることができます。
6. 幼虫が子犬になると、女性を処女として維持するためにセックスでそれらを分離します。生存者が多い場合は、男性を捨て、メスだけを飼います。
   注:男性と女性の両方が突然変異を運ぶことができ、送信することができます。しかし、メスは渡る前に処女を保たれなければならないので、セックスによってwt昆虫を分離することを避けるためにG₀ 注入された女性だけを使用する方が簡単です。成人の生存者の数が少なく、この場合、ソートされたwt処女女性と交配される場合、G₀ の男性はバックアップとして保持することができます。

5. 変異型対立体の選択とスクリーニング (図5)

1. ケージ内のwt雄を持つ_G0 メスをマスクロスする。通常のコロニーの維持のために行われるように、それらを完全に供給する血液。
2. 1日は、授乳後、口の吸引器を使用して個々の石膏チューブに個々の石膏チューブに2〜3重量の男性と各G₀ メスを転送します。毎日変わった小さな綿のボールに砂糖でハエを養い、石膏の水分が産卵に適していることを確認するために水の注射器を使用しています。
3. G₀ メスが卵を産んだ後_(G1に対応)、後のジェノタイピングのために個々の、アノゲートされたエペンドルフチューブに体を集める。通常のwtコロニーに対して行われるように胚を維持する。
4. 選択した方法により_G0 メスからDNAを抽出する。
5. 例えばCRISPRカットの予想領域を取り巻くプライマーを用いたPCRアッセイを設計することにより、変異の存在を求めてDNAをスクリーニングする。
6. 変容の証拠を示す_G0メスによって敷設された_G1胚のみを保管する。これらの_G1胚が子犬に発達する場合は、性別によってそれらを分離し、メスだけを保つ。同じG₀メスからwtの男性に_G1メスを渡り、それらを血液中に供給し、2〜3人の女性と4〜5人の男性の小グループで小さなサイズの容器に移します。
   注:すべてのG₁ 個体はユニークな突然変異を運ぶ機会があるので、生き残った個体の数が高すぎない場合は_、G1 メスをwt男性と個別に横断する方が良いです。同じチューブに異なる突然変異を運ぶ複数の雌の場合はまれであるが、発生する可能性があります。このような場合、ジェノタイピング後に観察された場合_、G2 子孫の女性は、wt雄に個別に交配する必要があります。この交配スキームは、子孫における複数の突然変異の可能性を回避する。
7. 産卵後_、G1 メスの体を収集し、突然変異のためにそれらをスクリーニングします。少なくとも1人の女性が突然変異の証拠を示した管だけを保管してください。
8. 後の世代のために単一のペアをクロスします。産卵後、両親が突然変異の存在をスクリーニングする。両親が同じ突然変異のためにホモ接合体になるまで、各世代で繰り返します。一度特定されると、彼らはホモ接合突然変異株の創設者になります。

結果

ここで説明したCRISPR/Cas9マイクロインジェクションプロトコルは、前の出版物4で確立された前の出版物で確立されたサンドフライ変異体を生成する^。このアプローチは、540人の個体のうち11人がこの処置を生き延び、そのうち9人が突然変異体であったため、非常に効率的な突然変異誘発を生じさせた。CRISPR/Cas9突然変異のガイドを設計する際、重要な最初のステップは、標?...

ディスカッション

ここでは、フレボトムスパパタシサンドハエでCRISPR/Cas9による標的性変異誘発のための最近開発された胚微小注射法を紹介する。昆虫遺伝子改変のための胚微小注射は、1980^年代半ばにショウジョウバエで開発され、現在では多種多様な昆虫に日常的に使用されています。遺伝子組み換え物質の送達のための他の方法は、例えばReMOT^{20、21、22...}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Filter Paper 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
Dissecting Microscope	Any brand		For aligning embryos
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Base layer of the microinjection set up Figure 2A
Insect cage	custom made or several commercial options		polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larval food	custom made		a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Used to back fill microinjection needles
Mouth aspirator	John W. Hock Company	Model 612	mouth aspirator with HEPA filter
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microinjection microscope
Ovipots	Nalge company		ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Paint Brush 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Used for aligning embryos
Propionic acid	Sigma-Aldrich	402907	antifungal agent
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-3	Used for making microinjection needles
Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator	Sutter Instruments		Microinjection Controller and Micromanipulator