Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjection embryonnaire pour CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Résumé

Ce protocole détaille les étapes de la mutagenèse ciblée CRISPR/Cas9 chez les mouches du sable : collecte d’embryons, injection, élevage et identification d’insectes ainsi que sélection de mutations d’intérêt.

Résumé

Les mouches du sable sont les vecteurs naturels des espèces de Leishmania, les parasites protozoaires produisant un large éventail de symptômes allant des lésions cutanées à la pathologie viscérale. Le décryptage de la nature des interactions vecteurs/parasites est d’une importance primordiale pour une meilleure compréhension de la transmission de la leishmaniose à leurs hôtes. Parmi les paramètres contrôlant la compétence des vecteurs de mouches du sable (c’est-à-dire leur capacité à transporter et à transmettre des agents pathogènes), il a été démontré que les paramètres intrinsèques à ces insectes jouent un rôle clé. La réponse immunitaire des insectes, par exemple, influe sur la compétence des vecteurs de mouches de sable à Leishmania. L’étude de ces paramètres a été limitée par l’absence de méthodes de modification de l’expression génétique adaptées à l’utilisation dans ces organismes non modèles. La downregulation des gènes par petit ARN interférant (SIRNA) est possible, mais en plus d’être techniquement difficile, le silence ne conduit qu’à une perte partielle de fonction, qui ne peut pas être transmise de génération en génération. La mutagenèse ciblée par la technologie CRISPR/Cas9 a récemment été adaptée à la mouche du sable phlebotomus papatasi. Cette technique conduit à la génération de mutations transmissibles dans un locus spécifiquement choisi, permettant d’étudier les gènes d’intérêt. Le système CRISPR/Cas9 repose sur l’induction de ruptures ciblées d’ADN à double brin, réparées plus tard soit par jointage final non homologue (NHEJ) soit par Homology Driven Repair (HDR). NHEJ se compose d’une simple fermeture de la rupture et conduit fréquemment à de petits événements d’insertion / suppression. En revanche, HDR utilise la présence d’une molécule d’ADN donneur partageant l’homologie avec l’ADN cible comme modèle de réparation. Ici, nous présentons une méthode de microinjection embryon de mouche du sable pour la mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9 à l’aide de NHEJ, qui est la seule technique de modification du génome adaptée aux vecteurs de mouches de sable à ce jour.

Introduction

Les maladies à transmission vectorielle sont une menace majeure pour la santé publique en constante évolution. Des centaines d’espèces vectorielles réparties dans des familles phylogéniques très distinctes (moustiques, tiques, puces) sont responsables de la transmission d’un grand nombre d’agents pathogènes microbiens, entraînant plus de 700 000 décès humains par an, selon l’Organisation mondiale de la santé. Parmi les insectes vecteurs, les mouches phlébotomines de sable (Diptera, Psychodidae) constituent un vaste groupe, avec 80 espèces vectorielles éprouvées présentant des traits phénotypiques distincts et des capacités vectorielles que l’on trouve dans différentes régions géographiques. Ils sont des vecteurs pour les parasites protozoaires du genre Leishmania,causant environ 1,3 million de nouveaux cas de Leishmaniose et entre 20.000 et 30.000 décès par an. Les résultats cliniques de Leishmaniases sont divers, avec des symptômes s’étendant des lésions cutanées auto-limitantes à la diffusion viscérale qui est mortelle en l’absence de traitement.

Les mouches du sable sont des insectes strictement terrestres. Leur cycle de vie, relativement long par rapport à d’autres Diptéra, dure jusqu’à trois mois, selon différents paramètres tels que la température, l’humidité et la nutrition. Il se compose d’un stade embryonnaire (6 à 11 jours), de quatre stades larvaux (d’une durée totale de 23 à 25 jours) et d’un stade pupal (9 à 10 jours) suivi de métamorphose, puis d’âge adulte. Les mouches de sable ont besoin d’un environnement humide et chaud pour l’élevage. Les mâles et les femelles se nourrissent de sucres, obtenus à l’état sauvage à partir de nectars floraux. Seules les femelles sont des mangeurs de sang, car elles ont besoin de protéines obtenues à partir de la farine de sang pour la production^{d’œufs 1}.

L’un des objectifs importants de la recherche est d’identifier la nature des interactions vecteurs/parasites qui mènent au développement d’infections transmissibles. Comme pour les autres insectes vecteurs, il a été démontré que les paramètres intrinsèques aux mouches du sable ont un impact sur leur compétence vectorielle, qui est définie comme leur capacité à transporter et à transmettre des agents pathogènes à leurs hôtes. Par exemple, l’expression des galectines par les cellules de midgut de mouche de sable de Phlebotomus papatasi, agissant comme récepteurs reconnaissant des composants parasites de surface, peut influencer directement leur compétence vectorielle pour Leishmania major^2,3. La voie de réponse immunitaire d’insecte, insuffisance immunisée (IMD), est également cruciale pour la compétence de vecteur de mouche de sable de Phlebotomus papatasi pour le major de Leishmania^4. Un rôle critique pour les voies de réponse immunitaire des insectes vecteurs dans le contrôle de leur transmission d’agents pathogènes infectieux a également été signalé chez les moustiques Aedes aegypti ^5,6,7, dans la mouche tsé-tsé Glossina morsitans⁸, et chez les moustiques Anopheles gambiae ^9,10.

Les études sur les interactions mouches dusable/leishmaniose ont été limitées par l’absence de méthodes de modification de l’expression génétique adaptées pour être utilisées chez ces insectes. Seule la downregulation des gènes par petit ARN interférant (siRNA) avait été^{effectuée 11,12,13,14 jusqu’à} récemment. La technique, limitée par la mortalité associée à la microinjection des femelles adultes, ne conduit qu’à une perte partielle de fonction, qui ne peut se transmettre de génération en génération.

La technologie CRISPR/Cas9 a révolutionné la recherche génomique fonctionnelle dans des organismes non modèles tels que les mouches du sable. Modifié à partir du système immunitaire adaptatif chez les procaryotes pour la défense contre les bactériophages^15,16, le système CRISPR Cas9 a été rapidement adapté comme un outil d’édition du génome pour les organismes eucaryotes supérieurs, y compris les insectes. Le principe de l’édition ciblée du génome CRISPR/Cas9 est basé sur la complémentarité d’un ARN guide unique (SGRNA) à un locus génomique spécifique. La nucléase Cas9 se lie à l’ARN sg et crée une rupture d’ADN à double brin (DSDNA) dans l’ADN génomique où le sgRNA s’associe à sa séquence complémentaire. Le complexe Cas9-sgRNA est guidé vers la séquence cible par 17 à 20 bases complémentaires dans le sgRNA au locus choisi, la rupture dsDNA peut alors être réparée par deux voies indépendantes : l’assemblage final non homologique (NHEJ) ou la réparation dirigée par homologie (HDR)¹⁷. La réparation de NHEJ implique une simple fermeture de la rupture mais mène fréquemment à de petits événements d’insertion/suppression. La réparation de l’ADN par HDR utilise une molécule d’ADN donneur partageant l’homologie avec l’ADN cible comme modèle de réparation. Les insectes possèdent les deux machines.

La technologie CRISPR/Cas9 peut générer des mutations dans un lieu choisi, par la voie de réparation du NHEJ; ou pour des stratégies d’édition du génome plus complexes, telles que les knock-ins ou les reporters d’expression, par le biais de la voie HDR avec un modèle de donneur approprié. Chez les mouches de sable, des allèles mutants nuls du facteur de réponse immunitaire Relish ont été générés par CRISPR nhej-médié dans Phlebotomus papatasi⁴. Des embryons de mouche de sable ont également été injectés dans une autre étude avec un mélange CRISPR/Cas9 ciblant le gène codant jaune. Pourtant, aucun adulte portant la mutation n’a été^{produit 18.} Nous décrivons ici une méthode détaillée de mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9, 24 h/24, avec un accent particulier sur la microinjection embryonnaire, une étape critique du protocole.

Protocole

L’utilisation de souris comme source de sang pour l’alimentation des mouches du sable a été effectuée conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des Instituts nationaux de la santé (NIH). Le protocole a été approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux du NIAID, NIH (numéro de protocole LPD 68E). Les invertébrés ne sont pas couverts par les lignes directrices des NIH.

1. Préparationd’aiguilles ( Figure 1)

1. Tirez les aiguilles et biseauté comme décrit dans Meuti et Harrell¹⁹. En bref, tirez des aiguilles sur un pull de micropipette en verre à deux étapes, à l’aide de capillaires en verre borosilicate.
2. Aiguisez les aiguilles en beveling humide sur le biseau de micropipette, à l’aide d’une pierre extra fine.

2. Collecte et micromanipulation d’embryons( Figure 2)

1. Cinq jours avant le jour de l’injection, le sang nourrit les femelles mouches du sable comme cela est effectué régulièrement pour l’entretien des colonies. Pour plus de détails sur les procédures d’élevage des colonies de mouches de sable et les matériaux requis, veuillez consulter Lawyer et coll.¹ Maintenir les insectes dans des incubateurs à 70 % d’humidité et à 26 °C pendant tout leur développement.
   1. Un jour après l’alimentation sanguine, capturer les femelles nourries au sang par groupes de 100-150 dans des pots de plâtre avec un port latéral. Maintenez les femelles en les nourrissant avec la solution de sucre (30% saccharose - assez de volume pour tremper une petite boule de coton) qui est habituelle pour l’entretien de colonie.
2. Au jour 2-3 après l’alimentation du sang, ne pas humidifier les pots de plâtre. Garder les femelles sur un substrat sec empêchera la ponte prématurée, puisque les femelles préfèrent pondre des œufs dans un environnement humide.
3. Le jour 5 après l’alimentation du sang, effectuer la collecte d’embryons, la micromanipulation et la microinjection. Introduire un papier filtre humide dans la chambre de ponte. Les embryons fraîchement posés n’ont pas de chorion entièrement développé et semblent blancs. Utilisez du papier filtre noir pendant la procédure pour faciliter la visualisation des embryons blancs.
4. Transférer un petit groupe de femelles du pot de plâtre à la chambre de ponte par les ports latéraux à l’aide d’un aspirateur buccaux. La présence d’un substrat humide (le papier filtre) incite les femelles à s’ovipositer.
5. Après 30-60 min, récupérer soigneusement le papier filtre avec des embryons nouvellement déposés de la chambre. Conservez le papier filtre et les embryons dans une boîte de Pétri jusqu’à 3 heures. Pendant ce temps, évaluez régulièrement le niveau d’humidité du papier filtre pour s’assurer qu’il reste humide. Pendant ce temps, répétez les étapes 2.4 à 2.6 avec de nouveaux groupes de femelles et recueillez autant d’embryons que possible.
6. Préparez des diapositives au microscope pour l’injection : recueillez manuellement les œufs un par un avec un pinceau très fin et transférez-les soigneusement sur un autre morceau de papier filtre noir humide placé sur une glissière de microscope surmontée d’un couvercle en verre.
   1. Ajouter de l’eau au papier filtre, assez pour garder les embryons humides, mais ne pas les faire flotter loin de la couverture ou d’être aspiré sous le coverslip. Alignez les embryons contre le coverslip. Le coverslip agit comme un backstop empêchant les oeufs de rouler loin pendant l’injection.

3. Injections d’embryons( Figure 3)

1. Commencez les injections 2,5 à 3 heures après le début de la collecte des œufs. Effectuez des injections à température ambiante et à l’humidité ambiante du laboratoire.
2. Assurez-vous que les embryons alignés ont suffisamment d’eau pour qu’ils soient maintenus humides.
   REMARQUE : Il est essentiel que les embryons soient maintenus humides pendant les injections. Si elles ne sont pas humides pendant le processus d’injection, les injections deviennent difficiles parce que l’aiguille a du mal à percer l’embryon. La bonne quantité d’eau est le point où les embryons ont un ménisque d’eau autour d’eux, mais le coverslip ne flotte pas sur le dessus de l’eau provoquant les embryons à pousser sous le coverslip. Il est essentiel de surveiller la quantité d’eau autour des embryons pendant les injections. Ajouter de l’eau au besoin pour garder les embryons humides.
3. Ajouter l’eau soigneusement en mouillant une brosse avec de l’eau et en transférant l’eau à l’extrémité arrière du papier filtre. L’ajout d’eau de cette façon permet d’ajouter de l’eau de façon lente et contrôlée afin d’ajouter juste assez pour garder les embryons humides. Trop d’eau peut faire flotter les embryons hors de l’alignement, ce qui rend difficile l’injection des embryons.
4. Mélange d’injection de charge arrière dans l’aiguille de microinjection. Ajouter environ 0,5 à 1 μL de mélange d’injection dans l’aiguille à l’aide d’un remplisseur d’aiguille de borosilicate dessiné à la main, des pointes de pipet de chargement de gel peuvent également être utilisées. Le mélange d’injection est composé d’un ou plusieurs ARN guides (80 ng/μL chacun) conçus pour cibler un locus spécifique mélangé à une protéine commerciale recombinante Cas9 (300 ng/μL).
5. En commençant par la pression d’injection à 30 psi, appuyez sur le déclencheur d’injection pour expulser l’air de la pointe de l’aiguille. Cela forcera le mélange d’injection jusqu’à la pointe de l’aiguille, ce qui permettra au mélange d’injection de s’écouler. À ce stade, augmentez lentement la pression de prise/constante jusqu’à ce que le matériel d’injection commence à couler, puis reculez hors de la prise/pression constante de sorte qu’il soit juste au-dessous du point du mélange d’injection coulant de l’aiguille. Le réglage fermé doit fournir juste assez de matériel d’injection de sorte qu’une petite quantité de matériel peut être vu pour entrer dans l’embryon.
   REMARQUE : L’injection d’embryons de mouches de sable sous huile d’halocarbone semblable à d’autres protocoles utilisés pour la drosophile et les moustiques a d’abord été testée, mais le pourcentage de survie pour ces injections était très faible. La survie a été améliorée en passant aux injections sur du papier filtre humide tel que décrit ci-dessus.
6. Insérer l’aiguille dans le côté de l’embryon. Utilisez le coverslip derrière l’embryon comme un backstop qui aidera l’aiguille à percer l’embryon. Livrer une petite quantité de mélange d’injection dans l’embryon avant d’enlever doucement l’aiguille.
7. Immédiatement après l’enlèvement de l’aiguille, appuyez sur l’injecteur pour enlever tout matériau remblayé de la pointe de l’aiguille. Cela aidera à empêcher l’aiguille de s’obstruer.
8. Procéder à l’embryon suivant. Entre chaque injection, assurez-vous que le papier filtre est humide et que l’aiguille n’est pas obstruée.
9. Une fois que tous les embryons ont été injectés, comptez le nombre d’embryons injectés pour maintenir un décompte en cours d’exécution.
10. Retirez le coverslip en ajoutant de l’eau au papier filtre afin que le coverslip flotte. À ce stade, utilisez une sonde (bâton applicateur en bois avec broche d’insecte collée à la pointe) pour maintenir le papier filtre en place tandis qu’un doigt est utilisé pour tirer le coverslip loin des embryons injectés.
11. Épongez l’excès d’eau du papier filtre une fois que le coverslip a été enlevé.

4. Élevage post-injection (G₀) (Figure 4)

1. Transférer le papier filtre avec les embryons sur plusieurs couches de papier filtre humide placé dans une boîte de Pétri pour maintenir l’humidité. Gardez les embryons ici pendant le temps nécessaire pour injecter d’autres embryons. Les embryons peuvent être maintenus pendant un maximum de 3 heures comme celui-ci. Après l’injection, ils brunissent lentement.
2. Une fois que tous les embryons ont été injectés, transférez-les manuellement sur des pots en plâtre de petite taille préalablement humidifiés. Ne mettez pas trop d’embryons dans chaque pot et maintenez la distance entre eux, pour éviter une contamination fongique possible entre les individus. Couvrez les pots d’un écran et rangez-les comme c’est généralement le cas pour les œufs de colonie de mouches de sable, maintenus dans des incubateurs à 70% d’humidité et 26 °C, pendant tout leur développement.
3. Le jour 1 après l’injection, enlever tous les embryons endommagés et morts à l’l’œdure d’un pinceau. Ajouter 100 μL d’acide propionique à 0,5 %, goutte à goutte, sur les pots en plâtre contenant les embryons injectés afin de limiter la contamination fongique. La libération de cytoplasme provenant d’embryons endommagés pendant le processus d’injection est particulièrement favorable à la croissance fongique.
4. Vérifiez les pots de plâtre tous les jours et retirez les embryons mauvais ou morts. Si le champignon est présent, enlever tous les embryons infectés et ajouter quelques gouttes d’acide propionique de 0,5%.
5. Les larves éclosent entre le jour 8 et 12 après l’injection. Deux fois par jour, transférer les larves nouvellement émergées sur de nouveaux pots de plâtre, en groupes de 5-10 maximum. Ajouter une petite quantité de nourriture et vérifier la nourriture 2-3 fois par semaine.
   1. Surveillez attentivement la quantité d’aliments larvaire, car trop augmente considérablement le risque de contamination fongique. Les larves de mouches du sable survivent mieux en groupes, mais elles peuvent être cannibales s’il n’y a pas assez de nourriture.
6. Lorsque les larves se pupifient, séparez-les par sexe pour maintenir les femelles comme vierges. S’il y a beaucoup de survivants, jetez les mâles et ne gardez que les femelles.
   REMARQUE : Les mâles et les femelles peuvent porter et transmettre des mutations. Cependant, comme les femelles doivent être gardées vierges avant qu’elles ne soient croisées, il est plus facile d’utiliser uniquement les femelles injectées par le G₀ pour éviter d’avoir à séparer les insectes wt par sexe. Les mâles du G₀ peuvent être gardés en renfort si le nombre de survivants adultes est faible et seront dans ce cas arrilés avec des femelles vierges triées.

5. Sélection et sélection d’allèles mutants (Figure 5)

1. Traverser en masse les femelles du G₀ avec des mâles wt dans une cage. Nourrissez-les complètement, comme ce serait le cas pour l’entretien normal des colonies.
2. Un jour après l’alimentation du sang, transférer chaque femelle G_{0 avec} 2-3 mâles wt dans des tubes de plâtre individuels à l’aide d’un aspirateur buccaux. Nourrir les mouches avec du sucre sur une petite boule de coton changée tous les jours et utiliser une seringue d’eau pour s’assurer que l’humidité du plâtre est appropriée pour la ponte.
3. Après que les femelles du G₀ ont pondu des œufs (correspondant à G_1),recueillir leur corps dans des tubes individuels annotés Eppendorf pour le génotypage ultérieur. Maintenir les embryons comme c’est habituellement le cas pour les colonies de wt.
4. Extraire l’ADN des femelles_{G 0} par la méthode de choix.
5. Filtrer l’ADN pour la présence de mutations, par exemple en concevant un test PCR à l’aide d’amorces entourant la région des coupes CRISPR attendues.
6. Ne gardez que les_{embryons G 1} pondus par les femelles G₀ montrant des signes de transformation. Lorsque ces embryons_{G 1} se développent en nymphes, séparez-les par sexe et ne gardez que les femelles. Traverser les femelles G₁ de la même femelle G₀ aux mâles wt, les nourrir dans le sang, puis transférer en petits groupes de 2-3 femelles et 4-5 mâles dans des récipients de petite taille.
   REMARQUE : Toutes les personnes du G₁ ont une chance de porter une mutation unique, donc si le nombre d’individus survivants n’est pas trop élevé, alors il est préférable de croiser les femelles G_{1 individuellement} avec des mâles wt. Le cas de plusieurs femelles portant une mutation différente présente dans un même tube est rare mais peut se produire. Si un tel cas est observé après génotypage, les femelles de descendance G₂ devraient alors être acoupées individuellement aux mâles wt. Ce schéma d’accouplement évite la possibilité de mutations multiples dans la descendance.
7. Après la ponte, recueillir les corps féminins G₁ et les dépister pour les mutations. Gardez seulement les tubes où au moins une femelle a montré l’évidence de la mutation.
8. Pour les générations suivantes faire une seule paire en croix. Après la ponte, dépister la présence de mutation chez les parents. Répétez à chaque génération jusqu’à ce que les deux parents soient homozygotes pour la même mutation. Une fois identifiés, ils seront les fondateurs d’un stock mutant homozygote.

Résultats

Le protocole de microinjection CRISPR/Cas9 décrit ici pour générer des mutants de mouche de sable a été établi dans une publication^{précédente 4}. Cette approche a produit la mutagenesis très efficace, car 11 individus sur 540 ont survécu à la procédure, dont 9 étaient mutants. Lors de la conception de guides pour la mutation CRISPR/Cas9, une première étape cruciale consiste à séquencer la région autour de la zone à cibler. Le modèle de séquençage doit être de la souche qui va...

Discussion

Nous présentons ici une méthode de microinjection embryonnaire récemment développée pour la mutagenèse ciblée par CRISPR/Cas9 chez les mouches de sable phlebotomus papatasi. La microinjection embryonnaire pour la modification génétique des insectes a été développée à Drosophila au milieu des années 1980²¹ et est maintenant couramment utilisée chez une grande variété d’insectes. D’autres méthodes de livraison de matériel de modification génétique ont ét?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black Filter Paper 4.25CM PK100	VWR	28342-012	Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
Dissecting Microscope	Any brand		For aligning embryos
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-A3	Base layer of the microinjection set up Figure 2A
Insect cage	custom made or several commercial options		polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Larval food	custom made		a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Microcaps 100 ml	Drummond	1-000-1000	Used to back fill microinjection needles
Mouth aspirator	John W. Hock Company	Model 612	mouth aspirator with HEPA filter
Olympus SZX12	Olympus Life Sciences		Microinjection microscope
Ovipots	Nalge company		ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
Paint Brush 6-0	Any Art Supply Company	n/a	Used for aligning embryos
Propionic acid	Sigma-Aldrich	402907	antifungal agent
Standard Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-3	Used for making microinjection needles
Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator	Sutter Instruments		Microinjection Controller and Micromanipulator