Reconstrucción Del Circuito Sanguíneo En Un Modelo De Trasplante De Corazón De Ratón Abdominal

Resumen

Una técnica nueva para la reconstrucción del circuito de sangre en un modelo abdominal heterotopic del trasplante del corazón del ratón se demuestra.

Resumen

La técnica quirúrgica del trasplante abdominal heterotopic del corazón en ratones es un modelo estándar para la investigación en inmunología del trasplante. Aquí, la técnica establecida para una reconstrucción modificada del circuito de sangre en un modelo abdominal heterotopic del trasplante del corazón se presenta. Este método utiliza la vena cava inferior intratorácica (IIVC) en vez de la arteria pulmonar del corazón dispensador de aceite para la anastomosis a la vena cava inferior del recipiente. Está facilitando y mejorando las tasas de éxito para el trasplante de corazón abdominal en ratones.

Introducción

La técnica quirúrgica de trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratones representa un modelo estándar para la investigación en inmunología de^{trasplantes 1,2,3.} Sin embargo, es muy difícil de realizar y esto implica una restricción al uso generalizado de este modelo^4,5.

En el trasplante tradicional de corazón de ratón (THTx), la aorta donante y la aorta abdominal receptora se anastomómosis mientras que la arteria pulmonar se anastomó al receptor de la vena cava inferior^6,7,8.

En esta técnica modificada de trasplante de corazón de ratón, la aorta del donante se anastomó a la aorta abdominal receptora y el IIVC donante se anastomó a la vena cava inferior receptora^(3,4,6) (Figura 2 y Figura 3).

Protocolo

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo siguiendo las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos (comité ético aprobado, #G1071/09).

NOTA: La preparación preliminar, la anestesia, la atención postoperatoria y el trabajo de monitoreo son los mismos que se realizan en los métodos quirúrgicos tradicionales^1,2,4. Los ratones BALB/c sirvieron como donantes del corazón y C57BL/6J como recipientes del trasplante. Los ratones tenían entre 8 y 12 semanas, pesaban ~ 30 g en el trasplante y fueron alojados en condiciones estándar.

1. Pasos preparatorios

1. Para la anestesia, dé a los ratones isoflurano inhalativo (2%) hasta que se duermen, seguido de inyecciones intraperitoneales de ketamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg). Para la analgesia postoperatoria, aplicar Metamizol (200 mg/kg) p.o. y Carprofeno (5 mg/kg) s.c..
   NOTA: La aplicación de antibióticos se abstuvo a propósito ya que estas sustancias pueden influir en las respuestas inmunológicas.
2. Para la cirugía, use un conjunto de instrumentos microscópicos que incluyen una micro-tijera, micro-pinzas, un porta agujas y micro abrazaderas hemostáticas. Una pluma electroquirúrgica también es necesaria. Realice las suturas usando los tipos de nylon 7/0er, 10/0er y 4/0er.
3. Coloque el ratón en una caja para la inhalación de isoflurano (2%) durante 40-60 segundos. Determine la profundidad de la anestesia exprimiendo la pata con pinzas. Si hay una falta completa de respuesta para este estímulo, vaya al siguiente paso.
4. Una vez que el ratón se ha quedado dormido, pesar el ratón.
5. Aplique una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg) + xilazina (10 mg/kg) + acepromazina (2 mg/kg) al ratón anestesiado.
6. Recorte el pelaje abdominal y coloque el ratón en la mesa de operaciones. Realice la desinfección usando yoduro de povidona durante 3 veces, luego cubra correctamente el ratón usando una toalla quirúrgica fenestrada.

2. Procedimiento de operación del donante

1. Use tijeras para cortar la piel desde el cuello hasta la parte inferior del abdomen y desprenda la capa completa de la piel hasta la línea media de ambas axilas.
2. Use tijeras para cortar los músculos de la pared abdominal y mueva suavemente las vísceras hacia la izquierda (desde la vista del operador). Envuelva las vísceras con una gasa salina imbuyda para exponer con seguridad la vena cava inferior.
3. Use una jeringa de 1 ml para inyectar 0,4 ml de la solución de heparina (contiene 500 U de heparina) lentamente en la vena cava inferior y espere 1 minuto antes de sacar la aguja.
4. Saque la aguja y use una microescojera para cortar tanto la vena cava inferior como la aorta abdominal para acelerar la exsanguinación.
5. Use tijeras para abrir la cavidad torácica realizando un corte en forma de U; exponer completamente el corazón, los pulmones y todos los vasos sanguíneos del pecho.
   1. Exponga la aorta torácica, corte 1/2 de la luz y luego corte la vena pulmonar para facilitar la irrigación y el drenaje.
   2. Inserte un tubo de irrigación en la abertura de la aorta torácica, inyecte al menos 2 mL de 4 °C de solución de cardioplejía de histidina-triptófano-cetoglutarato frío (solución de Custodiol HTK)⁹ hasta que el flujo de salida de la vena pulmonar esté completamente despejado y el corazón deje de latir por completo.
6. Saque el tubo de riego y suelte el esternón.
7. Use micro tijeras para eliminar el timo y para quitar ligeramente la grasa alrededor del arco aórtico.
8. Use fórceps rectos y curvos para exponer y ligar el tronco de la arteria pulmonalis (en el lado derecho del arco aórtico) con una sutura de 10/0.
9. Use micro fórceps para separar la grasa y el tejido conectivo unidos al IIVC, exponga y ligar la vena cava superior (en el lado izquierdo del arco aórtico) con una sutura de 7/0 y use micro tijeras para cortarla detrás de la ligadura.
10. Haga una sutura de 7/0 alrededor de la base del corazón debajo del arco aórtico, el IIVC y ambas aurículas. Luego ligar las ramas de la arteria pulmonar y los vasos pulmonares venosos.
11. Use micro tijeras para transectar el arco aórtico lo más distal posible, los vasos pulmonares debajo de la ligadura y el IIVC cerca del diafragma. Retire el corazón del pecho.
12. Coloque el corazón del donante explantado en una solución de cardioplejía HTK fría a 4 °C y reserve temporalmente.

3. Procedimiento de operación del destinatario

NOTA: Los pasos iniciales de la operación son similares a los mostrados previamente para el ratón donante, incluyendo anestesia y desinfección.

1. Realice el corte de la piel abdominal de manera transversal, cubra los órganos abdominales con una gasa húmeda usando solución salina.
2. Use micro fórceps para exponer la vena cava inferior y la aorta abdominal y liberarlos del tejido graso circundante.
3. Use micro fórceps para ligar o electrocauterizar los vasos de la rama lateral (laterales o debajo de la vena/aorta) debajo de los vasos renales.
4. Use pinzas aplicadoras para colocar dos pinzas micro hemostáticas en la parte abdominal de la vena/aorta que vienen de la derecha dejando más de 1 cm de distancia para ambas aorta/vena para asegurar el espacio para la construcción de la anastomosis entre ellas.
5. Use micro tijeras para hacer una incisión en la aorta un poco más cerca de la abrazadera inferior que de la abrazadera superior. Alternativamente, use una aguja de 30 G para hacer un pequeño agujero y ábralo con micro tijeras.
6. Coloque el ratón receptor de modo que la aorta esté frente al operador con la vena cava en el otro lado. Luego coloque el corazón en la cavidad abdominal y cúbralo con una pequeña gasa húmeda.
7. Use una sutura 10/0 para adaptar y suturar la aorta donante a la aorta receptora comenzando caudalmente, haga un nudo y proceda con una sutura corriente hasta la parte superior de la incisión (aproximadamente 4-5 puntos de sutura). A continuación, voltee el corazón hacia la derecha (desde la vista del sujeto), cúbralo de nuevo y continúe la sutura en el lado izquierdo hasta llegar al extremo caudal y anótelo.
8. Use un tubo de riego para inyectar al menos 0,5 mL de solución de cardioplejía HTK de 4 °C para eliminar el IIVC del donante.
9. Utilice micro-tijeras para cortar un agujero redondo en la vena cava inferior abdominal del receptor, que debe tener el mismo tamaño de los donantes iivc lumen. La incisión debe estar ubicada por encima de la abertura anastomótica aórtica. Haga que la incisión venosa sea más grande que la incisión aórtica.
10. Utilice una sutura de 10/0 para coser el IIVC donante a la vena cava receptora comenzando caudalmente. Ate un nudo y realice una sutura corriente hasta que se alcance la parte superior de la incisión. Use cinco puntos de sutura y continúe la sutura a la izquierda. Finalmente, ate un nudo en la esquina de la cola y apriete cuidadosamente (tenga cuidado de no tirar demasiado apretado).
11. Coloque las pequeñas partes de la esponja hemostática alrededor de la vena y las anastomosis aórticas.
12. Use pinzas del aplicador de clip para quitar primero las abrazaderas micro-hemostáticas inferiores y luego superiores y enjuague la cavidad abdominal con cloruro de sodio al 0,9% templado a 38,0 °C.
13. Use micro- esponjas para quitar la esponja hemostática.
14. Observe los latidos del corazón trasplantado.
15. Use fórceps para volver a colocar los intestinos en la cavidad abdominal y suturas de dos capas (músculos abdominales seguidos de piel) para cerrar la herida abdominal con una sutura de 4/0.
16. Coloque a los ratones en una cámara de estación de trabajo de control de oxígeno y temperatura (por ejemplo, INVIVO2-400) para proporcionar un ambiente cálido y rico en oxígeno para que los ratones trasplantados se recuperen, espere a que los ratones se despierten.
17. Para la analgesia postoperatoria, dé directamente Metamizol 200 mg/kg por os después de la operación. Cuatro y 16 horas después de la operación dan Metamizol 200 mg/kg por os+ Carprofen (5mg/kg) s.c. En el seguimiento posterior, dé Carprofeno (5 mg/kg) s.c a los ratones trasplantados cada 24 horas durante tres días consecutivos después de la operación.

Resultados

Aquí, una técnica modificada del trasplante abdominal heterotopic del corazón en ratones que se ha desarrollado previamente en nuestro laboratorio y ha probado útil por los 16 años pasados se presenta. Previamente, se informó que en total 40 casos de vena cava a vena cava (grupo V-V) en comparación con 40 casos del procedimiento tradicional de anastomosis de arteria pulmonar a vena cava (grupo P-V)⁴ (Tabla 1)la anastomosis del vaso tomó 20,8±1,3 min en el grupo V-V, que f...

Discusión

La técnica quirúrgica del trasplante abdominal heterotopic del corazón en ratones es muy desafiadora y esto implica una restricción al uso extenso de este modelo.

Una de las desventajas de la técnica convencional es la longitud limitante de la arteria pulmonar del donante (AF). Suele ser de unos 2 mm de longitud, mientras que la longitud del IIVC del corazón donante utilizado en nuestro modelo suele ser de unos 1 cm(Figura 2). Esto significa que en el modelo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun