שחזור מעגל הדם במודל השתלת לב של עכבר בטן

Summary

טכניקה חדשנית לשחזור מעגל הדם במודל הטרוטופי של השתלת לב עכבר בטן מודגמת.

Abstract

הטכניקה הכירורגית של השתלת לב בטן הטרוטופית בעכברים היא מודל סטנדרטי למחקר באימונולוגיה של השתלות. כאן, הטכניקה הוקמה לשחזור מעגל הדם שונה במודל השתלת לב בטן הטרוטופי מוצג. שיטה זו משתמשת vena cava נחותים intrathoracic (IIVC) במקום עורק הריאה של הלב התורם עבור anastomosis כדי הווריד הנבוב הנחות של המטופל. זה להקל ולשפר את שיעורי ההצלחה עבור השתלת לב הבטן בעכברים.

Introduction

הטכניקה הכירורגית של השתלת לב בטן הטרוטופית בעכברים מייצגת מודל סטנדרטי למחקר באימונולוגיה של השתלות^1,2,3. עם זאת, זה מאוד מאתגר לבצע וזה מסבך הגבלה לשימוש הנרחב של מודל זה^4,5.

בהשתלת לב עכבר מסורתית (THTx), העורקים התורמים ואבי העורקים הבטן של המטופל הם anastomosed בעוד עורק הריאה הוא anastomosed למקבל ורידים נחותים^6,7,8.

בטכניקה זו של השתלת לב עכבר שונה, העורקים התורמים מווסתים לאבי העורקים הבטן של המטופל והתורם IIVC הוא anastomosed למקבל ורידים^{נחותים (3,4,6)} ( איור2 ואיור 3).

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ההוראה 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות (ועדת האתיקה אישרה, #G1071/09).

הערה: הכנה ראשונית, הרדמה, טיפול שלאחר הניתוח ועבודת ניטור זהים לביצוע בשיטות כירורגיות מסורתיות^1,2,4. עכברי BALB/c שימשו כתורמי לב וכ-C57BL/6J כמקבלי השתלות. עכברים היו בני 8-12 שבועות, שקלו ~ 30 גרם בהשתלה ושוכנו בתנאים סטנדרטיים.

1. צעדי הכנה

1. להרדמה, תן עכברים שאיפה isoflurane (2%) עד שהם נרדמים, ואחריו זריקות תוך-פיוריטונליות של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) + קסילאזין (10 מ"ג/ק"ג) + אצפרומזין (2 מ"ג/ק"ג). עבור משכך כאבים לאחר הניתוח, להחיל Metamizol (200 מ"ג /ק"ג) p.o. ו Carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) s.c..
   הערה: היישום של אנטיביוטיקה נמנע בכוונה כמו חומרים אלה עשויים להשפיע על תגובות אימונולוגיות.
2. לניתוח, יש להשתמש בערכה של מכשירים מיקרוסקופיים הכוללים מיקרו-מספריים, מיקרו-מלקחיים, מחזיק מחט ומהדקים מיקרו-מיוסטטיים. עט אלקטרוכירורגי הוא גם הכרחי. בצע תפרים באמצעות סוגי ניילון 7/0er, 10/0er ו- 4/0er.
3. מקם את העכבר בקופסה עבור שאיפת isoflurane (2%) למשך 40-60 שניות. לקבוע את עומק ההרדמה על ידי סחיטת הכף עם פינצטה. אם יש חוסר תגובה מוחלט לגירוי זה, עבור לשלב הבא.
4. ברגע שהעכבר נרדם, לשקול את העכבר.
5. יש למרוח הזרקה תוך-אישית של קטמין (100 מ"ג/ק"ג) + קסילאזין (10 מ"ג/ק"ג) + אצפרומזין (2 מ"ג/ק"ג) על העכבר המורדם.
6. חותכים את פרוות הבטן ומניחים את העכבר על שולחן הניתוחים. בצע חיטוי באמצעות יודיד povidone במשך 3 פעמים, ולאחר מכן כראוי לעטוף את העכבר באמצעות מגבת כירורגית fenestrated.

2. נוהל ניתוח תורם

1. השתמש במספריים כדי לחתוך את העור מהצוואר אל הבטן התחתונה, לקלף את השכבה המלאה של העור לקו האמצע של שני בית השחי.
2. השתמש במספריים כדי לחתוך את שרירי דופן הבטן ולהזיז בעדינות את הקרביים שמאלה (מנקודת המבט של המפעיל). לעטוף את הקרביים עם גזה מלוחים imbibed לחשוף בבטחה את הווריד הווריד נחות.
3. השתמש מזרק 1 מ"ל להזריק 0.4 מ"ל של פתרון הפרין (מכיל 500 U הפרין) לאט לתוך קאווה הווריד התחתון ולחכות 1 דקה לפני מושך את המחט.
4. לשלוף את המחט ולהשתמש מיקרו מספריים לחתוך הן את הווריד הווריד נחות ואת העורקים הבטן כדי להאיץ exsanguination.
5. השתמש במספריים כדי לפתוח את חלל החזה על ידי ביצוע חתך בצורת u; לחשוף לחלוטין את הלב, הריאות ואת כל כלי הדם בחזה.
   1. לחשוף את העורקים בבית החזה, לחתוך 1/2 של לומן, ולאחר מכן לחתוך את הווריד ריאתי כדי להקל על השקיה וניקוז.
   2. הכנס צינור השקיה לתוך הפתיחה של אב העורקים החזה, להזריק לפחות 2 מ"ל של 4 מעלות צלזיוס היסטידין קר-טריפטופן-ketoglutarate פתרון קרדיופלגיה (פתרון HTK Custodiol)⁹ עד זרימת ורידים ריאתי ברור לחלוטין הלב מפסיק לפעום לחלוטין.
6. מוציאים את צינור ההשקיה ומנתקים את עצם החזה.
7. השתמש מספריים מיקרו כדי להסיר את התימוס כדי להפשיט מעט את השומן סביב קשת אבי העורקים.
8. השתמש במלקחיים ישרים ומעוגלים כדי לחשוף ולחשוף את תא המטען של pulmonalis העורקים (בצד ימין של קשת העורקים) עם תפר 10/0.
9. השתמש מלקחיים מיקרו כדי להפריד את השומן ואת רקמת החיבור המצורפת IIVC, לחשוף ולשחרר את קאווה vena מעולה (בצד שמאל של קשת העורקים) עם תפר 7/0 ולהשתמש מספריים מיקרו לחתוך אותו מאחורי הקשירה.
10. הפוך תפר 7/0 סביב הבסיס של הלב מתחת לקשת העורקים, IIVC, ושני auricles. ואז ligate ענפי עורק הריאה וכלי ריאות ורידיים.
11. השתמש מספריים מיקרו כדי להעביר את קשת העורקים כמו distal ככל האפשר, כלי הריאה מתחת קשירה ו IIVC ליד הסרעפת. תוציא את הלב מהחזה.
12. מניחים את הלב של התורם explanted לתוך 4 מעלות צלזיוס קר HTK פתרון cardioplegia ולשמור באופן זמני.

3. הליך הפעולה של הנמען

הערה: שלבי הפעולה הראשוניים דומים לאלה שהוצגו בעבר עבור עכבר התורם, כולל הרדמה וחיטוי.

1. בצע את העור הבטן לחתוך באופן רוחבי, לכסות את איברי הבטן עם גזה רטובה באמצעות תמיסת מלח.
2. השתמש מלקחיים מיקרו כדי לחשוף את הווריד הווריד נחות ואבי העורקים הבטן ולשחרר אותם מרקמת השומן שמסביב.
3. השתמש מלקחיים מיקרו כדי ligate או electrocauterize כלי ענף בצד (לרוחב או מתחת לווריד / אב העורקים) מתחת לכלי הכליה.
4. השתמש מלקחיים מוליך קליפ למקם שני מלחציים hemostatic מיקרו בחלק הבטן של וריד / aorta מגיע מימין עוזב יותר מ 1 ס"מ מרחק עבור שני aorta / וריד כדי להבטיח מקום לבניית anastomosis ביניהם.
5. השתמש מספריים מיקרו לעשות חתך לתוך העורקים קצת יותר קרוב מהדק התחתון מאשר מהדק העליון. לחלופין, השתמש במחט 30 G כדי ליצור חור קטן ולפתוח אותו עם מספריים מיקרו.
6. מקם את עכבר הנמען כך שאבי העורקים יפנה לאופרטור עם ה- vena cava בצד השני. לאחר מכן מניחים את הלב לתוך חלל הבטן ומכסים אותו עם כרית גזה רטובה קטנה.
7. השתמש תפר 10/0 כדי להתאים ולתפור את העורקים התורם לאבי העורקים הנמען מתחיל caudally, לעשות קשר ולהמשיך עם תפר ריצה לחלק העליון של החתך (כ 4-5 תפרים). לאחר מכן, הופכים את הלב ימינה (מנקודת המבט של הנושא), מכסים אותו שוב וממשיכים את התפירה בצד שמאל עד להגעה לקצה הקאודל וקושרים אותו.
8. השתמש בצינור השקיה כדי להזריק לפחות 0.5 מ"ל של 4 °C HTK פתרון לב-חזה כדי לשטוף IIVC של התורם.
9. השתמש מיקרו ומספריים כדי לחתוך חור עגול על הבטן נחותה vena cava של המטופל, אשר צריך להיות באותו גודל של לומן IIVC התורמים. החתך צריך להיות ממוקם מעל פתח anastomotic אב העורקים. הפוך את חתך הוורידים לגדול יותר מהחתך בגור העורקים.
10. השתמש תפר 10/0 כדי לתפור את IIVC התורם לנמען vena קאווה החל caudally. לקשור קשר ולבצע תפר ריצה עד החלק העליון של החתך הוא הגיע. השתמש חמישה תפרים ולהמשיך את התפר בצד שמאל. לבסוף, לקשור קשר בפינת הזנב, בזהירות להדק (להיזהר לא למשוך חזק מדי).
11. מניחים את החלקים הקטנים של הספוג hemostatic סביב הווריד ואת anastomoses בגור העורקים.
12. השתמש מלקחיים אפליקטור קליפ כדי להסיר תחילה את התחתון ולאחר מכן את המהדקים מיקרו hemostatic העליון ולשטוף את חלל הבטן עם 38.0 מעלות צלזיוס מחוסמת 0.9% נתרן כלורי.
13. השתמש מלקחיים מיקרו לקחת את הספוג hemostatic.
14. שימו לב לפעימות הלב המושתלות.
15. השתמש מלקחיים כדי להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן ותפרים דו שכבתיים (שרירי הבטן ואחריו העור) כדי לסגור את פצע הבטן עם תפר 4/0.
16. שים את העכברים לתוך תא תחנת עבודה בקרת חמצן וטמפרטורה (למשל, INVIVO2-400) כדי לספק סביבה חמה ועשירה בחמצן עבור העכברים המושתלים להתאושש, לחכות לעכברים להתעורר.
17. למשככי כאבים לאחר הניתוח, יש לתת ישירות למטמיזול 200 מ"ג/ק"ג למערכת ההפעלה לאחר הניתוח. ארבע ו -16 שעות לאחר הניתוח לתת Metamizol 200 מ"ג / קילוגרם לכל os + Carprofen (5mg /kg) s.c. במעקב נוסף, תן Carprofen (5 מ"ג / קילוגרם) s.c לעכברים המושתלים כל 24 שעות במשך שלושה ימים רצופים לאחר הניתוח.

תוצאות

כאן, טכניקה שונה של השתלת לב בטן הטרוטופית בעכברים שפותחה בעבר במעבדה שלנו הוכיחה שימושית במשך 16 השנים האחרונות מוצג. בעבר, דווח כי בסך הכל 40 מקרים של vena cava כדי vena cava (V-V הקבוצה) לעומת 40 מקרים של עורק הריאה המסורתי כדי vena cava (קבוצת P-V) הליך anastomosis⁴ (טבלה 1)anastomosis כלי לקח 20.8±1.3...

Discussion

הטכניקה הכירורגית של השתלת לב בטן הטרוטופית בעכברים היא מאתגרת מאוד וזה מסבך הגבלה לשימוש הנרחב במודל זה.

אחד החסרונות של הטכניקה הקונבנציונלית הוא האורך המגביל של עורק הריאה של התורם. אורכו בדרך כלל כ-2 מ"מ, ואילו אורך ה-IIVC של הלב התורם המשמש במודל שלנו הוא בדרך כלל כ-1 ס"מ

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun