腹部マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建

要約

異重症性腹部マウス心臓移植モデルにおける血液回路再建の新しい技術が実証されている。

要約

マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は、移植免疫学の研究のための標準的なモデルである。ここでは、異所性腹部心臓移植モデルにおける修飾血液回路再構成のための確立された技術が提示される。この方法では、レシピエントの下の大静脈に対する吻鼻的なドナー心臓の肺動脈の代わりに胸部内の下静脈(IIVC)を使用する。これは、マウスの腹部心臓移植の成功率を促進し、改善しています.

概要

マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は、移植免疫学^1、2、3の研究のための標準的なモデル^を表^す。しかし、実行することは非常に困難であり、これはこのモデル^4、5の広範な使用に対する制限を意味します。

従来のマウス心臓移植(THTx)では、ドナー大動脈およびレシピエント腹部大動脈は、肺動脈がレシピエントの下の静脈^6、7、8に吻眼されている間に吻眼される。

この改変マウス心臓移植技術において、ドナー大動脈はレシピエント腹部大動脈に吻合され、ドナーIIVCは、レシピエントの下のカバに吻合される^(図2および図3)。

プロトコル

すべての動物実験は、科学的目的のために使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63/EUのガイドラインに従って行われました(倫理委員会承認、#G1071/09)。

注: 予備準備、麻酔、術後のケアおよびモニタリング作業は、従来の外科方法^1、2、4で行われるのと同じです。BALB/cマウスは心臓ドナーとして、C57BL/6Jは移植レシピエントとして働いた。マウスは8〜12週齢、移植時の体重は30g〜および標準的な条件下で収容された。

1. 準備手順

1. 麻酔の場合、マウスに吸入イオブルラン(2%)眠りに落ちるまで、ケタミン(100mg/kg)+キシラジン(10mg/kg)+アセプロマジン(2mg/kg)の腹腔内注射が続く。術後鎮痛の場合は、メタミゾール(200mg/kg)p.o.およびカルプロフェン(5mg/kg)s.cを適用します。
   注:抗生物質の適用は、これらの物質が免疫学的応答に影響を与える可能性があるため、意図的に棄権した。
2. 手術には、マイクロシザー、マイクロ鉗子、針ホルダー、マイクロ止血クランプなどの顕微鏡器具を使用してください。電気外科用ペンも必要です。7/0er、10/0er、4/0erナイロンタイプを使用して縫合を行います。
3. イオブルラン吸入用のボックスにマウスを置く(2%)40〜60秒間。ピンセットで足を絞って麻酔の深さを決定します。この刺激に対する応答が完全に不足している場合は、次のステップに進みます。
4. マウスが眠りに落ちたら、マウスの重量を量る。
5. 麻酔薬にケタミン(100mg/kg)+キシラジン(10mg/kg)+アセプロマジン(2mg/kg)の腹腔内注射を適用します。
6. 腹部の毛皮をクリップし、操作テーブルの上にマウスを置きます。ポビドネヨウ化物を使用して3回消毒を行い、フェネレートされた外科タオルを使用してマウスを適切にドレープする。

2. ドナーの操作手順

1. はさみを使って首から下腹部まで皮膚を切り取り、両腋窩の中線まで皮膚の完全な層を剥がします。
2. はさみを使って腹壁の筋肉を切り、内臓を左にそっと動かします(オペレーターの視界から)。内臓を生理食前のインビドガーゼで包み込み、下の大静脈を安全に露出させます。
3. 1 mL の注射器を使用して、0.4 mL のヘパリン溶液 (500 U ヘパリンを含む) を下の大静脈にゆっくりと注入し、針を引き抜く前に 1 分間待ちます。
4. 針を引き出し、マイクロハサミを使用して、下の大動脈と腹部大動脈の両方を切断して排泄を促進します。
5. はさみを使用して、U字型のカットを行うことによって胸腔を開きます。完全に心臓、肺とすべての胸の血管を露出します。
   1. 胸部大動脈を露出し、内腔の1/2を切断し、その後、灌漑と排水を容易にするために肺静脈を切断します。
   2. 乾性大動脈の開口部に灌漑チューブを挿入し、肺静脈流出が完全にクリアされ、心臓の鼓動が完全に停止するまで、4°C冷たいヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸心プレジア溶液(Custodiol HTK溶液⁾⁹ の少なくとも2 mLを注入する。
6. 灌漑チューブを引き出し、胸骨を取り外します。
7. 胸腺を取り除き、大動脈弓の周りの脂肪をわずかに取り除くためにマイクロハサミを使用してください。
8. 直線および湾曲した鉗子を使用して、10/0縫合糸で動脈プルモナリス(大動脈弓の右側)の幹を露出させ、リゲートします。
9. IIVCに取り付けられた脂肪と結合組織を分離するためにマイクロ鉗子を使用し、7/0縫合糸で優れた静脈(大動脈アーチの左側)を露出させ、ライゲーションの背後でカットするためにマイクロハサミを使用します。
10. 大動脈弓、IIVC、および両方の耳の下の心臓の基部の周りに7/0縫合を作ります。次に、肺動脈の枝と静脈肺の血管をリゲートします。
11. マイクロハサミを使用して大動脈弓を可能な限り遠位に、合字の下の肺血管と横隔膜近くのIIVCをトランセクトします。胸から心臓を取り出します。
12. 4 °Cの冷たいHTK心筋プレギア溶液に植えられたドナーの心臓を置き、一時的に保存します。

3. 受信者の操作手順

注:最初の操作手順は、麻酔や消毒を含むドナーマウスに対して以前に示されたものと同様です。

1. 腹部の皮膚を横方向に切り取り、生理液を用いて濡れたガーゼで腹部の器官を覆う。
2. 微小鉗子を使用して、下の大静脈と腹部大動脈を露出させ、周囲の脂肪組織からそれらを解放する。
3. マイクロ鉗子を使用して、腎血管の下(側面または静脈/大負の下)側枝血管をリゲートまたはエレクトロカテーズします。
4. クリップアプリケーター鉗子を使用して、右から来る静脈/大動脈の腹部に2つのマイクロ止血クランプを配置し、両方の大動脈/静脈の距離を1cm以上残し、その間に吻合の構築のためのスペースを確保します。
5. マイクロハサミを使用して、大オータへの切開を上部クランプよりも低いクランプに少し近くします。あるいは、30Gの針を使って小さな穴を開け、マイクロハサミで開きます。
6. 大介が反対側の静脈を持つオペレータに向かるように、受取人のマウスを置きます。その後、腹腔に心臓を配置し、小さなぬれたガーゼパッドでそれをカバーします。
7. 10/0縫合糸を使用して、ドナー大仏を受け知り受取人大オルタに適応させ、縫い合わせ、結び目を作り、切開の上部(約4〜5針)に縫合を進めます。次に、(被写体の視界から)心臓を右にひっくり返し、もう一度カバーし、尾端に達するまで左側の縫合糸を続けて結び付けます。
8. 灌漑チューブを使用して、少なくとも0.5 mLの4°C HTK心プレギア溶液を注入し、ドナーのIIVCを洗い流します。
9. マイクロハサミを使用して、ドナーIIVCルーメンの同じサイズを持つはずのレシピエントの腹部下の大静脈に丸い穴を切断します。切開は大動脈性解剖学的開口部の上に配置する必要があります。静脈切開を大動脈切開よりも大きくする。
10. 10/0縫合糸を使用して、ドナーIIVCをレシピエント・カバに縫い付けます。結び目を結び、切開の上部に達するまで縫合を実行します。5針を使用し、左側の縫合糸を続けます。最後に、尾角で結び目を結び、慎重に締めます(引っ張りすぎないように注意してください)。
11. 血帯性スポンジの小さな部分を静脈と大動脈性の大動脈の周りに置きます。
12. クリップアプリケーター鉗子を使用して、最初に下部を取り除き、次に上部のマイクロヘモースタティッククランプを取り除き、38.0°Cの焼戻し0.9%塩化ナトリウムで腹腔をすすきます。
13. マイクロ鉗子を使用して、止血スポンジを取り除く。
14. 移植された心臓の鼓動を観察する。
15. 鉗子を使用して腸を腹腔に戻し、2層縫合(腹筋に続いて皮膚)を使用して腹部の創傷を4/0縫合で閉じます。
16. マウスを酸素および温度制御ワークステーションチャンバー(例えば、INVIVO2-400)に入れて、移植されたマウスが回復するための温かい酸素リッチな環境を提供し、マウスが目を覚ますのを待つ。
17. 術後鎮痛の場合は、術後に直接Metamizolを与える 200 mg/kg / os あたり.手術後4時間と16時間は、metamizolに200mg / kgのos+ Carprofen(5mg/kg)s.cを与える。さらにフォローアップでは、手術後3日間連続して24時間ごとに移植されたマウスにカルプロフェン(5mg/kg.c)を与える。

結果

ここでは、これまで研究室で開発され、過去16年間に有用であることが証明されているマウスにおける異所性腹部心臓移植の改変技術が提示される。以前は、静脈からカバ(V-V群)に対する静脈カバの40例の全体的な40例において、従来の肺動脈からカバ(P-V群)の吻合手順⁴⁽表1)に比べて、V-V群では20.8±1.3分を要することが報告されていた。 これはP-V群(27.5±1.3分、p<0....

ディスカッション

マウスにおける異所性腹部心臓移植の外科技術は非常に困難であり、これはこのモデルの広範な使用に対する制限を意味する。

従来の技術の欠点の1つは、ドナーの肺動脈(PA)の制限長である。通常は約2mmの長さですが、私たちのモデルで使用されるドナー心臓のIIVCの長さは一般的に約1cmです(図2)。つまり、改変モデルにおいて、IIVC吻合は、手術場?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G-needles	Braun	456300
acepromazine	CP Pharma	Tranquisol P
BALB/c AnNCrl mice	Charles River. Germany	no catalog number
Bepanthen eye ointment	Haus-Apotheke	PZN 01578675
Bonn Micro Forceps	FST	11083-07
Box for insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
C57BL/6J  mice	Charles River. Germany	no catalog number
Carprofen	Zoetis	Rimadyl 50 mg/ml
CATHETER-FEP 26G	TERUMO	Surflo-W
Clip Applicator Forceps Style	FST	18057-14
Curved forceps	WPI	14114-G
custodiol/HTK	Dr. Franz Köhler Chemie	no catalog numer
Cutasept skin disinfection	VWR	BODL980365
electrosurgical pen	Bovie	CHANGE-A-TIP
gauze pads, cotton swabs	Lohmann-Rauscher	13353
Heating mat	THERMO MAT PRO 30W	HTP-30
Hemostatic sponge	CuraSpon	J1276A
heparine-solution	Haus-Apotheke	PZN 03029820
Ice box	PETZ	No Catalog Number available
Inhalation anesthesia device	GROPPLER	BKGM 0616
insulation and oxygen supply device	RUSKINN	INVIV
isoflurane	CP Pharma	Isofluran CP 1 ml/ml
ketamine	Zoetis	no catalog numer
metamizole	WDT	no catalog numer
Micro scissors	FST	15000-00,15000-10
Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm	FST	18055-06
Microscope	Leica	LEICAMZ6
Microscope light	SCHOTT	KL2500LED
Saline solution (NaCl 0.9%)	Haus-Apotheke	PZN 06178437
Scissors	Peha Instruments	991083/4
small Petri dish	Sarstedt	833900
Straight forceps	WPI	14113-G
surgical tape	BSN	4120
Suture Tying Forceps - 10 cm	FST	18025-10
Sutures(10-0)	Medtronic	N2540
Sutures(4-0)	ETHILON	V4940H
Sutures(7-0)	ETHILON	1647H
Syringe (0.3 mL)	BD	324826
Syringe (1 mL)	BD	320801
xylazine	Bayer	Rompun