Ensayo de fuga fluorescente para investigar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en las células

Resumen

El ensayo de fuga de fluorescencia es un método simple que permite la investigación de las interacciones péptido/membrana con el fin de comprender su participación en varios procesos biológicos y especialmente la capacidad de los péptidos que penetran en las células para alterar las bicapas de fosfolípidos durante un proceso de translocación celular directa.

Resumen

Los péptidos penetrantes en las células (CPP) se definen como portadores que son capaces de cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células. Una de las principales características comunes requeridas para esta actividad resultó de las interacciones de los CPP con la membrana plasmática (lípidos) y más particularmente con componentes de la matriz extracelular de la propia membrana (sulfato de heparápalo). De hecho, independientemente de la translocación directa o de la internalización dependiente de la endocitosis, las bicapas lipídicas están implicadas en el proceso de internalización tanto a nivel de la membrana plasmática como a nivel del tráfico intracelular (vesículas endosómicas). En este artículo, presentamos un protocolo detallado que describe los diferentes pasos de una gran formulación, purificación, caracterización y aplicación de vesículas unilamelares (LUV) en el ensayo de fuga de fluorescencia para detectar una posible desestabilización / interacción de la membrana CPP y abordar su papel en el mecanismo de internalización. Las UDV con una composición lipídica que refleja el contenido de la membrana plasmática se generan para encapsular tanto un tinte fluorescente como un quencher. La adición de péptidos en el medio extravesicular y la inducción de interacciones péptido-membrana en las UDV podrían inducir de manera dependiente de la dosis un aumento significativo de la fluorescencia que revela una fuga. Aquí se proporcionan ejemplos con los péptidos anfipáticos (WRAP) ricos en triptófano (W) y arginina (R) recientemente desarrollados, que mostraron una entrega rápida y eficiente de siRNA en varias líneas celulares. Finalmente, se discute la naturaleza de estas interacciones y la afinidad por los lípidos para comprender y mejorar la translocación de la membrana y / o el escape endosomal.

Introducción

Después de su descubrimiento en los años noventa, se desarrollaron péptidos penetrantes en las células (CPP) para promover una entrega celular eficiente de cargas a través de la membrana plasmática^1,2. Los CPP suelen ser péptidos cortos, generalmente de 8 a 30 aminoácidos, que tienen una amplia variedad de orígenes. Primero se definieron como portadores de "translocación directa", lo que significa que pudieron cruzar la membrana plasmática y transferir una carga a las células independientemente de cualquier vía endocitótica, ni el requerimiento de energía ni la participación del receptor. Sin embargo, investigaciones posteriores revelaron que estas primeras observaciones provenían principalmente de la sobreestimación de la fluorescencia debido al artefacto experimental y / o a los protocolos de fijación utilizando metanol³. Hoy en día, es ampliamente aceptado que la captación de CPP tiene lugar tanto por endocitosis como por translocación independiente de la energía^4,5,6,7 dependiendo de diferentes parámetros como la naturaleza de la carga, el enlace utilizado entre CPP y carga, la línea celular estudiada, etc.

Los CPP se pueden utilizar como agentes de transfección de acuerdo con dos estrategias, ya sea que impliquen un enlace químico (estrategia covalente) o interacciones electrostáticas/hidrofóbicas (estrategia no covalente) entre el CPP y su carga^8,9,10,11. Aunque ambas estrategias han demostrado su eficiencia en la transferencia celular de varias cargas, la comprensión del mecanismo de internalización por parte de los CPPs aún está en controversia y el equilibrio entre las vías de endocitosis o la penetración directa sigue siendo difícil de medir^12,13. Aunque se dispone de un conjunto de herramientas y estrategias experimentales para abordar claramente la implicación de los procesos endocíticos, la translocación directa parece, sin embargo, más difícil de caracterizar ya que implica interacciones más discretas con los componentes de la membrana plasmática. Las membranas biológicas suelen estar compuestas por numerosos componentes, desde fosfolípidos hasta proteínas de membrana, que pueden variar según el tipo celular y/o el entorno (condiciones de estrés, división celular, etc.). Esta diversidad de composición, y en consecuencia la ausencia de un modelo universal de membrana celular no permite estudios de una sola manera. Sin embargo, para eludir estas limitaciones, se desarrollaron enfoques paso a paso con membrana artificial o extractos de membrana. Desde pequeñas vesículas unilamelares hasta enfoques monocapa, cada modelo era claramente pertinente para responder preguntas específicas^14,15. Entre ellas, las grandes vesículas unilamelares (LUV) constituyen un modelo de imitación de membrana apropiado para estudiar las interacciones péptido/membrana como un punto clave en el proceso de internalización.

En este contexto, el siguiente protocolo describe la investigación de los efectos de los péptidos y las interacciones péptido/membrana sobre la integridad de las LUV a través de la monitorización tanto de un colorante fluorescente aniónico como de su correspondiente quencher policationico encapsulado en liposomas. Esta herramienta se utiliza para estudiar las interacciones CPP/membrana con el fin de comprender si son capaces de realizar una translocación directa de membrana. Aunque generalmente se aplica para comparar diferentes péptidos que interactúan con la membrana, este ensayo de fuga de fluorescencia LUV también podría usarse para investigar tanto conjugados CPP-carga (estrategia covalente) como complejos CPP:carga (estrategia no covalente).

Por lo tanto, el presente protocolo se ejemplificará por primera vez con los péptidos anfipáticos (WRAP) ricos en triptófano (W) y arginina (R) recientemente desarrollados¹⁶. WRAP es capaz de formar nanopartículas basadas en péptidos para entregar rápida y eficientemente pequeño ARN interferente (siRNA) en varias líneas celulares¹⁶. Se monitorearon las propiedades de fuga de fluorescencia del péptido WRAP solo o las nanopartículas basadas en WRAP cargadas de siRNA para caracterizar su mecanismo de internalización celular. Demostramos que su mecanismo de internalización implicaba principalmente la translocación directa⁷. En un segundo ejemplo, el péptido WRAP se conjudicó covalentemente con el péptido interferente proteína/proteína iCAL36 (WRAP-iCAL36)¹⁷ y su capacidad para desestabilizar membranas se comparó en un ensayo de fuga de fluorescencia con iCAL36 acoplado a Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36), otro CPP.

Finalmente, se discutirán las ventajas y limitaciones del método tanto desde un punto de vista tecnológico como con respecto a la relevancia biológica.

Protocolo

1. Preparación de vesículas unilamelares grandes (LUV)

1. Prepare luVs para su uso como imitadores de membrana celular para el ensayo de fuga de fluorescencia.
2. Mezclar con una jeringa de vidrio Hamilton fosfatidilcolina (DOPC, 786.11 g/mol), esfingomielina (SM, 760.22 g/mol) y colesterol (Chol, 386.65 g/mol) en la relación molar 4:4:2. La solución lipídica se obtiene a partir de una solución stock de cada lípido solubilizado en un disolvente de metanol/cloroformo (3/1; volumen/volumen) a 25 mg/ml en un matraz de fondo redondo de vidrio de 25 ml. Sobre la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM y 2 μmol de Chol, la solución lipídica se obtiene de la solución stock mezclando 126 μL, 117 μL y 31 μL, respectivamente.
   PRECAUCIÓN: El metanol es un disolvente tóxico e inflamable y el cloroformo es tóxico y cancerígeno. Ambos deben manipularse con la protección adecuada bajo un capó.
3. Evaporar metanol/cloroformo utilizando un evaporador rotativo al vacío durante 45-60 min a 60 °C hasta la formación de una película lipídica seca.
4. Prepare dos soluciones de búfer HEPES de stock. Prepare el tampón HEPES 1 mezclando 20 mM HEPES (238,3 g/mol) y 75 mM NaCl (58,44 g/mol) y ajuste el pH a 7,4. Prepare el tampón HEPES 2 mezclando HEPES de 20 mM y NaCl de 145 mM y ajuste el pH a 7.4. Los tampones HEPES se pueden almacenar a 4 °C durante 1 mes.
   NOTA: Se recomienda comprobar la osmolaridad de los buffers utilizando un osmómetro.
5. Preparar la solución de hidratación lipídica disolviendo la membrana impermeable fluorescente colorante-quencher couple, 8-aminonaphthalene-1, 3, ácido 6-trisulfónico, sal disódica a 12.5 mM (ANTS, 427.33 g / mol) y bromuro de p-xileno-bispiridinio a 45 mM (DPX, 422.16 g / mol) en solución tampón HEPES. La mezcla de ANTS con DPX conduce a una solución de color amarillo. Para alcanzar las concentraciones de 12,5 mM de ANTS y 45 mM de DPX, disolver 21,4 mg y 76 mg, respectivamente en 4 mL de tampón HEPES 1.
   NOTA: La solución de hidratación lipídica se puede almacenar durante 2 semanas a 4 °C envolviendo el tubo con papel de aluminio.
6. Reconstituir vesículas multilamelares (MLV) resuspiendo la película lipídica seca con 1 ml de la solución de hidratación lipídica y vórtice hasta la disolución de la película lipídica seca. Asegúrese de que la solución esté completamente solubilizada, ya que los pequeños agregados lipídicos tendrán un impacto negativo en los pasos anteriores. Además, revise la pared del matraz de fondo redondo de vidrio para asegurarse de que no quede una película lipídica.
   NOTA: La solución aparecerá opalescente y de color amarillo claro después de la solubilización.
7. Someta las vesículas a cinco ciclos de congelación/descongelación para obtener vesículas unilamelares. Realice cada ciclo colocando el matraz de fondo redondo de vidrio durante 30 s en nitrógeno líquido para el paso de congelación, luego dejándolo en un baño de agua durante 2 minutos para el paso de descongelación.
   NOTA: La temperatura del agua del baño debe ser 5-10 ° C más alta que la temperatura de fusión de los lípidos.
8. Prepare la extrusora de lípidos insertando dos soportes de filtro humidificados preliminares con tampón HEPES en cada pieza extrusora de politetrafluoroetileno (PTFE) colocada en el recipiente de la extrusora de metal.
9. Coloque una membrana de policarbonato humidificado HEPES (tamaño de poro de 0,1 μm, diámetro de 25 mm) en la parte superior de un soporte de filtro.
10. Monta los dos botes de extrusora de metal y atornícalos.
11. Coloque la extrusora ensamblada en el soporte e introduzca una jeringa de 1 ml en el orificio apropiado en la extremidad de cada pieza extrusora de politetrafluoroetileno. La extrusión corresponde al paso del líquido probado de una jeringa a la otra a través de la membrana de policarbonato.
12. Pruebe la extrusora con 1 ml de tampón HEPES cargado en una de las jeringas de 1 ml para asegurarse de que no haya fugas ni problemas.
13. Reemplace el búfer HEPES de 1 ml con la muestra MLV.
14. Realice la extrusión pasando la muestra de MLV de una jeringa a la otra a través de la membrana de policarbonato al menos 21 veces para obtener LUV uniformes del mismo tamaño.
    NOTA: La extrusión debe realizarse a una temperatura superior a la temperatura de fusión de la mezcla lipídica.

2. Purificación de LUVs

1. Prepare una purificación de columna para eliminar el exceso de ANTS y DPX no encapsulados.
2. Introducir gel de dextrano reticulado (G-50) resuspendido en medio acuoso con 0,01% de NaN₃ (65 g/mol) en una columna de cromatografía líquida (Luer Lock, sin camisa, 1,0 cm x 20 cm, volumen de cama 16 mL) hasta 1 cm por debajo de la parte superior de la parte incolora de la columna.
3. Abra el grifo y deje que el líquido fluya para asentar el gel de dextrano reticulado.
4. Lave la columna eluyendo con 20 ml de tampón HEPES 2 y descarte el flujo de salida de la columna.
5. Cierre el grifo una vez que se minimice el volumen muerto de disolvente por encima de la columna (<100 μL) pero suficiente para evitar cualquier secado del gel de dextrano reticulado.
6. Coloque las UD recién extruidas (amarillas) en la columna y déjelas entrar en el gel de dextrano reticulado.
7. Agregue continuamente el búfer HEPES 2 a la columna para realizar la purificación luV.
8. Elute aproximadamente 2 ml de tampón HEPES 2 (no olvide llenar regularmente la parte superior de la columna para evitar secar el gel de dextrano reticulado): la solución de ANTS y DPX amarillo libre migra más lentamente que los liposomas.
9. Comience a recolectar LUV purificadas en tubos (1.5 ml).
10. Observe las gotas de eluyente de la columna y cuando se vuelven opalescentes, contienen liposomas. Cambie el tubo para recuperar la fracción que contiene LUV.
11. Elute hasta que las gotas ya no sean opalescentes (~1 mL). Después, eluir otros 0,5 ml en una fracción separada y luego dejar de eluir.
    NOTA: Los estándares ahora están disponibles en una amplia gama de pesos moleculares, como kits o pesos moleculares individuales para calibrar el volumen de elución de los LUV.
12. Envuelva los tubos con los LUV en papel de aluminio para evitar el blanqueo del tinte de fluorescencia.
13. Lavar la columna con tampón HEPES 2 de 20 ml.
14. Los UDV se pueden almacenar durante una semana a 4 °C.
    NOTA: Dado que la estabilidad de la LUV puede depender de la concentración y composición de la LUV, así como de la fuerza iónica, el tamaño de las LUV debe controlarse mediante un instrumento de dispersión dinámica de la luz (DLS) (ver sección 4. Caracterización del tamaño y homogeneidad de LUV) antes de cada prueba.

3. Cuantificación de la concentración de UDV

1. Estimar la concentración de LUV mediante un kit de cuantificación de fosfolípidos, que permite la evaluación de la concentración de colina¹⁹. Este ensayo podría aplicarse cuando los fosfolípidos con colina que contienen cabeza polar son sustanciales (>50% de las LU).
2. Prepare el reactivo de color disolviendo 18 mg de sustrato de cromógeno en 3 ml de tampón proporcionado.
3. Cargue una cubeta de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, con 3 ml de reactivo de color.
4. Utilice el reactivo de color puro como condición en blanco (Blank). Añadir 20 μL de muestra de LUV (ensayo) o 20 μL de solución patrón de concentración conocida de colina (estándar).
5. Mezclar bien e incubar durante 5 min a 37 °C todas las condiciones (Blank, Test y Standard).
6. Mida la absorbancia (densidad óptica, OD) de la muestra de prueba y la solución estándar con la solución en blanco como control a 600 nm con un espectrofotómetro.
7. Compruebe los valores de OD que permiten estimar la concentración de lípidos de las UDV, C[LUV], en equivalente de colina en comparación con el estándar de concentración conocida.
8. Realice el cálculo utilizando la siguiente ecuación:
   C[LUV] (mol / l) = (Muestra OD / Estándar OD) x C[Estándar] (mol / l)
   NOTA: El kit de cuantificación de fosfolípidos proporcionó una solución estándar de cloruro de colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL correspondiente a la concentración molar de C[Standard] = 3,87 mmol/L. Muestra de OD y Estándar de OD son las absorbancias medidas a 600 nm para las soluciones de LUV y colina, respectivamente.

4. Caracterización del tamaño y homogeneidad de luV

1. Realice una medición utilizando un instrumento DLS para determinar el tamaño de LUV (en nm) y el índice de polidispersidad (PdI).
2. Programe el "procedimiento de operación estándar" (SOP) apropiado indicando la viscosidad del solvente / tampón y la cubeta utilizada.
3. Coloque 500 μL de la solución de LUV en una cubeta semi-micro de poliestireno.
4. Inserte la cubeta semi-micro de poliestireno en un instrumento DLS.
5. A temperatura ambiente, mida la distribución del tamaño en términos de tamaño medio (promedio Z) de la distribución de partículas y de homogeneidad (índice de polidispersidad, PdI).
6. Todos los resultados se obtienen a partir de dos mediciones independientes realizadas cada una en tres ciclos repetitivos.
   NOTA: Los valores estándar para luVs serán un tamaño medio de 137 ± 7 nm con un PdI de 0.149 ± 0.041.

5. Preparación de soluciones peptídicas

1. Prepare una solución de stock del péptido, que debe analizarse para el ensayo de fuga.
2. Disolver el polvo peptídico (>95% de pureza) en agua pura (por ejemplo, 1 mg de péptido en agua pura de 500 μL).
   NOTA: Se recomienda diluir los péptidos en agua pura y evitar la solubilización con dimetilsulfóxido (DMSO), que podría inducir artefactos (por ejemplo, permeabilización de membrana^20).
3. Vórtice la solución peptídica durante 5 s.
4. Sonicar la solución peptídica en un baño de sonicación en agua durante 5 min y luego centrifugar durante 5 min a 12,225 x g. Recoger el sobrenadante para la determinación de la concentración.
5. Mida la absorbancia a 280 nm de tres diluciones peptídicas independientes y luego calcule la concentración de péptidos utilizando su coeficiente de extinción molar ε (dependiendo del contenido de triptófano y tirosina en la secuencia peptídica) y la regla de Beer-Lambert.
   NOTA: Si el péptido contiene triptófano y tirosina, el coeficiente de extinción molar ε se calcula sobre la base de triptófano ε = 5.690 M^-1cm^-1 y tirosina ε = 1.280 M^-1cm^-1. Si la secuencia peptídica no contiene triptófano ni tirosina, se podría realizar otro ensayo colorimétrico para medir la concentración (por ejemplo, BCA o Bradford).
6. Diluir la solución peptídica en agua pura hasta una solución final de 100 μM y almacenar a 4 °C.
   NOTA: En agua pura, no se produce degradación peptídica durante el almacenamiento a 4 °C. Sin embargo, la concentración de péptidos debe medirse cada 2 semanas para garantizar que no se produzca evaporación del agua.

6. Ensayo de fuga de fluorescencia

1. El ensayo de fuga de fluorescencia se mide en un espectrofluorómetro a temperatura ambiente. La longitud de onda de excitación y emisión se fija en Ex = 360 nm ± 3 nm y Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.
2. Diluya las LUV en 1 ml del tampón HEPES 2 a una concentración final de 100 μM en una cubeta de fluorescencia de cuarzo. Agregue un agitador magnético para homogeneizar la solución durante el experimento.
3. Mida las UDVs solas durante los primeros 100 s, entre t = 0 s y t = 99 s para acceder a la fluorescencia de fondo.
   NOTA: Las LUVs por sí solas también se pudieron medir durante todo el experimento (15 min) para acceder a la fluorescencia de fondo y las posibles fugas.
4. A partir de entonces, mida la fuga como un aumento en la intensidad de la fluorescencia tras la adición de alícuotas de solución peptídica durante los próximos 900 s (15 min). Este protocolo se lleva a cabo para cada concentración de péptido ensayada de 0,1 μM a 2,5 μM.
5. Finalmente, se logró una fluorescencia del 100% mediante la solubilización de las LUV mediante la adición de 1 μL de Tritón X-100 (0,1%, v/v), dando como resultado la sonda completamente insaciada entre t = 1.000 s y t = 1.100 s.

7. Cuantificación de la fuga

1. Suprimir los valores obtenidos después de t = 1.090 s con el fin de mantener el mismo número de puntos para cada condición probada.
2. Calcule la fluorescencia mínima, F_min,haciendo el promedio de 50 puntos entre t = 0 s y t = 49 s (LUVs solas).
3. Calcular la fluorescencia máxima, F_max,haciendo la media de 50 puntos entre t = 1.041 s y t = 1.090 s (LUVs con Tritón X-100).
4. Calcule el porcentaje de fuga (%Fuga) en cada punto de tiempo (t = x), de acuerdo con la siguiente ecuación:
   %Fuga_(t=x) = (F_(t=x) - F_min) / (F_max - F_min) x 100
5. Calcular la media y la desviación estándar para los valores obtenidos con diferentes preparaciones de LUV (n ≥ 2) para la misma condición.
6. Trazar el porcentaje de fuga, %Fuga_(t=x), en función del tiempo (s).

Resultados

El principio del ensayo de fuga de fluorescencia se muestra en la Figura 1. En detalle, las grandes vesículas unilamelares (LUV) que encapsulan un tinte fluorescente y un quencher (sin señal de fluorescencia) se tratan con la biomolécula de interés. Debido a la interacción del péptido con las membranas lipídicas, lo que podría implicar permeabilidad de la membrana, reorganización o incluso ruptura, el colorante de fluorescencia y el quencher se liber...

Discusión

El ensayo de fuga de fluorescencia presentado es un método simple y rápido para abordar la desestabilización de la membrana por péptido que penetra en la célula. Fácil de hacer, también permite una comparación indirecta entre diferentes péptidos que interactúan con la membrana u otras moléculas que interactúan con la membrana. En cuanto a los pasos críticos del protocolo, ya que este ensayo proporciona valores relativos entre la línea de base (LUVs solas) y la liberación máxima de fluorescencia (condició...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mL glass round-bottom flask	Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)	Invitrogen	A350	Protect from light
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)	Avanti Polar	850375P	Protect from air
Extruder	Avanti Polar	610000
Fluorimeter	PTI Serlabo
50 µL glass syringe	Hamilton	705N
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
LabAssay Phospholipid	WAKO	296-63801
liquid chromatography column	Sigma-Aldrich
Methanol	Carlo Erba	414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter)	Whatman	800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm	Grener Bio-One	614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS	Fisher Scientific	FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)	Invitrogen	X1525	Protect from light
quartz fluorescence cuvette	Hellma	109.004F-QS
rotavapor system	Heidolph	Z334898
Sephadex G-50 resin	Amersham	17-0042-01
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sonicator bath USC300T	VWR	142-6001
Sphingomyelin	Avanti Polar	860062P	Protect from air
Triton X-100	Eromedex	2000-B
Zetaziser NanoZS	Malvern	ZEN3500