Test de fuite fluorescente pour étudier la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules

Résumé

Le test de fuite de fluorescence est une méthode simple qui permet d’enquêter sur les interactions peptide/membrane afin de comprendre leur implication dans plusieurs processus biologiques et en particulier la capacité des peptides pénétrants dans les cellules à perturber les bicouches de phospholipides lors d’un processus de translocation cellulaire directe.

Résumé

Les peptides pénétrant dans les cellules (CPP) sont définis comme des transporteurs capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules. L’une des principales caractéristiques communes requises pour cette activité résultait des interactions des CPP avec la membrane plasmique (lipides) et plus particulièrement avec les composants de la matrice extracellulaire de la membrane elle-même (sulfate d’héparane). En effet, indépendamment de la translocation directe ou de l’internalisation dépendante de l’endocytose, les bicouches lipidiques sont impliquées dans le processus d’internalisation tant au niveau de la membrane plasmique qu’au niveau du trafic intracellulaire (vésicules endosomales). Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé décrivant les différentes étapes de la formulation, de la purification, de la caractérisation et de l’application d’une grande vésicule unilamellaire (LV) dans le test de fuite de fluorescence afin de détecter une éventuelle déstabilisation/interaction CPP-membrane et d’aborder leur rôle dans le mécanisme d’internalisation. Des LV avec une composition lipidique reflétant la teneur en membrane plasmique sont générés afin d’encapsuler à la fois un colorant fluorescent et un quencher. L’ajout de peptides dans le milieu extravésiculaire et l’induction d’interactions peptide-membrane sur les LV pourraient ainsi induire de manière dose-dépendante une augmentation significative de la fluorescence révélant une fuite. Des exemples sont fournis ici avec les peptides amphipathiques (W) riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés, qui ont montré une administration rapide et efficace de siRNA dans diverses lignées cellulaires. Enfin, la nature de ces interactions et l’affinité pour les lipides sont discutées pour comprendre et améliorer la translocation membranaire et/ou l’échappement endosomal.

Introduction

Après leur découverte dans les années quatre-vingt-dix, des peptides pénétrant dans les cellules (CPP) ont été développés pour favoriser une livraison cellulaire efficace des cargaisons à travers la membrane^{plasmique 1,2.} Les CPP sont généralement des peptides courts, généralement de 8 à 30 acides aminés, ayant une grande variété d’origines. Ils ont d’abord été définis comme des porteurs « à translocation directe », ce qui signifie qu’ils étaient capables de traverser la membrane plasmique et de transférer une cargaison dans les cellules indépendamment de toute voie endocytotique, ni besoin en énergie ni implication des récepteurs. Cependant, d’autres investigations ont révélé que ces premières observations provenaient principalement d’une surestimation de la fluorescence due à l’artefact expérimental et/ou à des protocoles de fixation utilisant du méthanol^3. De nos jours, il est largement admis que l’absorption du RPC se fait à la fois par endocytose et par translocation indépendante de l’énergie^4,5,6,7 en fonction de différents paramètres tels que la nature de la cargaison, le lien utilisé entre le CPP et la cargaison, la lignée cellulaire étudiée, etc.

Les CPP peuvent être utilisés comme agents de transfection selon deux stratégies, impliquant soit un lien chimique (stratégie covalente), soit des interactions électrostatiques/hydrophobes (stratégie non covalente) entre le CPP et sa cargaison^8,9,10,11. Bien que les deux stratégies aient montré leur efficacité dans le transfert cellulaire de plusieurs cargaisons, la compréhension du mécanisme d’internalisation par les CPP est encore controversée et l’équilibre entre les voies d’endocytose ou la pénétration directe est encore difficile à mesurer^12,13. Bien qu’un ensemble d’outils et de stratégies expérimentaux soient disponibles pour aborder clairement l’implication des processus endocytaires, la translocation directe semble toutefois plus difficile à caractériser car elle implique des interactions plus discrètes avec les composants de la membrane plasmique. Les membranes biologiques sont généralement composées de nombreux composants, des phospholipides aux protéines membranaires, qui peuvent varier selon le type cellulaire et/ou l’environnement (conditions de stress, division cellulaire, etc.). Cette diversité de composition, et par conséquent l’absence d’un modèle universel de membrane cellulaire ne permet pas des études d’une seule manière. Cependant, pour contourner ces limitations, des approches étape par étape ont été développées avec des membranes artificielles ou des extraits de membrane. Des petites vésicules unilamellaires aux approches monocouches, chaque modèle était clairement pertinent pour répondre à des questions spécifiques^14,15. Parmi eux, les grandes vésicules unilamellaires (LV) constituent un modèle membranaire approprié pour étudier les interactions peptide/membrane comme étant un point clé du processus d’internalisation.

Dans ce contexte, le protocole suivant décrit l’étude des effets des peptides et des interactions peptide/membrane sur l’intégrité des LV grâce à la surveillance d’un colorant fluorescent anionique et de son quencher poly-cationique correspondant encapsulé dans des liposomes. Cet outil est utilisé pour étudier les interactions CPP/membrane afin de comprendre s’ils sont capables d’effectuer une translocation membranaire directe. Bien qu’il soit généralement appliqué pour comparer différents peptides interagissant avec la membrane, ce test de fuite de fluorescence LUV pourrait également être utilisé pour étudier à la fois les conjugués CPP-cargo (stratégie covalente) et les complexes CPP:cargo (stratégie non covalente).

Le présent protocole sera donc d’abord illustré avec les peptides amphipathiques riches en tryptophane (W) et en arginine (R) récemment développés^16. WRAP est capable de former des nanoparticules à base de peptides pour délivrer rapidement et efficacement de petits ARN interférents (siRNA) dans plusieurs lignées cellulaires^16. Les propriétés de fuite de fluorescence du peptide WRAP seul ou des nanoparticules à base de WRAP chargées de siRNA ont été surveillées pour caractériser leur mécanisme d’internalisation cellulaire. Nous avons montré que leur mécanisme d’internalisation impliquait principalement une translocation directe^7. Dans un deuxième exemple, le peptide WRAP a été conjugué de manière covalente au peptide interférent protéine/protéine iCAL36 (WRAP-iCAL36)¹⁷ et sa capacité à déstabiliser les membranes a été comparée dans un test de fuite de fluorescence à iCAL36 couplé à Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36), un autre CPP.

Enfin, les avantages et les limites de la méthode seront discutés à la fois d’un point de vue technologique et en ce qui concerne la pertinence biologique.

Protocole

1. Préparation de grandes vésicules unilamellaires (LV)

1. Préparez les LV pour leur utilisation comme imitations de membrane cellulaire pour le test de fuite de fluorescence.
2. Mélanger avec une seringue en verre Hamilton phosphatidylcholine (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyéline (SM, 760,22 g/mol) et cholestérol (Chol, 386,65 g/mol) au rapport molaire 4:4:2. La solution lipidique est obtenue à partir d’une solution type de chaque lipide solubilisé dans un solvant méthanol/chloroforme (3/1; volume/volume) à 25 mg/mL dans une fiole à fond rond en verre de 25 mL. Sur la base de 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM et 2 μmol de Chol, la solution lipidique est obtenue à partir d’une solution stock en mélangeant respectivement 126 μL, 117 μL et 31 μL.
   ATTENTION : Le méthanol est un solvant toxique et inflammable et le chloroforme est toxique et cancérigène. Les deux doivent être manipulés avec la protection appropriée sous une hotte.
3. Évaporer le méthanol/chloroforme à l’aide d’un évaporateur rotatif sous vide pendant 45 à 60 min à 60 °C jusqu’à la formation d’un film lipidique séché.
4. Préparez deux solutions tampons HEPES en stock. Préparer le tampon HEPES 1 en mélangeant 20 mM hePES (238,3 g/mol) et 75 mM de NaCl (58,44 g/mol) et ajuster le pH à 7,4. Préparer le tampon HEPES 2 en mélangeant 20 mM HEPES et 145 mM naCl et ajuster le pH à 7,4. Les tampons HEPES peuvent être conservés à 4 °C pendant 1 mois.
   REMARQUE: Il est recommandé de vérifier l’osmolarité des tampons à l’aide d’un osmomètre.
5. Préparer la solution d’hydratation lipidique en dissolvant le couple colorant-quencher fluorescent imperméable à membrane, l’acide 8-aminonaphtalène-1, 3, 6-trisulfonique, le sel disodique à 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) et le bromure de p-xylène-bispyridinium à 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) dans une solution tampon HEPES. Le mélange d’ANTS avec DPX conduit à une solution de couleur jaune. Pour atteindre les concentrations de 12,5 mM d’ANTS et de 45 mM de DPX, dissoudre respectivement 21,4 mg et 76 mg dans 4 mL de tampon HEPES 1.
   REMARQUE: La solution d’hydratation lipidique peut être conservée pendant 2 semaines à 4 ° C en enveloppant le tube avec du papier d’aluminium.
6. Reconstituer les vésicules multilamellaires (MLV) en resusmettant le film lipidique séché avec 1 mL de la solution d’hydratation lipidique et en vortexant jusqu’à dissolution du film lipidique séché. Assurez-vous que la solution est complètement solubilisée car de petits agrégats lipidiques auront un impact négatif sur les étapes précédentes. Vérifiez également la paroi de la fiole à fond rond en verre pour vous assurer qu’il ne reste pas de film lipidique.
   REMARQUE: La solution apparaîtra opalescente et jaune clair après la solubilisation.
7. Soumettre les vésicules à cinq cycles de congélation/dégel pour obtenir des vésicules unilamellaires. Effectuez chaque cycle en mettant la fiole à fond rond en verre pendant 30 s dans de l’azote liquide pour l’étape de congélation, puis en la laissant au bain-marie pendant 2 min pour l’étape de décongélation.
   REMARQUE: La température de l’eau du bain doit être supérieure de 5 à 10 ° C à la température de fusion des lipides.
8. Préparez l’extrudeuse lipidique en insérant deux supports filtrants préliminaires humidifiés avec un tampon HEPES dans chaque pièce d’extrudeuse en polytétrafluoroéthylène (PTFE) placée dans la cartouche de l’extrudeuse métallique.
9. Placez une membrane en polycarbonate humidifié HEPES (taille des pores de 0,1 μm, diamètre de 25 mm) sur le dessus d’un support de filtre.
10. Assemblez les deux bidons d’extrudeuse métallique et vissez-les.
11. Placez l’extrudeuse assemblée dans le support et introduisez une seringue de 1 mL dans le trou approprié à l’extrémité de chaque pièce d’extrudeuse en polytétrafluoroéthylène. L’extrusion correspond au passage du liquide testé d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate.
12. Testez l’extrudeuse avec 1 mL de tampon HEPES chargé dans l’une des seringues de 1 mL pour vous assurer qu’il n’y a pas de fuites ou de problèmes.
13. Remplacez le tampon HEPES de 1 mL par l’échantillon MLV.
14. Effectuer l’extrusion en faisant passer l’échantillon de MLV d’une seringue à l’autre à travers la membrane en polycarbonate au moins 21 fois pour obtenir des LV uniformes de même taille.
    REMARQUE: L’extrusion doit être effectuée à une température supérieure à la température de fusion du mélange lipidique.

2. Purification des LV

1. Préparez une purification de colonne pour éliminer l’excès d’ANTS et de DPX non encapsulés.
2. Introduire le gel de dextran réticulé (G-50) mis enssais en milieu aqueux avec 0,01 % de NaN₃ (65 g/mol) dans une colonne de chromatographie liquide (Luer Lock, non gainé, 1,0 cm x 20 cm, volume du lit 16 mL) jusqu’à 1 cm sous le haut de la partie incolore de la colonne.
3. Ouvrez le robinet et laissez le liquide s’écouler pour déposer le gel de dextran réticulé.
4. Lavez la colonne en éluant avec 20 mL de tampon HEPES 2 et éliminez le débit de sortie de la colonne.
5. Fermez le robinet une fois que le volume mort de solvant au-dessus de la colonne est minimisé (<100 μL) mais suffisant pour éviter tout séchage du gel de dextran réticulé.
6. Placez les LLU fraîchement extrudés (jaunes) sur la colonne et laissez-les entrer dans le gel de dextran réticulé.
7. Ajoutez continuellement le tampon HEPES 2 à la colonne pour effectuer la purification LUV.
8. Éluez environ 2 mL de tampon HEPES 2 (n’oubliez pas de remplir régulièrement le haut de la colonne pour éviter de sécher le gel de dextran réticulé) : la solution jaune libre d’ANTS et de DPX migre plus lentement que les liposomes.
9. Commencez à collecter les LV purifiés dans des tubes (1,5 mL).
10. Observez les gouttes d’éluant de la colonne et lorsqu’elles deviennent opalescentes, elles contiennent des liposomes. Changez le tube pour récupérer la fraction contenant du LUV.
11. Éluez jusqu’à ce que les gouttes ne soient plus opalescentes (~1 mL). Ensuite, éluez encore 0,5 mL dans une fraction séparée, puis arrêtez d’éluer.
    REMARQUE: Les étalons sont maintenant disponibles dans une large gamme de poids moléculaires, sous forme de kits ou de poids moléculaires individuels pour calibrer le volume d’élution des LV.
12. Enveloppez les tubes avec les LUN dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment du colorant de fluorescence.
13. Lavez la colonne avec un tampon HEPES de 20 mL 2.
14. Les LV peuvent ensuite être conservés pendant une semaine à 4 °C.
    REMARQUE: Comme la stabilité du LUV peut dépendre de la concentration et de la composition du LUV, ainsi que de la force ionique, la taille des LUV doit être contrôlée à l’aide d’un instrument de diffusion dynamique de la lumière (DLS) (voir rubrique 4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV) avant chaque essai.

3. Quantifier la concentration de LV

1. Estimer la concentration de LUV à l’au moyen d’un kit de quantification des phospholipides, ce qui permet d’évaluer la concentration de choline^19. Ce test peut être appliqué lorsque les phospholipides contenant de la choline contiennent de la tête polaire sont substantiels (>50% des LV).
2. Préparer le réactif colorant en dissolvant 18 mg de substrat chromogène dans 3 mL de tampon fourni.
3. Chargez une cuvette en polystyrène, 10 x 10 x 45 mm, avec 3 mL de réactif de couleur.
4. Utilisez le réactif de couleur pure comme condition vide (blank). Ajouter 20 μL d’échantillon de LUV (essai) ou 20 μL de solution étalon de concentration connue de choline (étalon).
5. Bien mélanger et incuber pendant 5 min à 37 °C dans toutes les conditions (Blank, Test et Standard).
6. Mesurer l’absorbance (densité optique, OD) de l’échantillon d’essai et de la solution étalon avec la solution vierge comme témoin à 600 nm avec un spectrophotomètre.
7. Vérifiez les valeurs OD qui permettent d’estimer la concentration lipidique des LV, C[LUV], en équivalent choline par rapport à la norme de concentration connue.
8. Effectuez le calcul à l’aide de l’équation suivante :
   C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
   REMARQUE: Le kit de quantification des phospholipides a fourni une solution étalon de chlorure de choline (139,6 mg / l) à 54 mg / dL correspondant à la concentration molaire de C [Standard] = 3,87 mmol / L. OD Sample et OD Standard sont les absorbances mesurées à 600 nm pour les solutions LUV et Choline, respectivement.

4. Caractérisation de la taille et de l’homogénéité des LUV

1. Effectuez une mesure à l’aide d’un instrument DLS afin de déterminer la taille du LUV (en nm) et l’indice de polydispersité (PdI).
2. Programmer la « procédure de fonctionnement standard » (SOP) appropriée en indiquant la viscosité du solvant/tampon et de la cuvette utilisée.
3. Placer 500 μL de la solution de LUV dans une cuvette semi-micro en polystyrène.
4. Insérez la cuvette semi-micro en polystyrène dans un instrument DLS.
5. À température ambiante, mesurer la distribution granulométrique en termes de taille moyenne (moyenne Z) de la distribution des particules et d’homogénéité (indice de polydispersité, PdI).
6. Tous les résultats sont obtenus à partir de deux mesures indépendantes effectuées chacune en trois cycles répétitifs.
   REMARQUE: Les valeurs standard pour les LGV seront d’une taille moyenne de 137 ± 7 nm avec un PdI de 0,149 ± 0,041.

5. Préparation de solutions peptidiques

1. Préparez une solution stock du peptide, qui doit être analysée pour le test de fuite.
2. Dissoudre la poudre peptidique (pureté >95 %) dans de l’eau pure (p. ex., 1 mg de peptide dans de l’eau pure de 500 μL).
   REMARQUE: Il est recommandé de diluer les peptides dans de l’eau pure et d’éviter la solubilisation au diméthylsulfoxyde (DMSO), qui pourrait induire des artefacts (par exemple, la perméabilisation membranaire²⁰).
3. Vortex la solution peptidique pendant 5 s.
4. Sonicate la solution peptidique dans un bain de sonication à l’eau pendant 5 min puis centrifuger pendant 5 min à 12 225 x g. Recueillir le surnageant pour la détermination de la concentration.
5. Mesurez l’absorbance à 280 nm de trois dilutions peptidiques indépendantes, puis calculez la concentration peptidique en utilisant son coefficient d’extinction molaire ε (en fonction de la teneur en tryptophane et en tyrosine dans la séquence peptidique) et la règle de Beer-Lambert.
   REMARQUE: Si le peptide contient du tryptophane et de la tyrosine, le coefficient d’extinction molaire ε est calculé sur la base de tryptophane ε = 5 690 M^-1cm^-1 et Tyrosine ε = 1 280 M^-1cm^-1. Si la séquence peptidique ne contient pas de tryptophane ou de tyrosine, un autre test colorimétrique pourrait être effectué pour mesurer la concentration (par exemple, BCA ou Bradford).
6. Diluer la solution peptidique dans de l’eau pure jusqu’à une solution finale de 100 μM et conserver à 4 °C.
   REMARQUE: Dans l’eau pure, aucune dégradation peptidique ne se produit pendant le stockage à 4 °C. Cependant, la concentration en peptides doit être mesurée toutes les 2 semaines pour s’assurer qu’aucune évaporation de l’eau ne se produit.

6. Essai de fuite de fluorescence

1. Le test de fuite de fluorescence est mesuré sur un spectrofluoromètre à température ambiante. La longueur d’onde d’excitation et d’émission est fixée à Ex = 360 nm ± 3 nm et Em = 530 nm ± 5 nm, respectivement.
2. Diluer les LV dans un tampon HEPES 2 de 1 mL jusqu’à une concentration finale de 100 μM dans une cuvette à fluorescence de quartz. Ajouter un agitateur magnétique pour homogénéiser la solution pendant l’expérience.
3. Mesurez les LV seuls pendant les 100 premières s, entre t = 0 s et t = 99 s afin d’accéder à la fluorescence de fond.
   REMARQUE: Les LV seuls ont également pu être mesurés pendant toute l’expérience (15 min) afin d’accéder à la fluorescence de fond et aux fuites potentielles.
4. Par la suite, mesurez la fuite comme une augmentation de l’intensité de fluorescence lors de l’ajout d’aliquotes de solution peptidique pendant les 900 prochaines s (15 min). Ce protocole est réalisé pour chaque concentration de peptide testée de 0,1 μM à 2,5 μM.
5. Enfin, une fluorescence de 100 % a été obtenue en solubilisant les LV par addition de 1 μL de Triton X-100 (0,1 %, v/v), ce qui a donné la sonde complètement non inextinguée entre t = 1 000 s et t = 1 100 s.

7. Quantification de la fuite

1. Supprimer les valeurs obtenues après t = 1 090 s afin de conserver le même nombre de points pour chaque condition testée.
2. Calculer la fluorescence minimale, F_min, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 0 s et t = 49 s (LGV seuls).
3. Calculer la fluorescence maximale, F_max, en faisant la moyenne de 50 points entre t = 1 041 s et t = 1 090 s (LV avec Triton X-100).
4. Calculez le pourcentage de fuite (%Fuite) à chaque point temporel (t = x), selon l’équation suivante :
   %Fuite_(t=x) = (F_(t=x) - F_min) / (F_max - F_min) x 100
5. Calculer la moyenne et l’écart-type pour les valeurs obtenues avec différentes préparations LUV (n ≥ 2) pour la même condition.
6. Tracez le pourcentage de fuite, %Fuite_(t=x),en fonction du ou des temps(s).

Résultats

Le principe du test de fuite de fluorescence est illustré à la figure 1. Dans le détail, de grandes vésicules unilamellaires (LV) encapsulant un colorant fluorescent et un quencher (pas de signal de fluorescence) sont traitées avec la biomolécule d’intérêt. En raison de l’interaction du peptide avec les membranes lipidiques, ce qui pourrait impliquer la perméabilité de la membrane, la réorganisation ou même la rupture, le colorant de fluoresce...

Discussion

Le test de fuite de fluorescence présenté est une méthode simple et rapide pour traiter la déstabilisation de la membrane par un peptide pénétrant dans les cellules. Facile à faire, il permet également une comparaison indirecte entre différents peptides interagissant avec la membrane ou d’autres molécules interagissant avec la membrane. En ce qui concerne les étapes critiques du protocole, comme ce test fournit des valeurs relatives entre la valeur de référence (LV seules) et la libération maximale de flu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mL glass round-bottom flask	Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)	Invitrogen	A350	Protect from light
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)	Avanti Polar	850375P	Protect from air
Extruder	Avanti Polar	610000
Fluorimeter	PTI Serlabo
50 µL glass syringe	Hamilton	705N
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
LabAssay Phospholipid	WAKO	296-63801
liquid chromatography column	Sigma-Aldrich
Methanol	Carlo Erba	414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter)	Whatman	800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm	Grener Bio-One	614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS	Fisher Scientific	FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)	Invitrogen	X1525	Protect from light
quartz fluorescence cuvette	Hellma	109.004F-QS
rotavapor system	Heidolph	Z334898
Sephadex G-50 resin	Amersham	17-0042-01
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sonicator bath USC300T	VWR	142-6001
Sphingomyelin	Avanti Polar	860062P	Protect from air
Triton X-100	Eromedex	2000-B
Zetaziser NanoZS	Malvern	ZEN3500