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Resumo

O ensaio de vazamento de fluorescência é um método simples que permite a investigação de interações peptídeo/membrana a fim de entender seu envolvimento em vários processos biológicos e, especialmente, a capacidade de peptídeos penetrantes de células para perturbar bicamadas de fósforo durante um processo de translocação celular direta.

Resumo

Os peptídeos de penetração celular (CPPs) são definidos como portadores capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para as células. Uma das principais características comuns necessárias para esta atividade resultou das interações de CPPs com a membrana plasmática (lipídios) e mais particularmente com componentes da matriz extracelular da própria membrana (sulfato heparan). De fato, independente da translocação direta ou da internalização dependente da endócita, bicamadas lipídicas estão envolvidas no processo de internalização tanto no nível da membrana plasmática quanto no nível de tráfego intracelular (vesículas endossomais). Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo as diferentes etapas de uma grande formulação de vesículas unilamellar (LUVs) formulação, purificação, caracterização e aplicação no ensaio de vazamento de fluorescência, a fim de detectar possível desestabilização/interação da membrana CPP e abordar seu papel no mecanismo de internalização. LUVs com uma composição lipídica refletindo o teor da membrana plasmática são gerados a fim de encapsular tanto um corante fluorescente quanto um saciador. A adição de peptídeos no meio extravesicular e a indução de interações peptídeo-membrana nos LUVs podem, assim, induzir de forma dependente de dose um aumento significativo da fluorescência revelando um vazamento. Exemplos são fornecidos aqui com o recém-desenvolvido triptofano (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAPs), que mostraram uma entrega rápida e eficiente de siRNA em várias linhas celulares. Finalmente, discute-se a natureza dessas interações e a afinidade com os lipídios para entender e melhorar a translocação da membrana e/ou a fuga endossomal.

Introdução

Após sua descoberta nos anos noventa, peptídeos penetrantes por células (CPPs) foram desenvolvidos para promover uma entrega celular eficiente de cargas através da membrana plasmática1,2. CpPs são geralmente peptídeos curtos, geralmente de 8 a 30 aminoácidos, tendo uma grande variedade de origens. Eles foram definidos pela primeira vez como portadores de "translocação direta", o que significa que eles foram capazes de atravessar a membrana plasmática e transferir uma carga para células independentemente de qualquer via endocítica, nem exigência de energia nem envolvimento receptor. No entanto, investigações posteriores revelaram que essas primeiras observações vieram principalmente da superestimação da fluorescência devido ao artefato experimental e/ou aos protocolos de fixação usando metanol3. Atualmente, é amplamente aceito que a captação de CPP ocorra tanto pela endocitose quanto pela translocação independente de energia4,5,6,7 dependendo de diferentes parâmetros como a natureza da carga, o elo utilizado entre CPP e carga, a linha celular estudada, etc.

As CPPs podem ser utilizadas como agentes de transfecção de acordo com duas estratégias, envolvendo uma ligação química (estratégia covalente) ou interações eletrostáticas/hidrofóbicas (estratégia não covalente) entre o CPP e sua carga8,9,10,11. Embora ambas as estratégias tenham demonstrado sua eficiência na transferência celular de várias cargas, o entendimento do mecanismo de internalização pelas CPPs ainda está sob controvérsia e o equilíbrio entre vias de endocitose ou penetração direta ainda é difícil de medir12,13. Embora um conjunto de ferramentas e estratégias experimentais estejam disponíveis para abordar claramente o envolvimento de processos endocíticos, a translocação direta parece, no entanto, mais difícil de caracterizar, pois implica interações mais discretas com componentes da membrana plasmática. As membranas biológicas são geralmente compostas de inúmeros componentes, desde fosfolipídios até proteínas de membrana, que podem variar de acordo com o tipo celular e/ou o ambiente (condições de estresse, divisão celular, etc.). Essa diversidade de composição e, consequentemente, a ausência de um modelo universal de membrana celular não permite estudos de uma única forma. No entanto, para contornar essas limitações, foram desenvolvidas abordagens passo a passo com extratos artificiais de membrana ou membrana. Desde pequenas vesículas unilamellar até abordagens de monocamadas, cada modelo era claramente pertinente para responder a perguntas específicas14,15. Entre elas, as grandes vesículas unilamellar (LUVs) constituem um modelo de imitação de membrana adequada para estudar as interações peptídeo/membrana como um ponto-chave no processo de internalização.

Neste contexto, o protocolo a seguir descreve a investigação dos efeitos dos peptídeos e interações peptídeo/membrana na integridade luvs através do monitoramento de um corante fluorescente aniônico e seu correspondente quencher poli-cártalico encapsulado em lipossomos. Esta ferramenta é usada para estudar interações CPP/membrana, a fim de entender se elas são capazes de realizar uma translocação direta de membrana. Embora geralmente aplicado para comparar diferentes peptídeos que interagem por membrana, este ensaio de vazamento de fluorescência LUV também pode ser usado para investigar tanto conjugados CPPs-carga (estratégia covalente) quanto complexos de carga CPP (estratégia não covalente).

O presente protocolo será, portanto, exemplificado pela primeira vez com o triptofano recentemente desenvolvido (W)- e arginina (R)-rich Amphipathic Peptídeos (WRAP)16. O WRAP é capaz de formar nanopartículas baseadas em peptídeos para fornecer de forma rápida e eficiente RNA (siRNA) em várias linhas celulares16. As propriedades de vazamento de fluorescência apenas do peptídeo WRAP ou nanopartículas baseadas em WRAP carregadas de siRNA foram monitoradas para caracterizar seu mecanismo de internalização celular. Mostramos que seu mecanismo de internalização envolvia principalmente a translocação direta7. Em um segundo exemplo, o peptídeo WRAP foi covalentemente conjugado ao peptídeo de interfertídeo iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 e sua capacidade de desestabilizar membranas foi comparada em um ensaio de vazamento de fluorescência ao iCAL36 acoplado à Penetratin18 (Penetratin-iCAL36), outra CPP.

Por fim, serão discutidas as vantagens e limitações do método tanto do ponto de vista tecnológico quanto no que diz respeito à relevância biológica.

Protocolo

1. Preparação de Grandes Vesículas Unilamellar (LUVs)

  1. Prepare luvs para seu uso como mímica de membrana celular para ensaio de vazamento de fluorescência.
  2. Misture com uma fosfardolina de vidro Hamilton (DOPC, 786,11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760,22 g/mol) e Colesterol (Chol, 386,65 g/mol) na razão molar 4:4:2. A solução lipídica é obtida a partir de uma solução de estoque de cada lipídio solubilizado em um solvente de fundo redondo de metanol/clorofórmio (3/1; volume/volume) a 25 mg/mL em um frasco de vidro de 25 mL de fundo redondo. Com base em 4 μmol de DOPC, 4 μmol de SM e 2 μmol de Chol, a solução lipídica é obtida a partir da solução de estoque misturando 126 μL, 117 μL e 31 μL, respectivamente.
    ATENÇÃO: O metanol é um solvente tóxico e inflamável e o clorofórmio é tóxico e cancerígeno. Ambos devem ser tratados com a proteção adequada sob um capô.
  3. Evaporar metanol/clorofórmio usando um evaporador rotativo sob vácuo durante 45-60 min a 60 °C até a formação de um filme lipídudo seco.
  4. Prepare duas soluções de buffer HEPES de estoque. Prepare o buffer HEPES 1 misturando HEPES de 20 mM (238,3 g/mol) e 75 mM NaCl (58,44 g/mol) e ajuste o pH para 7,4. Prepare o buffer HEPES 2 misturando HEPES de 20 mM e 145 mM NaCl e ajuste o pH para 7,4. Os buffers HEPES podem ser armazenados a 4 °C durante 1 mês.
    NOTA: Recomenda-se verificar a osmolaridade dos buffers usando um osmômetro.
  5. Prepare a solução de hidratação lipídica dissolvendo o casal fluorescente fluorescente de corante-quencher, 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfônico ácido, sal dissudium a 12,5 mM (ANTS, 427,33 g/mol) e brometo p-xileno-bispiroriano a 45 mM (DPX, 422,16 g/mol) na solução tampão HEPES. Misturar ANTS com DPX leva a uma solução de cor amarela. Para alcançar as concentrações de 12,5 mM de ANTS e 45 mM de DPX, dissolva 21,4 mgs e 76 mgs, respectivamente em 4 mL de tampão HEPES 1.
    NOTA: A solução de hidratação lipídica pode ser armazenada por 2 semanas a 4 °C, enrolando o tubo com papel alumínio.
  6. Reconstituir vesículas multilamellar (MLV) reutilizando o filme lipídigo seco com 1 mL da solução de hidratação lipídica e por vórtice até a dissolução do filme lipídado seco. Certifique-se de que a solução seja completamente solubilizada, pois pequenos agregados lipíduos afetarão negativamente as etapas anteriores. Além disso, verifique a parede do frasco de fundo redondo de vidro para garantir que não haja filme lipídedo restante.
    NOTA: A solução aparecerá opalescente e amarela clara após a solubilização.
  7. Sujeitar as vesículas a cinco ciclos de congelamento/degelo para obter vesículas unilamellar. Realize cada ciclo colocando o frasco de fundo redondo de vidro por 30 s em nitrogênio líquido para congelar passo, em seguida, deixando-o em um banho de água por 2 minutos para o passo de descongelamento.
    NOTA: A temperatura da água do banho deve ser 5-10°C maior do que a temperatura de fusão dos lipídios.
  8. Prepare a extrusora lipídica inserindo dois suportes de filtro umidificados preliminarmente com tampão HEPES em cada peça extrusora de politetrafluoroetileno (PTFE) colocada no recipiente de extrusor metálico.
  9. Coloque uma membrana de policarbonato umidificado HEPES (tamanho de poros de 0,1 μm, 25 mm de diâmetro) na parte superior de um suporte de filtro.
  10. Monte os dois recipientes de extrusora de metal e enrosque-os.
  11. Coloque a extrusora montada no suporte e introduza uma seringa de 1 mL no orifício apropriado na extremidade de cada peça extrusora de politetrafluoroetileno. A extrusão corresponde à passagem do líquido testado de uma seringa para outra através da membrana de policarbonato.
  12. Teste a extrusora com 1 mL de tampão HEPES carregado em uma das seringas de 1 mL para garantir que não haja vazamentos ou problemas.
  13. Substitua o tampão HEPES de 1 mL com a amostra MLV.
  14. Realize a extrusão passando a amostra de MLV de uma seringa para outra através da membrana de policarbonato pelo menos 21 vezes para obter LUVs uniformes do mesmo tamanho.
    NOTA: A extrusão deve ser realizada a uma temperatura superior à temperatura de fusão da mistura lipídica.

2. Purificação de LUVs

  1. Prepare uma purificação de coluna para remover o excesso de ANTS e DPX não encapsulados.
  2. Introduzir gel dextran transversal (G-50) resuspendido em meio aquoso com 0,01% NaN3 (65 g/mol) em uma coluna de cromatografia líquida (Luer Lock, Sem jaqueta, 1,0 cm x 20 cm, volume de cama 16 mL) até 1 cm abaixo do topo da parte incolor da coluna.
  3. Abra a torneira e deixe o líquido fluir para liquidar o gel dextran transversal.
  4. Lave a coluna eluvando com 20 mL de buffer HEPES 2 e descarte o fluxo de saída da coluna.
  5. Feche a torneira assim que o volume morto de solvente acima da coluna for minimizado (<100 μL), mas suficiente para evitar qualquer secagem do gel de dextran transversal.
  6. Coloque os LUVs recém-extrudados (amarelo) na coluna e deixe-os entrar no gel de dextran transversalmente ligado.
  7. Adicione continuamente o buffer HEPES 2 à coluna para realizar a purificação do LUV.
  8. Elute aproximadamente 2 mL de tampão HEPES 2 (não se esqueça de encher regularmente a parte superior da coluna para evitar secar o gel dextran cross-linked): a solução amarela gratuita ANTS e DPX migra mais lentamente do que os lipossomos.
  9. Comece a coletar LUVs purificados em tubos (1,5 mL).
  10. Observe as gotas de eluent da coluna e quando elas se tornam opalescentes, contêm lipossomos. Altere o tubo para recuperar a fração que contém LUV.
  11. Elute até que as gotas não sejam mais opalescentes (~1 mL). Depois, elute mais 0,5 mL em uma fração separada e, em seguida, parar de eluia.
    NOTA: As normas estão agora disponíveis em uma ampla gama de pesos moleculares, como kits ou pesos moleculares individuais para calibrar o volume de eluição dos LUVs.
  12. Enrole os tubos com os LUVs em papel alumínio para evitar branqueamento do corante de fluorescência.
  13. Lave a coluna com 20 mL hepes tampão 2.
  14. Os LUVs podem ser armazenados por uma semana a 4 °C.
    NOTA: Como a estabilidade do LUV pode depender da concentração e composição do LUV, bem como da força iônica, o tamanho dos LUVs deve ser controlado usando um instrumento de dispersão dinâmica de luz (DLS) (ver seção 4). Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV) antes de cada teste.

3. Quantificando a concentração de LUVs

  1. Estime a concentração de LUV por um kit de quantificação fosfolipídida, que permite a avaliação da concentração de colina19. Este ensaio pode ser aplicado quando fosfolipídios com colina contendo cabeça polar são substanciais (>50% dos LUVs).
  2. Prepare o reagente de cor dissolvendo 18 mg de substrato de cromogênio em 3 mL de tampão fornecido.
  3. Carregue um cuvette de poliestireno, 10 x 10 x 45 mm, com 3 mL de reagente colorido.
  4. Use o reagente de cor pura como condição em branco (Em branco). Adicione 20 μL de amostra DE LUV (Teste) ou 20 μL de solução padrão de concentração de colina conhecida (Padrão).
  5. Misture bem e incubar por 5 min a 37 °C todas as condições (Branco, Teste e Padrão).
  6. Meça a absorvância (densidade óptica, OD) da amostra de ensaio e a solução padrão com a solução em branco como o controle a 600 nm com um espectrofotômetro.
  7. Verifique os valores de OD que permitem estimar a concentração lipídica dos LUVs, C[LUV], em equivalente à colina em comparação com o padrão de concentração conhecida.
  8. Realize o cálculo usando a seguinte equação:
    C[LUV] (mol / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (mol / l)
    NOTA: O kit de quantificação fosfolipídida forneceu uma solução padrão de Cloreto de Colina (139,6 mg/l) a 54 mg/dL correspondente à concentração molar de C[Padrão] = 3,87 mmol/L. A amostra de OD e o Padrão OD são as absorvências medidas a 600 nm para as soluções LUV e Choline, respectivamente.

4. Caracterização do tamanho e homogeneidade do LUV

  1. Realize uma medição utilizando um instrumento DLS para determinar o tamanho do LUV (em nm) e o índice de polidispersidade (IDP).
  2. Programe o "procedimento de operação padrão" (SOP) apropriado, indicando a viscosidade do solvente/tampão e da cuvette usada.
  3. Coloque 500 μL da solução LUV em um cuvette semi-micro de poliestireno.
  4. Insira o póreno semi-micro cuvette em um instrumento DLS.
  5. À temperatura ambiente, meça a distribuição de tamanho em termos de tamanho médio (Z-média) da distribuição de partículas e de homogeneidade (índice de polidispersidade, IDP).
  6. Todos os resultados são obtidos a partir de duas medidas independentes realizadas cada uma em três ciclos repetitivos.
    NOTA: Os valores padrão para LUVs serão de 137 ± 7 nm com um ID ID de 0,149 ± 0,041.

5. Preparação de soluções de peptídeos

  1. Prepare uma solução de estoque do peptídeo, que deve ser analisada para o ensaio de vazamento.
  2. Dissolver o pó de peptídeo (>95% de pureza) em água pura (por exemplo, 1 mg de peptídeo em 500 μL de água pura).
    NOTA: Recomenda-se diluir peptídeos em água pura e evitar a solubilização de sulfóxido de dimetila (DMSO), que poderia induzir artefatos (por exemplo, permeabilização da membrana20).
  3. Vórtice a solução de peptídeo para 5 s.
  4. Sonicize a solução de peptídeo em um banho de sônica de água por 5 min e, em seguida, centrífuga por 5 min a 12.225 x g. Colete o supernatante para determinação de concentração.
  5. Meça a absorvência a 280 nm de três diluições de peptídeos independentes e, em seguida, calcule a concentração de peptídeo usando seu coeficiente de extinção molar ε (dependendo do conteúdo de triptofano e tyrosine na sequência de peptídeos) e regra beer-lambert.
    NOTA: Se o peptídeo contém triptofano e tyrosina, o coeficiente de extinção molar ε é computado com base em ε triptofano = 5.690 M-1cm-1 e Tyrosine ε = 1.280 M-1cm-1. Se a sequência de peptídeos não contiver triptofano ou tiranona, outro ensaio colorimétrico poderia ser realizado para medir a concentração (por exemplo, BCA ou Bradford).
  6. Diluir a solução de peptídeo em água pura para uma solução final de 100 μM e armazenar a 4 °C.
    NOTA: Em água pura, não ocorre degradação de peptídeo durante o armazenamento de 4 °C. No entanto, a concentração de peptídeos deve ser medida a cada 2 semanas para garantir que não ocorra evaporação da água.

6. Ensaio de vazamento de fluorescência

  1. O ensaio de vazamento de fluorescência é medido em um espectrofluorômetro à temperatura ambiente. Excitação e comprimento de onda de emissão são fixados em Ex = 360 nm ± 3 nm e Em = 530 nm ± 5 nm, respectivamente.
  2. Diluir LUVs em 1 mL hepes tampão 2 a uma concentração final de 100 μM em um cuvette fluorescência de quartzo. Adicione um agitador magnético para homogeneizar a solução durante o experimento.
  3. Meça os LUVs sozinhos durante os primeiros 100 s, entre t = 0 s e t = 99 s para acessar a fluorescência de fundo.
    NOTA: Apenas luvs também poderiam ser medidos durante todo o experimento (15 min) a fim de acessar fluorescência de fundo e possíveis vazamentos.
  4. A partir daí, meça o vazamento como um aumento da intensidade da fluorescência após a adição de alíquotas de solução de peptídeo para os próximos 900 s (15 min). Este protocolo é realizado para cada concentração de peptídeo testado de 0,1 μM a 2,5 μM.
  5. Finalmente, 100% de fluorescência foi alcançado solubilizando os LUVs pela adição de 1 μL de Triton X-100 (0,1%, v/v), resultando na sonda completamente inconchada entre t = 1.000 s e t = 1.100 s.

7. Quantificação do vazamento

  1. Suprimir valores obtidos após t = 1.090 s, a fim de manter o mesmo número de pontos para cada condição testada.
  2. Calcule a fluorescência mínima, Fmin,fazendo a média de 50 pontos entre t = 0 s e t = 49 s (SOMENTE LUVs).
  3. Calcule a fluorescência máxima, Fmax,fazendo a média de 50 pontos entre t = 1.041 s e t = 1.090 s (LUVs com Triton X-100).
  4. Calcule a porcentagem de vazamento (%Vazamento) em cada ponto de tempo (t = x), de acordo com a seguinte equação:
    %Vazamento(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
  5. Calcule o desvio médio e padrão dos valores obtidos com diferentes preparações de LUV (n ≥ 2) para a mesma condição.
  6. Plote a porcentagem de vazamento, %Leak(t=x), em função do tempo (s).

Resultados

O princípio do ensaio de vazamento de fluorescência é mostrado na Figura 1. Em detalhes, grandes vesículas unilamellar (LUVs) encapsulando um corante fluorescente e um quencher (sem sinal de fluorescência) são tratados com a biomolécula de interesse. Devido à interação do peptídeo com membranas lipídicas, o que pode implicar permeabilidade da membrana, reorganização ou até mesmo ruptura, o corante de fluorescência e o saciador são liberados d...

Discussão

O ensaio de vazamento de fluorescência apresentado é um método simples e rápido para lidar com a desestabilização da membrana por peptídeo penetrante de células. Fácil de fazer, também permite uma comparação indireta entre diferentes peptídeos que interagem por membrana ou outras moléculas que interagem por membrana. Quanto às etapas críticas do protocolo, uma vez que este ensaio fornece valores relativos entre a linha de base (SOMENTE LUVs) e a liberação de fluorescência máxima (condição triton), g...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Emilie Josse pela revisão crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela fundação "La Ligue contre le Cancer", a "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer", e o "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
25 mL glass round-bottom flaskPyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)InvitrogenA350Protect from light 
Chloroform Sigma-Aldrich288306
CholesterolSigma-AldrichC8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)Avanti Polar850375PProtect from air
ExtruderAvanti Polar610000
FluorimeterPTI Serlabo
50 µL glass syringeHamilton705N
HEPESSigma-AldrichH3375
LabAssay Phospholipid WAKO 296-63801
liquid chromatography columnSigma-Aldrich
MethanolCarlo Erba414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter)Whatman800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mmGrener Bio-One614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLSFisher ScientificFB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)InvitrogenX1525Protect from light 
quartz fluorescence cuvetteHellma109.004F-QS
rotavapor system HeidolphZ334898
Sephadex G-50 resinAmersham17-0042-01
Sodium azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Sodium chlorid (NaCl)Sigma-AldrichS5886
Sonicator bath USC300TVWR142-6001
SphingomyelinAvanti Polar860062PProtect from air
Triton X-100 Eromedex2000-B
Zetaziser NanoZS MalvernZEN3500

Referências

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