Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Özet

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Özet

Hücreye nüfuz eden peptitler (CPP'ler), plazma zarını geçebilen ve bir kargoyu hücrelere aktarabilen taşıyıcılar olarak tanımlanır. Bu aktivite için gerekli olan temel ortak özelliklerden biri, CPP'lerin plazma membranı (lipitler) ve daha çok membranın hücre dışı matrisinin bileşenleri (heparan sülfat) ile etkileşimlerinden kaynaklanandır. Nitekim, doğrudan translokasyon veya endositoza bağımlı içselleştirmeden bağımsız olarak, lipid bilayerleri hem plazma zarı seviyesinde hem de hücre içi trafik (endosomal veziküller) düzeyinde içselleştirme sürecine dahil olurlar. Bu yazıda, olası CPP-membran dengesizliğini/etkileşimini tespit etmek ve içselleştirme mekanizmasındaki rollerini ele almak için floresan sızıntı testinde büyük bir unilamellar veziküllerin (LUV' ler) formülasyonu, saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulamasının farklı adımlarını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Plazma membran içeriğini yansıtan lipid bileşimine sahip LUV'lar, hem floresan boyayı hem de bir quencher'ı kapsüllemek için üretilir. Ekstravesiküler ortamda peptitlerin eklenmesi ve OV'ler üzerinde peptit-membran etkileşimlerinin indüksiyonu, böylece bir sızıntıyı ortaya çıkaran floresanlarda doza bağlı bir şekilde önemli bir artışa neden olabilir. Örnekler burada, çeşitli hücre hatlarında hızlı ve verimli bir siRNA teslimatı gösteren yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R) zengin Amfipatik Peptitler (WRAP'ler) ile sağlanmaktadır. Son olarak, bu etkileşimlerin doğası ve lipitlere olan yakınlık, membran translokasyonunu ve/veya endosomal kaçışı anlamak ve iyileştirmek için tartışılır.

Giriş

Doksanlı yıllardaki keşiflerinden sonra, plazma membran 1^,2aracılığıyla kargoların verimli bir hücresel teslimatını teşvik etmek için hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) geliştirilmiştir. CPP'ler genellikle çok çeşitli kökenlere sahip, genellikle 8 ila 30 amino asit olan kısa peptitlerdir. İlk olarak "doğrudan translokasyon" taşıyıcıları olarak tanımlandılar, yani plazma zarını geçebildiler ve herhangi bir endositotik yoldan bağımsız olarak hücrelere bir yük aktarabildiler ne enerji gereksinimi ne de reseptör tutulumu. Bununla birlikte, daha fazla araştırma, bu ilk gözlemlerin esas olarak deneysel eser nedeniyle floresan aşırı tahmininden ve / veya metanol³kullanarak sabitleme protokollerinden geldiğini ortaya koydu. Günümüzde, CPP alımının, kargonun doğası, CPP ve kargo arasındaki kullanılan^bağlantı,çalışılan hücre hattı vb.

CPP'ler, CPP ile kargosu 8 ,⁹,^10,11arasında kimyasal bir bağlantı (kurevi strateji) veya elektrostatik/hidrofobik etkileşimler (kurda olmayan strateji) içeren iki stratejiye göre transfeksiyon ajanları olarak kullanılabilir. Her iki strateji de birkaç kargonun hücre transferinde verimliliklerini göstermiş olsa da, CPP'ler tarafından içselleştirme mekanizmasının anlaşılması hala tartışma altındadır ve endositoz yolları veya doğrudan penetrasyon arasındaki dengenin ölçülmesi hala zordur^12,13. Endosit süreçlerin katılımını net bir şekilde ele almak için bir dizi deneysel araç ve strateji mevcut olsa da, plazma membran bileşenleriyle daha ayrı etkileşimler anlamına gelir, ancak doğrudan translokasyonun karakterize etmesi daha zor görünmektedir. Biyolojik membranlar genellikle fosfolipidlerden membran proteinlerine kadar hücresel tipe ve/veya ortama (stres koşulları, hücre bölünmesi vb.) göre değişebilen çok sayıda bileşenden oluşur. Bu kompozisyon çeşitliliği ve sonuç olarak evrensel bir hücresel membran modelinin bulunmaması çalışmaları tek bir şekilde etkinleştirmez. Bununla birlikte, bu sınırlamaları atlatmak için yapay membran veya membran özleri ile adım adım yaklaşımlar geliştirilmiştir. Küçük unilamellar vesicles monolayer yaklaşımlara kadar, her model açıkça belirli soruları cevaplamak için uygundu^14,15. Bunlar arasında, büyük unilameller vesicles (LUVs), peptit / membran etkileşimlerini içselleştirme sürecinde önemli bir nokta olarak incelemek için uygun bir membran taklit modeli oluşturur.

Bu bağlamda, aşağıdaki protokolde hem aniyonik bir floresan boyanın hem de lipozomlarda kapsüllenmiş karşılık gelen poli-katyonik quencher'in izlenmesi yoluyla peptitlerin ve peptit/membran etkileşimlerinin LUVs bütünlüğü üzerindeki etkilerinin araştırılması açıklanmaktadır. Bu araç, doğrudan membran translokasyonu yapıp yapamayacaklarını anlamak için CPP / membran etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Genellikle farklı membran etkileşimli peptitleri karşılaştırmak için uygulansa da, bu LUV floresan sızıntı tahlili hem CPP-kargo konjugelerini (kurcalama stratejisi) hem de CPP:cargo komplekslerini (kurvalent olmayan strateji) araştırmak için de kullanılabilir.

Bu nedenle mevcut protokol ilk olarak yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R)- zengin Amfipatik Peptitler (WRAP)¹⁶ile örneklenecektir. WRAP, birkaç hücre hattında hızlı ve verimli bir şekilde küçük müdahale RNA 'sı (siRNA) sunmak için peptit bazlı nanopartiküller oluşturabilir¹⁶. Wrap peptidinin floresan sızıntı özellikleri tek başına veya siRNA yüklü WRAP bazlı nanopartiküller hücresel içselleştirme mekanizmalarını karakterize etmek için izlendi. İçselleştirme mekanizmalarının esas olarak doğrudan translokasyon içerdiğini gösterdik⁷. İkinci bir örnekte, WRAP peptidi protein/proteine müdahale eden peptit iCAL36 (WRAP-iCAL36)^17'ye eş zamanlı olarak konjuge edildi ve membranların dengesini bozma yeteneği, başka bir CPP olan Penetratin¹⁸ (Penetratin-iCAL36) ile birleştirilen iCAL36'ya floresan sızıntısı testinde karşılaştırıldı.

Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hem teknolojik açıdan hem de biyolojik alaka açısından tartışılacaktır.

Protokol

1. Büyük Unilamellar Vezikles (LUVs) hazırlanması

1. Luv'ları floresan sızıntı tahlilleri için hücre zarı taklitleri olarak kullanımları için hazırlayın.
2. Hamilton cam şırıngar fosfatidylcholine (DOPC, 786.11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760.22 g/mol) ve Kolesterol (Chol, 386.65 g/mol) ile molar oranında 4:4:2 karıştırın. Lipid çözeltisi, 25 mL'lik cam yuvarlak alt şişede 25 mg/mL'de bir metanol/kloroform (3/1; hacim/hacim) çözücüde çözünen her lipitin stok çözeltisinden elde edilir. 4 μmol DOPC, 4 μmol SM ve 2 μmol Chol'a dayanan lipid çözeltisi, sırasıyla 126 μL, 117 μL ve 31 μL karıştırılarak stok çözeltisinden elde edilir.
   DİkKAT: Metanol toksik ve yanıcı bir çözücüdür ve kloroform toksik ve kanserojendir. Her ikisi de bir başlık altında uygun koruma ile ele alınmalıdır.
3. Kurutulmuş bir lipit filmi oluşana kadar 60 °C'de 45-60 dakika boyunca vakum altında bir döner evaporatör kullanarak metanol / kloroform buharlaştırın.
4. İki stok HEPES tampon çözümü hazırlayın. 20 mM HEPES (238,3 g/mol) ve 75 mM NaCl (58,44 g/mol) karıştırarak HEPES tampon 1'i hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. 20 mM HEPES ve 145 mM NaCl karıştırarak HEPES tampon 2'yi hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. HEPES tamponları 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
   NOT: Bir kilometre sayacı kullanarak tamponların ozmolaritesinin kontrol etmesi önerilir.
5. Membran geçirimsiz floresan boya-quencher çiftini çözerek lipid hidrasyon çözeltisi hazırlayın, HEPES tampon çözeltisinde 8-aminonaftafen-1, 3, 6-trisülfiyonik asit, 12,5 mM'de disodium tuzu (ANTS, 427,33 g/mol) ve 45 mM'de p-ksilen-bispyridinium bromür (DPX, 422,16 g/mol). ANTS'ı DPX ile karıştırmak sarı renkli bir çözeltiye yol açar. 12,5 mM ANTS ve 45 mM DPX konsantrasyonlarına ulaşmak için, 4 mL HEPES tampon 1'de sırasıyla 21,4 mg ve 76 mg çözün.
   NOT: Lipid hidrasyon çözeltisi, tüpün alüminyum folyo ile sarılmasıyla 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.
6. Kurutulmuş lipid filmini lipid hidrasyon çözeltisinin 1 mL'si ile yeniden canlandırarak ve kurutulmuş lipid filminin çözünmesine kadar girdaplayarak çokmeller veziklinleri (MLV) yeniden oluşturun. Küçük lipid agregaları önceki adımları olumsuz etkileyeceğinden çözümün tamamen çözündüğünden emin olun. Ayrıca, kalan lipit filmi olmadığından emin olmak için cam yuvarlak alt şişenin duvarını kontrol edin.
   NOT: Çözelti, çözünürleşmeden sonra opalescent ve açık sarı görünecektir.
7. Unilamellar vesicles elde etmek için veziklikleri beş dondurma/çözme döngüsüne tabi edin. Her döngüyü, dondurma adımı için 30 s sıvı nitrojene 30 sn boyunca cam yuvarlak alt şişe koyarak, ardından çözme adımı için 2 dakika boyunca bir su banyosunda bırakarak gerçekleştirin.
   NOT: Banyo suyunun sıcaklığı lipitlerin erime sıcaklığından 5-10°C daha yüksek olmalıdır.
8. Metal ekstrüder kutusuna yerleştirilen her politetrafloroetilen (PTFE) ekstrüder parçasına HEPES tamponu ile ön nemlendirilmiş iki filtre desteği yerleştirerek lipid ekstrüder hazırlayın.
9. Bir filtre desteğinin üstüne HEPES nemlendirilmiş polikarbonat membran (0,1 μm gözenek boyutu, 25 mm çapında) koyun.
10. İki metal ekstrüder bidonlarını monte edin ve vidalayın.
11. Monte edilen ekstrüderi tutucuya yerleştirin ve her politetrafloroetilen ekstrüder parçasının ekstremitesinde uygun deliğe 1 mL şırıngır sokun. Ekstrüzyon, bir şırıncadan diğerine test edilen sıvının polikarbonat membrandan geçişine karşılık gelir.
12. Sızıntı veya sorun olmadığından emin olmak için ekstrüderi 1 mL şırınnadan birine yüklenmiş 1 mL HEPES tamponu ile test edin.
13. 1 mL HEPES tamponu MLV örneği ile değiştirin.
14. MLV örneğini bir şırıncadan diğerine polikarbonat membrandan en az 21 kez geçirerek aynı boyutta düzgün SUV'ler elde ederek ekstrüzyon gerçekleştirin.
    NOT: Ekstrüzyon lipit karışımının erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklıkta yapılmalıdır.

2. LUV'ların Saflaştırılması

1. Kapsüllenmemiş ANTS ve DPX fazlalığını gidermek için bir sütun saflaştırması hazırlayın.
2. Sıvı kromatografi sütununda (Luer Lock, Ceketsiz, 1,0 cm x 20 cm, yatak hacmi 16 mL) sütun renksiz kısmının 1 cm altına kadar %0,01 NaN₃ (65 g/mol) ile sulu ortamda yeniden sulanan çapraz bağlı dektran jelini (G-50) tanıtın.
3. Musluğu açın ve çapraz bağlı dektran jelini yerleştirmek için sıvının akmasına izin verin.
4. 20 mL HEPES arabelleği 2 ile eluting yaparak sütunu yıkayın ve sütunun çıkış akışını atın.
5. Kolonun üzerindeki ölü çözücü hacmi en aza indirildikten sonra (<100 μL) ancak çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için yeterli olduğunda musluğu kapatın.
6. Yeni ekstrüde LUV'ları (sarı) sütuna yerleştirin ve çapraz bağlı dektran jeline girmelerine izin verin.
7. LUV saflaştırmasını gerçekleştirmek için sütuna sürekli hepes arabelleği 2 ekleyin.
8. Yaklaşık 2 mL HEPES tampon 2'yi boşaltın (çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için sütunun üst kısmını düzenli olarak doldurmayı unutmayın): serbest sarı ANTS ve DPX çözeltisi lipozomlardan daha yavaş göç eder.
9. Saflaştırılmış LUV'ları tüplerde toplamaya başlayın (1,5 mL).
10. Sütundan gelen yılan balığı damlalarını gözlemleyin ve opalescent olduklarında lipozomlar içerirler. LUV içeren fraksiyonu kurtarmak için tüpü değiştirin.
11. Damlalar artık opalescent olmayana kadar elute (~1 mL). Daha sonra, ayrı bir kesirde 0,5 mL daha elute edin ve sonra kaçmayı bırakın.
    NOT: Standartlar artık LUV'ların elüasyon hacmini kalibre etmek için kitler veya bireysel moleküler ağırlıklar olarak çok çeşitli moleküler ağırlıklarda mevcuttur.
12. Floresan boyasının ağartılmasını önlemek için tüpleri LÜV'lerle birlikte alüminyum folyoya sarın.
13. Kolonu 20 mL HEPES tampon 2 ile yıkayın.
14. SUV'ler daha sonra 4 °C'de bir hafta saklanabilir.
    NOT: LUV stabilitesi LUV konsantrasyonuna ve bileşimine ve iyonik mukavemete bağlı olabileceğinden, LUV'lerin boyutu dinamik bir ışık saçılma (DLS) cihazı kullanılarak kontrol edilmelidir (bkz. bölüm 4). LUV Boyutunun ve Homojenliğin Karakterizasyonu) her test öncesi.

3. LUV konsantrasyonunun ölçülmesi

1. Kolin konsantrasyonunun değerlendirilmesini sağlayan fosfolipid nicelleştirme kiti ile LUV konsantrasyonunun tahmin edilmesi¹⁹. Bu test, polar kafa içeren kolin içeren fosfolipidler önemli olduğunda uygulanabilir (7'lerin% >50'si).
2. Sağlanan 3 mL tamponda 18 mg kromojen substratını eriterek renk reaktifini hazırlayın.
3. 3 mL renkli reaktif ile 10 x 10 x 45 mm'lik bir polistiren cuvette yükleyin.
4. Saf renk reaktifini boş koşul olarak kullanın (Boş). 20 μL LUV numunesi (Test) veya 20 μL bilinen kolin konsantrasyonu standart çözeltisi (Standart) ekleyin.
5. İyice karıştırın ve 37 °C'de tüm koşullarda (Boş, Test ve Standart) 5 dakika kuluçkaya yatırarak kuluçkaya yatırarak.
6. Test numunesinin ve standart çözümün emiciliğini (optik yoğunluk, OD) bir spektrofotometre ile 600 nm'de kontrol olarak boş çözelti ile ölçün.
7. BILINEN konsantrasyon standardına kıyasla LUV'ların lipid konsantrasyonu olan C[LUV]'un kolin eşdeğerini tahmin etmeyi sağlayan OD değerlerini kontrol edin.
8. Aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplamayı gerçekleştirin:
   C[LUV] (mol / l) = (OD Örneği / OD Standardı) x C[Standart] (mol / l)
   NOT: Fosfolipid nicelleştirme kiti, C[Standart] = 3.87 mmol/L molar konsantrasyonuna karşılık gelen 54 mg/dL'de Kolin Klorür (139.6 mg/l) standart çözeltisi sağlamıştır.

4. LUV boyutunun ve homojenliğinin karakterizasyonu

1. LUV boyutunu (nm cinsinden) ve çok disiplinlilik indeksini (PdI) belirlemek için bir DLS cihazı kullanarak ölçüm gerçekleştirin.
2. Çözücü/tamponun ve kullanılan cuvette'in viskozitesini belirterek uygun "standart çalışma prosedürünü" (SÇP) programlayın.
3. LUV çözeltisinin 500 μL'sini bir polistiren yarı mikro cuvette yerleştirin.
4. Polistiren yarı mikro cuvette'i bir DLS cihazına yerleştirin.
5. Oda sıcaklığında, boyut dağılımını parçacık dağılımının ortalama büyüklüğü (Z-ortalama) ve homojenlik (polidisperlik indeksi, PdI) açısından ölçün.
6. Tüm sonuçlar, her biri üç tekrarlayan döngüde gerçekleştirilen iki bağımsız ölçümden elde edilir.
   NOT: 0,149 ± 0,041 PDI ile 137 ± 7 nm ortalama boyutlarında olacaktır.

5. Peptit çözeltileri hazırlama

1. Sızıntı tahlil için analiz edilmesi gereken peptitin bir stok çözeltisini hazırlayın.
2. Peptit tozluğunu (%>95 saflıkta) saf suda çözün (örneğin, 500 μL saf suda 1 mg peptit).
   NOT: Peptitlerin saf suda seyreltilmeleri ve eserleri teşvik edebilecek dimetil sülfit (DMSO) çözünürlüğünden kaçınmanız önerilir (örneğin, membran permeabilizasyonu^20).
3. Vortex 5 s için peptit çözeltisi.
4. Peptit çözeltisini bir su sonikasyon banyosunda 5 dakika ve daha sonra 12.225 x g'da5 dakika santrifüjde sonicate edin. Konsantrasyon tespiti için süpernatant toplayın.
5. Emiciliği üç bağımsız peptit seyreltmenin 280 nm'sinde ölçün ve ardından molar yok olma katsayısı ε (peptit dizisindeki triptofan ve tirozin içeriğine bağlı olarak) ve Bira-Lambert kuralını kullanarak peptit konsantrasyonunu hesaplayın.
   NOT: Peptit triptofan ve tirozin içeriyorsa, molar yok olma katsayısı ε Triptofan ε = 5.690 M^-1cm^-1 ve Tirozin ε = 1.280 M^-1cm^-1temel alınarak hesaplanır. Peptit dizisi triptofan veya tirozin içermezse, konsantrasyonu ölçmek için başka kolorimetrik test yapılabilir (örneğin, BCA veya Bradford).
6. Peptit çözeltisini saf suda 100 μM'lik nihai bir çözeltiye seyreltin ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Saf suda, 4 °C depolama sırasında peptit bozulması meydana gelmez. Bununla birlikte, su buharlaşmasının oluşmamasını sağlamak için peptit konsantrasyonu her 2 haftada bir ölçülmelidir.

6. Floresan sızıntı tahlil

1. Floresan sızıntı tahlili oda sıcaklığında spektrofluorometre üzerinde ölçülür. Ekscitasyon ve emisyon dalga boyu sırasıyla Ex = 360 nm ± 3 nm ve Em = 530 nm ± 5 nm olarak sabitlenir.
2. 1 mL HEPES tampon 2'deki LUV'ları kuvars floresan cuvette 100 μM'lik son konsantrasyona seyreltin. Deney sırasında çözeltiyi homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı ekleyin.
3. Arka plan floresanlarına erişmek için luv'ları ilk 100 s boyunca t = 0 s ve t = 99 s arasında tek başına ölçün.
   NOT: Arka plan floresan ve potansiyel sızıntılara erişmek için tüm deney sırasında (15 dk) tek başına LUV'lar da ölçülebilir.
4. Bundan sonra, sızıntıyı, sonraki 900 s (15 dk) için peptit çözeltisinin aliquotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak ölçün. Bu protokol, 0,1 μM ila 2,5 μM arasında test edilen her peptit konsantrasyonu için gerçekleştirilir.
5. Son olarak, 1 μL Triton X-100 (%0,1, v/v) eklenerek LUV'ların çözünmesiyle %100 floresan elde edildi ve bu da t = 1.000 s ile t = 1.100 s arasında tamamen söndürülmemiş prob ile sonuçlandı.

7. Sızıntının nicelleştirilmesi

1. Test edilen her koşul için aynı sayıda noktayı korumak için t = 1.090 sn'den sonra elde edilen değerleri bastırın.
2. T = 0 s ve t = 49 s (yalnızca LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak minimum floresan, F_dk'yı hesaplayın.
3. T = 1.041 s ve t = 1.090 s (Triton X-100 ile LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak maksimum floresan, F_maks.
4. Aşağıdaki denkleme göre, her zaman noktasında (t = x) sızıntı yüzdesini (%Sızıntı) hesaplayın:
   %Sızıntı_(t=x) = (F_(t=x) - F_dk) / (F_{maks .} - F_dk) x 100
5. Aynı koşul için farklı LUV hazırlığı (n ≥ 2) ile elde edilen değerler için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
6. %Leak_(t=x)sızıntı yüzdesini zaman (lar) işlevinde çizin.

Sonuçlar

Floresan kaçak tahlili prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, floresan bir boyayı ve bir quencher'ı (floresan sinyali yok) kapsülleyen büyük unilameller vesicles (LUV'lar) ilgi çekici biyomolekül ile tedavi edilir. Peptidin lipid zarları ile etkileşimi nedeniyle, membran geçirgenliği, yeniden yapılanma ve hatta yırtılma anlamına gelebilir, floresan boyası ve quencher LUV'lardan salınır. Tampondaki sonraki seyreltmeler f...

Tartışmalar

Sunulan floresan sızıntı tahlili, hücreye nüfuz eden peptit ile membran dengesinin bozulmasını gidermek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Yapması kolay, aynı zamanda farklı membran etkileşimi olan peptitler veya diğer membran etkileşimi molekülleri arasında dolaylı bir karşılaştırma sağlar. Protokolün kritik adımlarıyla ilgili olarak, bu test taban çizgisi (tek başına LUV'lar) ve maksimum floresan salınımı (Triton durumu) arasında göreceli değerler sağladığından, genellikle LUV'l...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 mL glass round-bottom flask	Pyrex
8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS)	Invitrogen	A350	Protect from light
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
DOPC (dioleoylphosphatidylcholine)	Avanti Polar	850375P	Protect from air
Extruder	Avanti Polar	610000
Fluorimeter	PTI Serlabo
50 µL glass syringe	Hamilton	705N
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
LabAssay Phospholipid	WAKO	296-63801
liquid chromatography column	Sigma-Aldrich
Methanol	Carlo Erba	414902
Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter)	Whatman	800309
polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm	Grener Bio-One	614101
polystyrene semi-micro cuvette, DLS	Fisher Scientific	FB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)	Invitrogen	X1525	Protect from light
quartz fluorescence cuvette	Hellma	109.004F-QS
rotavapor system	Heidolph	Z334898
Sephadex G-50 resin	Amersham	17-0042-01
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
Sonicator bath USC300T	VWR	142-6001
Sphingomyelin	Avanti Polar	860062P	Protect from air
Triton X-100	Eromedex	2000-B
Zetaziser NanoZS	Malvern	ZEN3500