Modelo Rápido Para Evaluar El Potencial Anti-Obesidad De Una Combinación De Syzygium aromaticum (Clavo) Y Cuminun cyminum (Comino) En Ratones C57BL6/j Alimentados Con Dieta Alta en Grasas

Resumen

Este trabajo presenta un protocolo para explorar el efecto anti-obesidad de dos plantas utilizadas juntas, durante una duración de 5 semanas. Había una administración combinada del extracto y de la alto-grasa-dieta (HFD) en los ratones obesos. El método puede promover los beneficios de las plantas en el tratamiento de la obesidad.

Resumen

Varios estudios han demostrado que el contenido fitoquímico de las plantas son potenciales agentes contra la obesidad. En este estudio examinamos el efecto del uso de una combinación de botones secos de Syzygium aromaticum y semillas de Cuminum cyminum (CC) en ratones C57BL6/J inducidos con obesidad a través de dieta alta en grasas (HFD). El objetivo de este estudio es demostrar que el método propuesto en el estudio redujo significativamente la obesidad después de varias semanas de experimentación. El extracto de ambas plantas se extrajo mediante ultrasonido para mejorar la extracción de fitoquímicos. Las condiciones óptimas de extracción se obtuvieron con etanol de la siguiente manera: agua de 50:50 v / v con una potencia de ultrasonido de 300 W y tiempo de ultrasonido de 30 minutos. La administración simultánea del extracto de CC en HFD durante 5 semanas llevó a la regulación de los perfiles lipídicos (colesterol y triglicéridos), reducción de la ingesta de alimentos, aumento de peso, tejido adiposo y peso hepático. Los hallazgos obtenidos por este modelo obeso indican que el extracto del CC puede prevenir obesidad. Comparado con el método tradicional de 16 semanas (8 semanas para engordar, y 8 semanas para perder peso), se obtuvieron resultados similares en el modelo obeso del presente estudio en menos tiempo de experimentación.

Introducción

El exceso de acumulación de grasa corporal es una característica de la obesidad. El desequilibrio entre la ingesta y el consumo de energía conduce al almacenamiento del exceso de energía en los adipocitos, que se relaciona con los factores de riesgo metabólicos para la hiperglucemia y la resistencia a la insulina en la diabetes tipo 2, hipertensión, hipercolesterolemia y enfermedades cardiovasculares^1,2.

Los productos naturales con efectos secundarios mínimos y de bajo costo han recibido mayor atención ya que estudios anteriores han reportado fitoquímicos bioactivos y potenciales agentes antiobesidad con mecanismos que revierten o retrasan el síndrome metabólico y las patologías asociadas^8.

Varias plantas medicinales han sido estudiadas para prevenir la obesidad y enfermedades relacionadas. Entre ellos, Syzygium aromaticum ha sido investigado por su potencial contra la obesidad en el tratamiento in vitro en células 3T3-L1 y el tratamiento in vivo en ratones alimentados con una dieta alta en grasas¹¹. Además, se observaron efectos significativos contra el sobrepeso en un ensayo abierto multicéntrico de Cuminum cyminum en sujetos extremadamente obesos^12. En este estudio, los ratones de C57BL6/J fueron utilizados para investigar el modelo rápido experimental para evaluar un agente potencial de la anti-obesidad usando una combinación de ambas plantas comestibles.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas (IPN; Protocolo Nº 2732).

1. Preparación del extracto de la combinación de clavo y comino

NOTA: Las plantas comestibles, Syzygium aromaticum (clavo) y Cuminum cyminum (comino) fueron compradas a Central de Abastos CDMX, México.

1. Moler 500 g de semillas de las plantas y realizar la extracción asistida por ultrasonidos. Sonicarlos (320 Vatios; frecuencia de 24 kHz, 30 min) con etanol: agua (60:40 v / v) en un rango de temperatura de 30 ± 4 ° C.¹³
2. Filtre los sólidos utilizando papel de filtro Whatman número 2 al vacío y concentre el extracto con un evaporador rotatorio.
3. Medir el espectro UV-vis del extracto de ambas plantas (CC).

2. Animales

1. Utilice ratones machos C57BL6/J de seis semanas de edad (48 en total, peso corporal 24-29 g) para el estudio.
2. Albergar a los animales en grupos de ocho en condiciones estándar de laboratorio: temperatura (20-22 ± 1 °C), humedad relativa (45-54 ± 2%), iluminación (08:00-20:00 h) con alimentos y agua ad libitum. Aclimate a los ratones en estas condiciones durante una semana antes del experimento.

3. Procedimiento Experimental

1. Preparar la dieta alta en grasas¹⁴ como en la Tabla 1.
2. Al inicio de la prueba, someter cada uno de los grupos formados (n = 8) a diferentes tratamientos: Grupo de alimentación 1 en una dieta normal; Grupo 2, en dieta alta en grasas; Grupo 3, en dieta alta en grasas + 100 mg/kg de extracto del CC; Grupo 4, en dieta alta en grasas + 250 mg/kg de extracto del CC; Grupo 5, en dieta alta en grasas + 450 mg/kg de extracto del CC; Grupo 6, en dieta alta en grasas + fentermina (un medicamento contra la obesidad utilizado como control positivo)¹⁵.
3. Alimente a todos los grupos de ratones durante 5 semanas y registre la cantidad de alimentos consumidos diariamente.
   1. En un tubo de ensayo con tapón, homogeneizar el extracto o el fármaco con la dosis de agua correspondiente al grupo al que se está administrando el tratamiento. Esto se hace con agitador de vórtice.
   2. Una vez homogeneizado, añadir todo el tratamiento correspondiente al bebedor de cada grupo.

4. Recogida de muestras

1. Mida tanto la ingesta de alimentos como el peso corporal una vez por semana. Ayuno los ratones durante la noche durante un período de 5 semanas.
2. Sacrificarlos por luxación cervical y necropsia.
3. Después de que los ratones han sido sacrificados, inmovilizarlos en una posición supina.
4. Usando fórceps y tijeras quirúrgicas limpias, localice y levante la piel central cerca de los genitales y haga una pequeña incisión de 0,2 mm.
5. Inserte las tijeras planas horizontalmente en la incisión y separe cuidadosamente la piel abdominal de la pared abdominal.
6. Con las antesceps, levanta la piel central y con las tijeras quirúrgicas la corta a la altura de la caja torácica. Luego corte la piel por encima de las dos extremidades posteriores para facilitar la recolección de tejido adiposo.
7. Asegurar la recolección de todo el tejido adiposo del cuerpo mediante disección contundente con tijeras y fórceps. Una vez recogido, coloque el tejido adiposo en papel de aluminio. Recuerde recoger la grasa alrededor de los órganos reproductivos. Evitar la acumulación de pelo y piel para no alterar los resultados.
8. Para acceder al tejido adiposo visceral, corte el músculo abdominal con tijeras quirúrgicas desde los genitales hasta la caja torácica, haciendo una incisión en los músculos abdominales desde los genitales hacia la espalda del ratón.
9. Realizar una hepatectomía para extirpar el 100% del hígado. Para exteriorizar el hígado, extirpar órganos innecesarios y cortar las venas hepáticas y arterias para separar el hígado del resto del cuerpo. Como último paso, extraer con precisión la vesícula biliar del hígado¹⁶.
10. Mida la hipercolesterolemia (colesterol) y la hipertrigliceridemia (triglicéridos) utilizando kits de ensayo comerciales de acuerdo con las indicaciones del fabricante.

5. Análisis estadístico

NOTA: Todos los resultados experimentales deben ser representativos de tres ensayos independientes, expresados como media ± desviación estándar.

1. Calcule el error estándar con un análisis de varianza ANOVA unidireccional seguido de la prueba de rango de Tukey. Considere un P< 0.05 como estadísticamente significativo.

Resultados

Extracción asistida por ultrasonidos
La condición óptima de extracción para la extracción fue etanol: agua (50:50, v / v) con una potencia de ultrasonido de 300 W y un tiempo de ultrasonido de 30 min. De esta manera, la extracción fue más rápida que los métodos de extracción convencionales (Tabla 2). El extracto mostró un pico de absorción intenso a 320 nm en espectros uv-visibles (Figura 1).

Ingesta de alimentos y peso...

Discusión

En este estudio evaluamos, por primera vez, el efecto de la administración oral de una combinación de clavo de olor y extracto de comino (CC) sobre los perfiles lipídicos y la obesidad en ratones alimentados con una dieta alta en grasas durante 5 semanas. Los hallazgos indicaron que los grupos de HFD mostraron un aumento de peso corporal significativamente mayor en comparación con el grupo de DE, que mostró que la inducción de la obesidad en el modelo obeso fue exitosa. La dosis administrada de CC (100, 200 y 450 m...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled Water	Any vendor	n/a	Available for other vendors as well
Ethanol	Fermont	6063	99.8% purity
Diet Ingredients
Casein	Any vendor	n/a
Cellulose	Any vendor	n/a
Centrum balance multivitamin	Pfizer	n/a
Choline Bitartrate	Any vendor	n/a
L- cystein	Sigma Aldrich	168149	Available for other vendors as well
Lard	Any vendor	n/a
Maltodextrin 10	Any vendor	n/a
Pellets Nutricubos	Purina	n/a	Available for other vendors as well
Soybean Oil	Any vendor	n/a
Sucrose	Any vendor	n/a
Extraction Equipment
Rotavapor	Buchi	R-300
Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer	Cole Parmer	T-83400-20	Available for other vendors as well
Ultrasonic Unit	Elma	TI-H-20	Available for other vendors as well
Vacuum pump	Buchi	V-100