Modello rapido per valutare il potenziale anti-obesità di una combinazione di sizigium aromaticum (chiodi di garofano) e cumino ciminum (Cumino) su C57BL6 / j Topi nutriti con dieta ricca di grassi

Riepilogo

Questo lavoro presenta un protocollo per esplorare l'effetto anti-obesità di due piante utilizzate insieme, per una durata di 5 settimane. C'è stata una somministrazione combinata dell'estratto e della dieta ricca di grassi (HFD) nei topi obesi. Il metodo può promuovere i benefici delle piante nel trattamento dell'obesità.

Abstract

Diversi studi hanno dimostrato che il contenuto fitochimico delle piante sono potenziali agenti anti-obesità. In questo studio esaminiamo l'effetto dell'uso di una combinazione di pulsanti secchi di Syzygium aromaticum e semi di Cuminum cyminum (CC) su topi C57BL6 / J indotti con obesità attraverso la dieta ricca di grassi (HFD). Lo scopo di questo studio è dimostrare che il metodo proposto nello studio ha ridotto significativamente l'obesità dopo diverse settimane di sperimentazione. L'estratto da entrambe le piante è stato estratto utilizzando ultrasuoni per migliorare l'estrazione di fitochimici. Le condizioni ottimali di estrazione sono state ottenute con l'etanolo come segue: 50:50 v /v acqua con una potenza ultrasonica di 300 W e tempo di ultrasonicazione di 30 minuti. La somministrazione simultanea dell'estratto di CC in HFD per 5 settimane ha portato alla regolazione dei profili lipidici (colesterolo e trigliceridi), alla riduzione dell'assunzione di cibo, all'aumento di peso, al tessuto adiposo e al peso del fegato. I risultati ottenuti da questo modello obeso indicano che l'estratto di CC può prevenire l'obesità. Rispetto al metodo tradizionale di 16 settimane (8 settimane per ingrassare e 8 settimane per perdere peso), risultati simili sono stati ottenuti nel presente studio modello obeso in meno tempo di sperimentazione.

Introduzione

L'accumulo di grasso corporeo in eccesso è una caratteristica dell'obesità. Lo squilibrio tra assunzione di energia e consumo porta allo stoccaggio di energia in eccesso negli adipociti, che è correlata a fattori di rischio metabolici per l'iperglicemia e la resistenza all'insulina nel diabete di tipo 2, ipertensione, ipercolesterolemia e malattie^{cardiovascolari 1,2}.

I prodotti naturali con effetti collaterali minimi e basso costo hanno ricevuto maggiore attenzione da quando studi precedenti hanno riportato fitochimici bioattivi e potenziali agenti anti-obesità con meccanismi che invertono o ritardano la sindrome metabolica e le patologie^{associate 8}.

Diverse piante medicinali sono state studiate per prevenire l'obesità e le malattie correlate. Tra questi, il sizigium aromaticum è stato studiato per il suo potenziale anti-obesità nel trattamento in vitro su cellule 3T3-L1 e nel trattamento in vivo su topi nutriti con una dieta ricca di grassi¹¹. Inoltre, significativi effetti anti sovrappeso sono stati osservati in uno studio aperto multi-centro del ciclo cumino su soggetti estremamente obesi¹². In questo studio, i topi C57BL6/J sono stati utilizzati per studiare il modello veloce sperimentale per valutare un potenziale agente anti-obesità utilizzando una combinazione di entrambe le piante commestibili.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per l'esperimento animale della Escuela Nacional de Ciencias Biologicas (IPN; Protocollo n° 2732).

1. Preparazione dell'estratto della combinazione di chiodi di garofano e cumino

NOTA: Le piante commestibili, Syzygium aromaticum (chiodi di garofano) e Cuminum cyminum (cumino) sono state acquistate da Central de Abastos CDMX, Messico.

1. Macinare 500 g di semi dalle piante ed eseguire l'estrazione assistita da ultrasuoni. Sonicarli (320 Watt; frequenza 24 kHz, 30 min) con etanolo:acqua (60:40 v/v) ad un intervallo di temperatura di 30 ± 4 °C.¹³
2. Filtrare i solidi utilizzando carta filtrante Whatman numero 2 sotto vuoto e concentrare l'estratto con un evaporatore rotante.
3. Misurare lo spettro UV-vis dell'estratto di entrambe le piante (CC).

2. Animali

1. Utilizzare topi maschi C57BL6 / J di sei settimane (48 in totale, peso corporeo 24-29 g) per lo studio.
2. Ospita gli animali in gruppi di otto in condizioni di laboratorio standard: temperatura (20-22 ± 1 °C), umidità relativa (45-54 ± 2%), illuminazione (08:00-20:00 h) con ad libitum di cibo e acqua. Acclimatare i topi in queste condizioni per una settimana prima dell'esperimento.

3. Procedura sperimentale

1. Preparare la dieta ricca di^{grassi 14} come nella tabella 1.
2. All'inizio del test, sottoponi ciascuno dei gruppi formati (n = 8) a diversi trattamenti: Feed Group 1 con una dieta normale; Gruppo 2, con dieta ricca di grassi; Gruppo 3, con dieta ricca di grassi + 100 mg/kg di estratto di CC; Gruppo 4, con dieta ricca di grassi + 250 mg/kg di estratto di CC; Gruppo 5, con dieta ricca di grassi + 450 mg/kg di estratto di CC; Gruppo 6, su dieta ricca di grassi + fentermina (un farmaco antiobesità usato come controllo positivo)¹⁵.
3. Nutrire tutti i gruppi di topi per 5 settimane e registrare la quantità di cibo consumato quotidianamente.
   1. In una provetta con tappo, omogeneizzare l'estratto o il farmaco con la dose di acqua corrispondente al gruppo a cui viene somministrato il trattamento. Questo viene fatto con lo shaker vortice.
   2. Una volta omogeneizzato, aggiungere tutto il trattamento corrispondente nel bevitore di ogni gruppo.

4. Raccolta dei campioni

1. Misurare sia l'assunzione di cibo che il peso corporeo una volta alla settimana. Veloci i topi durante la notte per un periodo di 5 settimane.
2. Sacrificali per lussazione cervicale e necroscopia.
3. Dopo che i topi sono stati sacrificati, immobilizzarli in posizione supina.
4. Utilizzando forcep chirurgiche e forbici pulite, individuare e sollevare la pelle centrale vicino ai genitali e fare una piccola incisione di 0,2 mm.
5. Inserire le forbici piatte orizzontalmente nell'incisione e separare accuratamente la pelle addominale dalla parete addominale.
6. Con le forcep, sollevare la pelle centrale e con le forbici chirurgiche tagliarla a livello della gabbia toracica. Quindi tagliare la pelle sopra entrambi gli arti posteriori per facilitare la raccolta del tessuto adiposo.
7. Assicurarsi la raccolta di tutto il tessuto adiposo dal corpo mediante dissezione smussata con forbici e forcelle. Una volta raccolto, posizionare il tessuto adiposo in un foglio di alluminio. Ricorda di raccogliere il grasso intorno agli organi riproduttivi. Evitare l'accumulo di capelli e pelle per non alterare i risultati.
8. Per accedere al tessuto adiposo viscerale, tagliare il muscolo addominale con forbici chirurgiche dai genitali alla gabbia toracica, facendo un'incisione nei muscoli addominali dai genitali verso la schiena del topo.
9. Eseguire un'epatotectomia per rimuovere il 100% del fegato. Per esternalizzare il fegato, rimuovere gli organi non necessari e tagliare le vene epatiche e le arterie per separare il fegato dal resto del corpo. Come ultimo passo, estrarre con precisione la cistifellea dal fegato¹⁶.
10. Misurare l'ipercolesterolemia (colesterolo) e l'ipertrigliceridemia (trigliceridi) utilizzando kit di dosaggio commerciali secondo le indicazioni del produttore.

5. Analisi statistica

NOTA: Tutti i risultati sperimentali devono essere rappresentativi di tre saggi indipendenti, espressi come media ± deviazione standard.

1. Calcola l'errore standard con un'analisi ANOVA uni-way della varianza seguita dal test dell'intervallo di Tukey. Considera un P< 0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Estrazione assistita da ultrasuoni
La condizione di estrazione ottimale per l'estrazione era l'etanolo:acqua (50:50, v/v) con una potenza ultrasonica di 300 W e un tempo di ultrasonicazione di 30 min. In questo modo, l'estrazione è stata più rapida dei metodi di estrazione convenzionali(tabella 2). L'estratto ha mostrato un intenso picco di assorbimento a 320 nm negli spettri visibili ai raggi UV (Figura 1).

Assunzione di cibo e ...

Discussione

In questo studio abbiamo valutato, per la prima volta, l'effetto della somministrazione orale di una combinazione di chiodi di garofano ed estratto di cumino (CC) sui profili lipidici e obesità nei topi nutriti con una dieta ricca di grassi per 5 settimane. I risultati hanno indicato che i gruppi HFD hanno mostrato un aumento di peso corporeo significativamente più elevato rispetto al gruppo ND, che ha mostrato che l'induzione dell'obesità nel modello obeso ha avuto successo. La dose somministrata di CC (100, 200 e 45...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Distilled Water	Any vendor	n/a	Available for other vendors as well
Ethanol	Fermont	6063	99.8% purity
Diet Ingredients
Casein	Any vendor	n/a
Cellulose	Any vendor	n/a
Centrum balance multivitamin	Pfizer	n/a
Choline Bitartrate	Any vendor	n/a
L- cystein	Sigma Aldrich	168149	Available for other vendors as well
Lard	Any vendor	n/a
Maltodextrin 10	Any vendor	n/a
Pellets Nutricubos	Purina	n/a	Available for other vendors as well
Soybean Oil	Any vendor	n/a
Sucrose	Any vendor	n/a
Extraction Equipment
Rotavapor	Buchi	R-300
Shimadzu UV-1800 UV/Visible Scanning Spectrophotometer	Cole Parmer	T-83400-20	Available for other vendors as well
Ultrasonic Unit	Elma	TI-H-20	Available for other vendors as well
Vacuum pump	Buchi	V-100