Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.

Resumen

Este método se puede utilizar para examinar el acortamiento del sarcómero usando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes con proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes.

Resumen

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes (PSC-CMs) se pueden producir a partir de células madre pluripotentes embrionarias e inducidas (ES/iPS). Estas células proporcionan fuentes prometedoras para el modelado de enfermedades cardíacas. Para las cardiomiopatías, el acortamiento del sarcómero es una de las evaluaciones fisiológicas estándar que se utilizan con los cardiomiocitos adultos para examinar sus fenotipos de enfermedad. Sin embargo, los métodos disponibles no son apropiados para evaluar la contractilidad de PSC-CMs, ya que estas células tienen sarcómeros subdesarrollados que son invisibles bajo microscopía de contraste de fase. Para dirigir este problema y para realizar el acortamiento del sarcómero con PSC-CMs, las proteínas fluorescente-marcadas con etiqueta y la vivo-proyección de imagen fluorescente fueron utilizadas. Las líneas Z delgadas y una línea M residen en ambos extremos y en el centro de un sarcómero, respectivamente. Las proteínas de la línea Z — α-Actinina (ACTN2), Telethonin (TCAP), y proteína LIM asociada a la actina (PDLIM3) — y una proteína de la M-línea — Myomesin-2 (Myom2) — fueron etiquetadas con las proteínas fluorescentes. Estas proteínas etiquetadas se pueden expresar a partir de alelos endógenos como knock-ins o de virus adenoasociados (AAVs). Aquí, presentamos los métodos para diferenciar las células madre pluripotentes de ratón y humanas a los cardiomiocitos, para producir AAVs, y para realizar y analizar imágenes en vivo. También se describen los métodos para la producción de polidimetilsiloxano (PDMS) sellos para un cultivo modelado de PSC-CMs, que facilita el análisis de acortamiento de sarcómero con proteínas marcadas con fluorescentes. Para evaluar el acortamiento del sarcómero, las imágenes del lapso de tiempo de las células que golpeaban fueron registradas en un alto framerate (50-100 cuadros por segundo) bajo estímulo eléctrico (0.5-1 hertzios). Para analizar la longitud del sarcómero en el curso de la contracción celular, las imágenes de lapso de tiempo grabadas se sometieron a SarcOptiM, un plug-in para ImageJ / Fiji. Nuestra estrategia proporciona una plataforma simple para investigar fenotipos de enfermedades cardíacas en PSC-CMs.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares son la principal causa de mortalidad a nivel mundial¹ y la miocardiopatía representa la tercera causa de muertes relacionadas con el cardíaco^2. La cardiomiopatía es un grupo colectivo de enfermedades que afectan a los músculos cardíacos. Los recientes desarrollos de células madre pluripotentes inducidas (iPS) y la diferenciación dirigida de las células iPS hacia cardiomiocitos (PSC-CMs) han abierto la puerta para el estudio de cardiomiocitos con genoma de pacientes como modelo in vitro de cardiomiopatía. Estas células pueden ser utilizadas para comprender la fisiopatología de las enfermedades cardíacas, para dilucidar sus mecanismos moleculares y para probar diferentes candidatos terapéuticos^3. Existe una enorme cantidad de interés, por lo tanto, se han generado células iPS derivadas del paciente (por ejemplo, miocardiopatía hipertrófica [HCM]^4,5,miocardiopatía arritmogénica del ventrículo derecho [ARVC]^6,miocardiopatía dilatada [DCM]⁷y miocardiopatías relacionadas con las mitocondrias^8,9). Debido a que una de las características de la cardiomiopatía es la disfunción y la interrupción de los sarcómeros, se necesita una herramienta válida que mida uniformemente la función del sarcómero.

El acortamiento de sarcómero es la técnica más utilizada para evaluar la función del sarcómero y la contractilidad de los cardiomiocitos adultos derivados de modelos animales y humanos. Para realizar el acortamiento del sarcómero, se requieren sarcómeros bien desarrollados que sean visibles bajo contraste de fase. Sin embargo, psc-CMs cultivados in vitro muestran sarcómeros subdesarrollados y desorganizados y, por lo tanto, no pueden ser utilizados para medir correctamente el acortamiento de sarcómero¹⁰. Esta dificultad para evaluar adecuadamente la contractilidad de PSC-CMs dificulta su uso como plataforma para evaluar las funciones cardíacas in vitro. Para evaluar indirectamente la contractilidad psc-cms, se han utilizado microscopía de fuerza atómica, matrices de micro-postes, microscopía de fuerza de tracción y mediciones de impedancia para medir los efectos del movimiento ejercido por estas células en sus alrededores^11,12,13. Grabaciones de video microscopía más sofisticadas y menos invasivas del movimiento celular real (por ejemplo, SI8000 de SONY) se pueden utilizar para evaluar alternativamente su contractilidad, sin embargo, este método no mide directamente el movimiento del sarcómero o la cinética de generación de fuerza^14.

Para medir directamente el movimiento del sarcómero en PSC-CMs, están surgiendo nuevos enfoques, como el etiquetado fluorescente de la proteína sarcómero. Por ejemplo, Lifeact se utiliza para etiquetar actina filamentosa (F-actina) para medir el movimiento del sarcómero^15,16. Las células iPS modificadas genéticamente son otra opción para etiquetar proteínas de sarcómero (por ejemplo, α-actinina [ACTN2] y miomesina-2 [MYOM2]) por la proteína fluorescente^17,18,19.

En este papel, describimos cómo realizar la proyección de imagen del lapso de tiempo para medir el acortamiento del sarcómero usando Myom2-TagRFP (células madre embrionarias del ratón [ES]) y ACTN2-mCherry (células humanas del iPS). También mostramos que un cultivo modelado facilita la alineación de sarcómeros. Además, describimos un método alternativo de etiquetado del sarcómero, usando los virus adeno-asociados (AAVs), que se pueden aplicar extensamente a las células paciente-derivadas del iPS.

Protocolo

1. Diferenciación de células madre pluripotentes de ratón

1. Mantenimiento de células ES de ratón
   1. Medio de mantenimiento: Mezclar 50 mL de suero fetal bovino (FBS), 5 mL de L-alanina-L-glutamina, 5 mL de aminoácido no esencial (NEAA), 5 mL de Piruvato de Sodio de 100 mM, y 909 μl de 55 mM 2-Mercaptoetanol con 450 mL de Medio Esencial Mínimo de Glasgow (GMEM). Factor inhibitorio de la leucemia del suplemento (LIF), CHIR-99021, y PD0325901 en una concentración final de 1000 U/mL, 1 μM, y 3 μM, respectivamente. Esterilizar el medio a través de un filtro de 0,22 μm.
   2. Medio FBS: Mezclar 55 mL de FBS, 5,5 mL de L-alanina-L-glutamina, 5,5 mL de Piruvato de Sodio, y 5,5 mL de NEAA a 500 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) de glucosa alta. Filtrar el medio a través de un filtro de 0,22 μm para esterilizar.
   3. Cultivo de células ES de ratón SMM18 en el que TagRFP fue golpeado en el locus Myom2 en un plato gelatinizado de 6 cm en medio de mantenimiento como se describió anteriormente¹⁸. Pasaje cada 2-3 días.
2. Preparación del medio de diferenciación sin suero (SFD)
   1. SFD basal: Mezclar 250 mL de F-12 de Ham, 750 mL de Medio modificado de Dulbecco de Iscove (IMDM), 10 mL de suplemento de B27 menos vitamina A, 5 mL de suplemento de N2, 10 mL de L-alanina-L-glutamina, 5 mL de albúmina sérica bovina al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 10 mL de penicilina y estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar a través de 0.22 μm colador para esterilizar.
   2. Disuelva el ácido ascórbico a 5 mg/mL en agua destilada y filtre a través de un colador de 0,22 μm para esterilizar.
   3. Diluir 13 μL de 1-Tioglicerol a 1 mL de IMDM. Aquí, refiérase a este 1-tioglicerol diluido como MTG.
   4. Añadir 10 μL de ácido ascórbico (5 mg/mL) y 3 μL de MTG a 1 mL de SFD basal el día de su uso. Aquí, refiérase a esta mezcla como SFD completo.
3. Día 0, formación del cuerpo embrionario (EB) para la diferenciación
   1. Cosechar células ES de ratón SMM18 con una proteasa recombinante similar a la tripsina (rTrypsin) y contar las células.
   2. Centrífuga 5 x 10⁵ células a 300 x g durante 3 min en 4 °C, resuspend en 10 mL de SFD completo, y semilla en una placa de Petri de 10 cm. Cultivar las células a 37 °C y 5% de_CO2 durante 50 h.
4. Diferenciación día 2
   1. Agregue Activin A, factor de crecimiento endotelial vascular humano (hVEGF), y proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) para completar SFD en una concentración final de 5 ng/mL, 5 ng/mL, y 1.9 ng/mL, respectivamente.
      NOTA: Las concentraciones de BMP4 pueden diferir dependiendo del lote de BMP4. Pruebe varias concentraciones en un ensayo a pequeña escala antes de usar un nuevo lote y determine la mejor concentración para la diferenciación cardíaca.
   2. Transfiera los EBs de una placa de Petri a un tubo de 15 mL y la centrífuga a 50-100 x g durante 3 min a 4 °C.
   3. Mientras tanto, añadir el medio preparado en el paso 1.4.1 a la placa de Petri para proteger los EBs restantes que están secos.
   4. Aspirar el sobrenadante del tubo de 15 mL, resuspend los EBs con el medio en la placa de Petri, y transferir la solución de EB de nuevo a la placa. A continuación, cultivar los EBs a 37 °C y 5% de_CO2 durante 46 h.
5. Diferenciación día 4
   1. Gelatinizar un plato de 10 cm tratado con cultivo de tejidos con 5 a 10 mL de gelatina al 0,1% durante al menos 5 min. Aspirar la gelatina justo antes de sembrar las células.
   2. Prepare el medio: Mezcle el factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF), FGF10, y hVEGF para completar SFD en 5 ng/mL, 25 ng/mL, y 5 ng/mL concentraciones finales, respectivamente. Para un plato de 10 cm, preparar 10 mL.
   3. Transfiera las células de la placa de Petri a un tubo de 15 mL. Agregue 5 mL de PBS a la placa de Petri, lave varias veces y transfiera al tubo de 15 mL para recolectar las células restantes. Centrífuga a 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
   4. Aspirar sobrenadante, añadir 1 mL de rTripsina, e incubar a 37 °C durante 3 min.
   5. Vórtice brevemente para disociar EBs, añadir 9 mL de 10% FBS medio, vórtice de nuevo, y contar las células.
   6. Centrífuga 1.5 x 10⁷ células a 300 x g, 4 °C durante 3 min, resuspend con el medio preparado en el paso 1.4.2, y semilla en el plato gelatinizado. Incubar a 37 °C y al 5% de_CO2 durante 2 días.
      NOTA: Por el día 7 u 8, el batir extenso de PSC-CMs puede ser observado.
6. Selección de fármacos en los días de diferenciación 7 y 9: Realimentar los medios con puromicina (2 μg/mL en la concentración final) para eliminar los no cardiomiocitos a los días 7 y 9 de diferenciación.
   NOTA: La línea parental de SMM18 es células ES de ratón syNP4, que albergan el gen puromicina resistente al promotor NCX1^20.
7. Día 10, replate para futuros experimentos
   1. Cubra una placa de cultivo con fondo de vidrio o un plato de imágenes de 35 mm que contenga una cubierta de polímero con gelatina al 0,1%. Para mejorar la maduración, cubra los platos con fragmento de laminina-511 E8 (LN511-E8) a 1 μg/cm2 durante 30-60 min a temperatura ambiente^18. Para cultivar PSC-CMs en patrones específicos de interés, consulte los pasos 4 y 5 para preparar sellos de polidimetilsiloxano (PDMS).
   2. Para cosechar SMM18 PSC-CMs, lave el plato dos veces con PBS, aplique 1 mL de rTrypsin e incube 3 min a 37 °C.
   3. Recoger las células en 9 mL de 10% FBS medio, suspender, y contar las células. Platee las células en 50,000-100,000 células en un pozo de una placa de 24 pozos o 250,000-500,000 células en un plato de imágenes de 35 mm.
   4. Centrifugar un número suficiente de células (300 x g, 3 minutos) y resuspend las células con SFD completo complementado con FBS (concentración final en el 10%).
   5. Incubar durante la noche y cambiar el medio de cultivo para completar sfd con puromicina.
   6. A partir del día 14, cambie el medio de cultivo de dos a tres veces a la semana con SFD completo hasta el día 21-28, cuando Myom2-RFP se vuelve prominente. Para la transducción basada en AAV de proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes, consulte el Paso 3.

2. Diferenciación de células madre pluripotentes humanas

1. Preparación de medios de diferenciación
   1. RPMI+B27-Ins: mezclar 500 mL de RPMI 1640 medio, 10 mL de B27 menos insulina, y 5,25 mL de L-alanina-L-glutamina.
   2. RPMI+B27+Ins: mezclar 500 mL de RPMI, 10 mL de suplemento B27, y 5,25 mL de L-alanina-L-glutamina.
2. Mantenimiento de células iPS humanas
   1. Paso de células iPS humanas dos veces por semana con AK02N en LN511-E8 siguiendo un método previamente publicado con algunas modificaciones²¹.
   2. Cosechar células con un tratamiento de 3 min de rTripsina y recoger en 10% FBS medio. Contar células y centrífuga a 300 x g durante 3 min a 4 °C. Semilla 75.000-125.000 células en un pozo de placa de 6 pozos con 2 mL de AK02N suplementado con LN511-E8 e Y27632 ala concentración final de 0,5 μg/mL (0,1 μg/cm2) y 10 μM, respectivamente.
   3. Incubar a 37 °C y 5% de_CO2 y sustituir el medio al día siguiente por 2 mL de AK02N sin ningún suplemento. Cambie de medio cada dos o tres días y pase cada tres o cuatro días.
3. Día -4: replate antes de la diferenciación
   1. Recubre una placa de 6 pozos con 0,5 μg/cm2 de LN511-E8 diluido en PBS. Luego, incubar durante al menos 30 min a 37 °C y 5% de CO₂ o 1 h a temperatura ambiente. Aspirar la solución de recubrimiento justo antes de sembrar las células.
   2. Cosechar células iPS humanas con rTripsina y contar células como en el Paso 2.2.2.
   3. Centrífuga 1,25 x 10⁵ células para un pozo de una placa de 6 ludos a 300 x g durante 3 min a 4 °C y resuspend en 2 mL de AK02N suplementado con LN511-E8 (concentración final 0,5 μg/mL o 0,1 μg/cm2) e Y27632 (concentración final 10 μM) por pozo.
   4. Aspirar la solución de recubrimiento, las células resuspended de la semilla en la placa recubierta, e incubar a 37 °C y al 5% de CO₂.
4. Días -3 y -1: sustituir medio por 2 mL de AK02N.
5. Día 0: Sustituir medio por 2 mL de RPMI+B27-Ins suplementados con CHIR99021 (concentración final 6 μM) por pozo para iniciar la diferenciación.
6. Día 2: Reemplazar el medio con 2 mL de RPMI+B27-Ins con WntC59 (concentración final 2 μM) por pozo.
7. Día 4: Reemplazar medio con 2 mL de RPMI+B27-Ins por pozo.
8. Día 7 y día 9: sustituir el medio por 2 mL de RPMI+B27+Ins por puromicina (concentración final 10 μg/mL) por pozo para cultivar selectivamente PSC-CMs.
   NOTA: La línea ACTN2-mCherry, utilizada en este estudio, tiene un casete de sitio de entrada ribosómico interno (IRES), gen puromicina-resistente insertado a la región 3′-no traducida (UTR) del lugar geométrico TNNT2, y mCherry reemplazando el codón de parada de ACTN2. Para purificar cardiomiocitos sin knock-in, por favor refiérase a los pasos 3 y 4.
9. Día 10: replate para futuros experimentos
   1. Recubra un plato de imagen de 35 mm con un cubrebocas de polímero con 0,5-1^μg/cm2 de LN511-E8 diluido en gelatina al 0,1%. Incubar 2-4 h a temperatura ambiente para una viabilidad a largo plazo. Para cultivar PSC-CMs en patrones deseados, consulte los pasos 4 y 5 para preparar sellos PDMS.
   2. Para cosechar PSC-CMs humanos, lave el plato dos veces con PBS, aplique 1 mL de rTrypsin por pocillo e incube 3 min a 37 °C.
   3. Recoger las células en 4 mL de 10% FBS medio, suspender, y contar las células. Placa 250.000-500.000 células por plato de la proyección de imagen de 35 milímetros.
   4. Centrifugar un número suficiente de células a 300 x g durante 3 min a 4 °C, resuspend con RPMI+B27+Ins con puromicina (10 μg/mL), y placa en el plato recubierto de imágenes de 35 mm.
   5. Incubar durante la noche. A la mañana siguiente, reemplace el medio de cultivo con RPMI+B27+Ins con puromicina (10 μg/mL).
   6. A partir del día 14, cambie el medio de cultivo 2-3 veces a la semana con RPMI + B27 + Ins hasta el día 21-28 para obtener imágenes. Para la transducción basada en AAV de proteínas de sarcómero marcadas con fluorescentes, consulte el Paso 3.

3. Etiquetado fluorescente de sarcómeros utilizando virus adenoasocidos

1. Preparación antes de la producción de AAV
   1. Mantener las células HEK293T en DMEM suplementado con FBS (concentración final al 10%) en una placa de cultivo de tejido de 10 cm. Células de paso tres veces a la semana.
   2. Preparar polietilenimina (PEI) a 1 mg/mL. Mezclar 50 mg de polietilenimina MAX 40000 y 40 mL de agua ultrapura. Ajuste el pH a 7.0 usando 1 N NaOH. Luego, haga el volumen final a 50 mL con agua ultrapura y filtre a través de un colador de 0.22 μm.
   3. Preparar un vector lanzadera con un gen de etiquetado de sarcómero (por ejemplo, TCAP o PDLIM3 fusionado con una proteína verde fluorescente [GFP]), impulsado por un promotor específico de cardiomiocitos, como la troponina cardíaca T (cTNT)^22.
      NOTA: Para este caso, utilizamos GFP realzado monomérico con mutaciones de V163A, S202T, L221V^23.
2. Día 0, paso de células HEK
   1. Cuando las células alcanzan la confluencia, paso 2,0 x 10⁷ células HEK293T a una placa de cultivo de tejido de 15 cm con 20 mL de DMEM con 10% FBS.
3. Día 1, transfección
   1. Mezcle 13,5 μg del vector lanzadera, 26 μg de pHelper (un vector que codifica E2A, E4 y VA de adenovirus), 16,5 μg de pRC6 (un vector que codifica los genes AAV2 Rep y AAV6 Cap) y 1 mL de DMEM sin piruvato de sodio (DMEM-Pyr).
   2. Mezclar 224 μL de PEI (1 mg/mL, preparado en la etapa 3.1.2) y 776 μL de DMEM-Pyr.
   3. Mezcle e incube la solución de plásmido y la solución de PEI a temperatura ambiente durante 30 min.
   4. Añadir la solución de plásmido/PEI a las células HEK293T preparadas en el paso 3.2.
4. Día 2, cambio medio
   1. A las 24 h después de la transfección, cambie el medio a DMEM-Pyr. Cultivar células hasta la cosecha de AAV el día 7. AAV se lanzará en los medios de comunicación de la cultura.
5. Día 7, recolección de AAV, concentración y sustitución de tampón utilizando el método de purificación mínima²⁴
   1. Incubar una unidad de ultrafiltración centrífuga (100k molecular weight cut-off [MWCO]) con 5 mL de BSA al 1% en PBS a temperatura ambiente durante 15 min. Luego, centrifuga la unidad de ultrafiltración a 500 x g durante 2 min y aspire tanto las soluciones filtradas como las restantes.
   2. Medio de transferencia del plato de 15 cm que produjo AAV a un nuevo tubo cónico de 50mL y centrífuga (500 x g, 5 min). Filtre el sobrenadante a través de un colador de jeringa de 0,45 μm para eliminar los desechos celulares y aplicar la suspensión a la unidad de ultrafiltración.
   3. Centrífuga a 2000 x g durante 90 min o hasta concentrar el cultivo sobrenadante de 0,5 a 1 mL.
   4. Aspirar el filtrado y aplicar 15 mL de PBS a la unidad de ultrafiltración.
   5. Repetir la centrifugación hasta que el concentrado se convierta en 0,5-1 mL.
   6. Repetir 3.5.4 y 3.5.5.
   7. Transfiera el AAV concentrado a un nuevo tubo de 1,5 mL y guárdelo a 4 °C o -20 °C.
      NOTA: AAV se puede utilizar en instalaciones P1, pero siga las reglas y regulaciones locales. AAV se puede producir por métodos convencionales también.
6. Cálculo del título AAV
   1. Mezclar 5 μL de AAV, 195 μL de DMEM-Pyr y 10 U de benzonasa e incubar a 37 °C durante 1 h.
   2. Añadir 200 μL de tampón de proteinasa K (0,02 M Tris HCl y 1% SDS) y 5 μL de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar a 37 °C durante 1 h.
   3. Prepare cuidadosamente 400 μL de una solución de fenol/cloroformo/alcohol isoamilo 25:24:1, vórtice durante 1 min y centrífuga a 20.000 x g durante 1 min.
   4. Transferir 200 μL de la fase acuosa a un nuevo tubo de 1,5 mL, que producirá aproximadamente la mitad de los genomas originales de AAV.
   5. Añadir 1 μL de Glucógeno (20 mg/mL) a 20 μL de 3 M_CH3COONa (pH 5.2) y vórtice. Añadir 250 μL de 2-Propanol a 100 μL de etanol 100% y vórtice de nuevo.
   6. Incubar a -80 °C durante 15 min. Luego centrífuga a 20.000 x g durante 30 min a 4 °C.
   7. Aspirar sobrenadante y añadir etanol al 70% al tubo. Luego, centrífuga a 20.000 x g, 4 °C durante 5 min.
   8. Aspirar sobrenadante y secar al aire hasta que el pellet se aclare.
   9. Añadir 200 μL de ácido Tris-Etilendiaminotetraacético (TE; pH 8.0) para resolver los genomas de AAV. Luego, diluya la muestra 100 veces con TE.
   10. Preparar un estándar con pAAV-CMV-Vector a 6,5 ng/μL con TE para obtener 10⁹ genomas vectoriales (vg)/μL. Luego, haga una serie de dilución de 10 veces de 10⁴ a 10⁸ con TE.
   11. Mezclar 1 μL de ADN de la muestra (o los estándares), 0,4 μL de cebadores (5 μM), 3,6 μL de agua destilada y 5 μL de mezcla maestra SYBR Green. Los cebadores, ubicados en ITR, son 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ y 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
   12. Realizar PCR en tiempo real con la siguiente condición: Desnaturalización inicial a 95 °C durante 60 s, 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 s, y recocido y extensión a 60 °C durante 30 s, seguido de curva de fusión.
   13. Basándose en los estándares y los valores de Ct, una máquina de PCR en tiempo real proporciona el número de copia del genoma vectorial en 1 μL de una muestra. Calcule el título de AAV original utilizando la siguiente ecuación: un número de copia proporcionado por PCR en tiempo real (vg/μL) x 8 x 10³ x 2, en el que 8 x 10³ como factor de dilución durante el aislamiento del genoma de AAV, y 2 como factor de diferencia de AAV (cadena simple) y plásmido (doble cadena).
7. Transducción a PSC-CMs
   1. Cuente PSC-CMs en un pozo extra o plato extra.
   2. Diluir AAVs (1 x 10⁴ a 1 x 10⁶ vg/célula) para componer 50 μL con PBS. Aplique AAVs en la multiplicidad de infección (MOI) de 1 x 10 4 a¹ x 10⁶ vg/cell a PSC-CMs y culte PSC-CMs durante 3 días con AAV en el medio de diferenciación correspondiente para PSC-CMs de ratón y humanos, luego cambie el medio a medio de cultivo sin AAV.
   3. Use PSC-CMs para imágenes de células vivas después de 7 días o más después de la transducción.

4. Purificación [opcional] basada en AAV de PSC-CMs

1. Preparación de AAV
   1. Prepare AAV como se describe en el paso 3 usando un vector lanzadera que exprese el gen blasticidin-resistente bajo control del promotor de cTNT.
2. Transducción a células iPS diferenciadoras
   1. Diferencie las células iPS humanas durante 4 días siguiendo el protocolo descrito en el Paso 2 y cuente el número de células en un pozo adicional.
   2. Después de cambiar el medio en el día 4, aplique AAVs en el MOI de 1 x 10⁵ vg/cell para diferenciar PSCs en medios RPMI + B27-Ins.
   3. Al día 7, actualice el medio con RPMI + B27 + Ins y agregue 2.5-10 μg / mL de blasticidina.
   4. En el día 10, PSC-CMs están listos para replate.

5. Preparación de sellos PDMS

1. Diseñe el patrón del dispositivo de tiras de 200 μm junto con ranuras de 10-25 μm entre las tiras utilizando un software de dibujo de diseño asistido por computadora (CAD).
2. Dibuje el patrón de los dispositivos en una fotomáscara de cromo recubierta con AZP1350 utilizando la luz UV de una herramienta de litografía sin máscara.
3. Desarrolle el patrón en la fotomáscara en una serie de reveladores fotorresistentes positivos (por ejemplo, grabador de cromo) y enjuague con agua di.
4. Deshidratar una oblea de silicio en una placa caliente a 120 °C durante 15 min.
5. Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y gire-recubra un fotorresistido negativo SU-8 3010 para hacer una altura de 10-20 μm con 1500 rpm durante 30 s utilizando un recubridor de espín.
6. Hornear suavemente la oblea en dos pasos sobre una placa caliente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
7. Después de que la oblea se enfríe a temperatura ambiente, cargue la oblea en el alineador de máscaras.
8. Utilice un alineador de máscara para alinear la máscara en la oblea y exponer la oblea a la luz UV.
9. Realice el horneado posterior a la exposición a la oblea en dos pasos en una placa caliente de acuerdo con el protocolo del fabricante.
10. Desarrolle la oblea en una serie de SU-8 desarrollador y 2-Propanol, luego seque la oblea con una corriente de nitrógeno.
11. Transfiera la oblea a una placa de Petri de un tamaño adecuado.
12. Mezcle el elastómero PDMS y su agente de curado en una proporción de 10:1 p/p y vierta la mezcla en la placa de Petri.
13. Desgasificar el PDMS en un desecador hasta que desaparezcan todas las burbujas de aire, luego curar pdms en placa caliente a 80 °C durante 2 h.
14. Desprenda el PDMS curado del molde maestro usando una pinza, luego corte la porción con el diseño para que sea un sello PDMS.
    Nota: La forma puede ser cuadrada, sin embargo, una forma octogonal transfiere el patrón mejor en el borde.

6. Cultivo modelado de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes

1. Retire el polvo de la superficie de los sellos PDMS con cinta adhesiva.
2. Sumerja los sellos en etanol al 70% para esterilizar. Luego, sople etanol de la superficie de los sellos usando un plumero de aire.
3. Aplicar 5-10 μL de polímero/etanol 2-metacriloiloxietil fosforilcolina (MPC) al 2%en peso en la superficie de los sellos pdms.
   NOTA: La distribución desigual del polímero MPC puede causar un patrón interrumpido.
4. Incubar 10-30 min hasta que el polímero MPC esté completamente seco.
5. Coloque los sellos en contacto con los cubrebocas de una placa de cultivo con fondo de vidrio o un plato de imágenes de 35 mm con un cubrebocas de polímero y ponga un peso (por ejemplo, una batería AAA) en el sello durante 10 min.
6. Retire el peso y los sellos. Luego, confirme que el patrón se ha transferido bajo el microscopio.
   NOTA: Los platos estampados se pueden almacenar hasta 1 semana a temperatura ambiente.
7. Lave los pozos/platos estampados con PBS dos veces.
8. Diluir LN511-E8 con PBS a 2-4 μg/mL y recubrir el plato con LN511-E8 a 0,5-1 μg/cm2. Para psc-cms humanos, diluir LN511-E8 con 0,1% solución de gelatina en lugar de PBS. Luego, incubar durante al menos 1 h (óptimamente, más de 4 h).
9. Celdas de placa como se describe en las secciones anteriores.

7. Imágenes de lapso de tiempo de sarcómeros bajo microscopio fluorescente

1. Encienda y conecte el microscopio, la computadora asociada y también todos los periféricos requeridos.
2. Para realizar imágenes de lapso de tiempo, capture imágenes de lapso de tiempo con el aumento más alto (lente objetivo de 100X con emersión de aceite).
3. Seleccione condiciones de imágenes en vivo. Para obtener buenos datos representativos, intente ajustar a la velocidad de fotogramas más alta (se recomienda un mínimo de 20 ms o 50 fotogramas por segundo). Abra el obturador y aplique un binning necesario (4 X 4) y un recorte del área de adquisición para lograr los intervalos más cortos entre imágenes durante la proyección de imagen de lapso de tiempo.
   NOTA: La configuración puede variar dependiendo de las configuraciones de los microscopios. La cámara debe ser de alta sensibilidad y es capaz de transferir los datos a la PC conectada lo suficientemente rápido. Con este fin, utilizamos el flash ORCA con camera-link. Hemos probado una microscopía confocal giratoria y hemos adquirido imágenes a 400 fotogramas por segundo.
   1. [Opcional] Si la tasa de batimiento de las células es baja, evocar las células mediante la estimulación del campo eléctrico.
4. Ejecutar el registro de lapso de tiempo
   1. Asegúrese de que los campos de la imagen permanecen enfocados durante la grabación de la imagen de lapso de tiempo.
   2. Guarde las imágenes de lapso de tiempo en una carpeta adecuada.

8. Análisis de imágenes de lapso de tiempo usando SarcOptiM, un plugin de ImageJ / Fiji

1. Cargue una serie de imágenes de lapso de tiempo en ImageJ. Para el formato Olympus VSI, abra los archivos a través de OlympusViewer Plugin.
2. Ajuste el brillo y el contraste de la imagen para observar el patrón de sarcómero claramente(Imagen | Ajustar | Brillo/Contraste).
3. Para abrir SarcOptiM, haga clic en el menú Más herramientas (>>) y seleccione SarcOptiM.
4. Calibre el programa pulsando Ctrl + Mayús + P y el botón 1 μm en la barra de herramientas y siguiendo las instrucciones de los cuadros de diálogo.
5. Dibuje una línea a través de la región del sarcómero que se utilizará para medir el acortamiento del sarcómero.
6. Inicie el análisis de acortamiento de sarcómero pulsando SingleCell (AVI) en la barra de herramientas. Los datos representativos se muestran en la Figura 1 y la Figura 2.

Resultados

Medición del acortamiento del sarcómero utilizando líneas de reportero de PSC-CMs knock-in. PSC-CMs Sarcomere-etiquetado fue utilizado para medir el acortamiento del sarcómero. Las líneas expresan Myom2-RFP y ACTN2-mCherry de loci endógenos. TagRFP se insertó en Myom2,codificando proteínas M que se localizan en la línea M, mientras que mCherry se llamó a ACTN2,codificando α-Actinina, que se localiza en la línea Z^18,

Discusión

Psc-CMs tienen gran potencial para ser utilizado como una plataforma in vitro para modelar la enfermedad cardíaca y para probar los efectos de los fármacos. No obstante, primero debe establecerse un método preciso y unificado para evaluar las funciones de PSC-CMs. La mayoría de las pruebas funcionales funcionan con PSC-CMs, por ejemplo, electrofisiología, calcio transitorio y metabolismo^26,y uno de los primeros estudios psc-cm derivados de pacientes fue sobre el síndrome de QT largo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,	NOF Corp.	LIPIDURE-CM5206
2-Propanol	Fujifilm wako	166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)	ibidi	81156
AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)	Takara	6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs	N.A.		We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504-044
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587-010
Benzonase (25 U/µL)	Merck Millipore	70746
Blasticidin S Hydrochloride	Fujifilm wako	029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,	R&D Systems, Inc.	314-BP-010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)	abcam	ab142216
CAD drawing software,	Robert McNeel and Associates, WA, USA	Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20	Sartorius	VS2042
CHIR99021	Cayman	13122
Chromium etchant	Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan	N14B
Chromium mask coated with AZP1350	Clean Surface Technology Co., Japan	CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))	Takara	9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	D5796
Ethanol (99.5)	Fujifilm wako	057-00456
Fetal Bovine Serum	Moregate	59301104
FGF-10, Human, Recombinant,	R&D Systems, Inc.	345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant	Fujifilm wako	060-04543
Gelatin from porcine skin powder	Sigma-Aldrich	G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)	Sigma-Aldrich	G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates	MatTek	P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12	Thermo Fisher Scientific	11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)	Thermo Fisher Scientific	35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	Fujifilm wako	196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)	Nippi	892012
Mask aligner	Union Optical Co., Ltd., Japan	PEM-800
Maskless lithography tool	NanoSystem Solutions, Inc., Japan	D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)	Merck Millipore	SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)	N.A.		Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
PD0325901	Stemgent	04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Petri dish	Sansei medical co. Ltd	01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)	Nippon Gene	311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer	Dow Corning Corp., MI, USA	SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)	Polyscience	24765-1
Positive photoresist developer	Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan	NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
Proteinase K	Takara	9034
Puromycin Dihydrochloride	Fujifilm wako	166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein	R&D Systems, Inc.	338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)	Thermo Fisher Scientific	12604-039
RPMI1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875-119
Silicon wafer	Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan	N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
Spin-coater	Mikasa Co., Ltd., Japan	MS-A100
Spininng confocal microscopy	Oxford Instruments	Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)	Fujifilm wako	195-16053
SU-8 3010	Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA	SU-8 3010
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA	SU-8 developer
Tris-EDTA	Nippon Gene	314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant	Fujifilm wako	226-01781