Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.

Zusammenfassung

Diese Methode kann verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung mit pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten mit fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (PSC-CMs) können sowohl aus embryonalen als auch aus induzierten pluripotenten Stammzellen (ES/iPS) hergestellt werden. Diese Zellen bieten vielversprechende Quellen für die Modellierung von Herzerkrankungen. Bei Kardiomyopathien ist die Sarkomer-Verkürzung eine der physiologischen Standardbewertungen, die bei erwachsenen Kardiomyozyten zur Untersuchung ihrer Krankheitsphänotypen verwendet werden. Die verfügbaren Methoden sind jedoch nicht geeignet, die Kontraktilität von PSC-CMs zu beurteilen, da diese Zellen unterentwickelte Sarkomere aufweisen, die unter Phasenkontrastmikroskopie unsichtbar sind. Um dieses Problem anzugehen und eine Sarkomerverkürzung mit PSC-CMs durchzuführen, wurden fluoreszierend markierte Sarkomerproteine und fluoreszierende Live-Bildgebung verwendet. Dünne Z-Linien und eine M-Linie befinden sich an beiden Enden bzw. in der Mitte eines Sarkomers. Z-Linienproteine - α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) und Aktin-assoziiertes LIM-Protein (PDLIM3) - und ein M-Linienprotein - Myomesin-2 (Myom2) - wurden mit fluoreszierenden Proteinen markiert. Diese markierten Proteine können aus endogenen Allelen als Knock-Ins oder aus Adeno-assoziierten Viren (AAVs) exprimiert werden. Hier stellen wir die Methoden vor, um maus- und humane pluripotente Stammzellen zu Kardiomyozyten zu differenzieren, AAVs herzustellen und Live-Imaging durchzuführen und zu analysieren. Wir beschreiben auch die Methoden zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempeln für eine gemusterte Kultur von PSC-CMs, die die Analyse der Sarkomerverkürzung mit fluoreszierend markierten Proteinen erleichtert. Zur Beurteilung der Sarkomerverkürzung wurden Zeitrafferbilder der schlagenden Zellen mit einer hohen Bildrate (50-100 Bilder pro Sekunde) unter elektrischer Stimulation (0,5-1 Hz) aufgenommen. Um die Sarkomerlänge im Verlauf der Zellkontraktion zu analysieren, wurden die aufgenommenen Zeitrafferbilder SarcOptiM, einem Plug-in für ImageJ/Fiji, unterzogen. Unsere Strategie bietet eine einfache Plattform für die Untersuchung von Phänotypen von Herzerkrankungen in PSC-CMs.

Einleitung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die häufigste Todesursache¹ und Kardiomyopathie stellt die dritte Ursache für kardiale Todesfälle^{dar 2}. Kardiomyopathie ist eine kollektive Gruppe von Krankheiten, die die Herzmuskulatur betreffen. Die jüngsten Entwicklungen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) und die gerichtete Differenzierung von iPS-Zellen in Richtung Kardiomyozyten (PSC-CMs) haben die Tür für die Untersuchung von Kardiomyozyten mit Patientengenom als In-vitro-Modell der Kardiomyopathie geöffnet. Diese Zellen können verwendet werden, um die Pathophysiologie von Herzerkrankungen zu verstehen, ihre molekularen Mechanismen aufzuklären und verschiedene therapeutische Kandidaten zu testen³. Es gibt ein enormes Interesse, so dass patientenabgeleitete iPS-Zellen erzeugt wurden (z. B. hypertrophe Kardiomyopathie [HCM]^4,5, arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie [ARVC]⁶, dilatative Kardiomyopathie [DCM]⁷und mitochondriale Kardiomyopathien^8,9). Da eines der Merkmale der Kardiomyopathie die Dysfunktion und Störung von Sarkomeren ist, wird ein gültiges Werkzeug benötigt, das die Sarkomerfunktion einheitlich misst.

Die Sarkomer-Verkürzung ist die am weitesten verbreitete Technik zur Beurteilung der Sarkomerfunktion und der Kontraktilität von erwachsenen Kardiomyozyten aus Tiermodellen und Menschen. Um eine Sarkomerverkürzung durchzuführen, sind gut entwickelte Sarkomere erforderlich, die unter Phasenkontrast sichtbar sind. PSC-CMs, die in vitro kultiviert wurden, zeigen jedoch unterentwickelte und unorganisierte Sarkomere und können daher nicht verwendet werden, um die Sarkomerverkürzung richtig zu messen¹⁰. Diese Schwierigkeit, die Kontraktilität von PSC-CMs richtig einzuschätzen, behindert ihre Nutzung als Plattform zur Beurteilung der Herzfunktionen in vitro. Um die Kontraktilität von PSC-CMs indirekt zu beurteilen, wurden Rasterkraftmikroskopie, Mikropfostenarrays, Zugkraftmikroskopie und Impedanzmessungen verwendet, um die Auswirkungen der von diesen Zellen ausgeübten Bewegung auf ihre Umgebung zu messen^11,12,13. Ausgefeiltere und weniger invasive Videomikroskopie-Aufnahmen tatsächlicher zellulärer Bewegungen (z. B. SI8000 von SONY) können alternativ zur Beurteilung ihrer Kontraktilität verwendet werden, diese Methode misst jedoch nicht direkt die Sarkomerbewegung oder die Krafterzeugungskinetik¹⁴.

Um die Sarkomerbewegung in PSC-CMs direkt zu messen, entstehen neue Ansätze, wie das Fluoreszenz-Tagging zu Sarkomerprotein. Zum Beispiel wird Lifeact verwendet, um filamentöses Aktin (F-Aktin) zu kennzeichnen, um die Sarkomerbewegung^15,16zu messen. Gentechnisch veränderte iPS-Zellen sind eine weitere Möglichkeit, Sarkomerproteine (z.B. α-Actinin [ACTN2] und Myomesin-2 [MYOM2]) durch fluoreszierendes Protein^17,18,19zu markieren.

In diesem Artikel beschreiben wir, wie zeitrafferbildende Bildgebung zur Messung der Sarkomerverkürzung mit Myom2-TagRFP (mausembryonale Stammzellen [ES]) und ACTN2-mCherry (menschliche iPS-Zellen) durchgeführt werden kann. Wir zeigen auch, dass eine gemusterte Kultur die Ausrichtung von Sarkomern erleichtert. Darüber hinaus beschreiben wir eine alternative Methode der Sarkomer-Markierung unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren (AAVs), die weit verbreitet auf patientenbasierte iPS-Zellen angewendet werden kann.

Protokoll

1. Differenzierung pluripotenter Stammzellen der Maus

1. Pflege von MAUS-ES-Zellen
   1. Erhaltungsmedium: Mischen Sie 50 ml fetales Rinderserum (FBS), 5 ml L-Alanin-L-Glutamin, 5 ml nicht-essentielle Aminosäure (NEAA), 5 ml 100 mM Natriumpyruvat und 909 μl 55 mM 2-Mercaptoethanol mit 450 ml Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Ergänzung Leukämie-Inhibitor-Faktor (LIF), CHIR-99021 und PD0325901 bei einer Endkonzentration von 1000 U / ml, 1 μM bzw. 3 μM. Sterilisieren Sie das Medium durch einen 0,22 μm Filter.
   2. FBS-Medium: Mischen Sie 55 ml FBS, 5,5 ml L-Alanin-L-Glutamin, 5,5 ml Natriumpyruvat und 5,5 ml NEAA bis 500 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) hohe Glukose. Filtrieren Sie das Medium durch einen 0,22 μm Filter, um es zu sterilisieren.
   3. Kultur SMM18 Maus ES-Zellen, in denen TagRFP in den Myom2 Locus auf einer gelatinierten 6 cm Schüssel im Erhaltungsmedium wie zuvor beschrieben¹⁸geschlagen wurde. Passage alle 2-3 Tage.
2. Herstellung von serumfreiem Differenzierungsmedium (SFD)
   1. Basal SFD: Mischen Sie 250 ml Hams F-12, 750 ml Iscoves Modified Dulbecco's Medium (IMDM), 10 ml B27-Ergänzung abzüglich Vitamin A, 5 ml N2-Ergänzung, 10 ml L-Alanin-L-Glutamin, 5 ml 10% Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 10 ml Penicillin und Streptomycin (10.000 U / ml). Filtern Sie durch 0,22 μm Sieb, um zu sterilisieren.
   2. Ascorbinsäure bei 5 mg/ml in destilliertem Wasser auflösen und durch 0,22 μm Sieb zertrieren, um sie zu sterilisieren.
   3. 13 μL 1-Thioglycerin auf 1 ml IMDM verdünnen. Beziehen Sie sich hierin auf dieses verdünnte 1-Thioglycerin als MTG.
   4. Fügen Sie 10 μL Ascorbinsäure (5 mg/ ml) und 3 μL MTG zu 1 ml basalem SFD am Tag der Anwendung hinzu. Bezeichnen Sie diese Mischung hierin als vollständige SFD.
3. Tag 0, Embryoidkörperbildung (EB) zur Differenzierung
   1. Ernten Sie SMM18-Maus-ES-Zellen mit einer rekombinanten Trypsin-ähnlichen Protease (rTrypsin) und zählen Sie die Zellen.
   2. Zentrifuge 5 x 10⁵ Zellen bei 300 x g für 3 min bei 4 °C, resuspendieren in 10 mL komplette SFD und in eine 10-cm-Petrischale aussäen. Die Zellen werden bei 37 °C und 5% CO₂ für 50 h kultiviert.
4. Differenzierung Tag 2
   1. Fügen Sie Activin A, humanen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (hVEGF) und knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP4) hinzu, um SFD in einer Endkonzentration von 5 ng / ml, 5 ng / ml bzw. 1,9 ng / ml zu vervollständigen.
      HINWEIS: Die BMP4-Konzentrationen können je nach BMP4-Charge unterschiedlich sein. Testen Sie mehrere Konzentrationen in einer kleinen Studie, bevor Sie eine neue Charge verwenden, und bestimmen Sie die beste Konzentration für die kardiale Differenzierung.
   2. EBs aus einer Petrischale in ein 15 ml Röhrchen und eine Zentrifuge bei 50-100 x g für 3 min bei 4 °C geben.
   3. In der Zwischenzeit das in Schritt 1.4.1 vorbereitete Medium in die Petrischale geben, um die verbleibenden EBs zu schützen, die trocken sind.
   4. Saugen Sie den Überstand aus dem 15-ml-Röhrchen ab, resuspendieren Sie die EBs mit dem Medium in der Petrischale und geben Sie die EB-Lösung zurück in die Schüssel. Anschließend kultivieren Sie die EBs bei 37 °C und 5% CO₂ für 46 h.
5. Differenzierung Tag 4
   1. Gelatinieren Sie eine 10 cm Gewebekultur behandelte Schale mit 5 bis 10 ml 0,1% Gelatine für mindestens 5 min. Aspirieren Sie Gelatine direkt vor dem Aussäen der Zellen.
   2. Vorbereitungsmedium: Mischen Sie den grundlegenden Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), FGF10 und hVEGF, um SFD bei 5 ng / ml, 25 ng / ml bzw. 5 ng / ml Endkonzentrationen abzuschließen. Für ein 10 cm großes Gericht 10 ml zubereiten.
   3. Transferzellen von der Petrischale in ein 15-ml-Röhrchen. Fügen Sie 5 ml PBS in die Petrischale hinzu, waschen Sie sie mehrmals und geben Sie sie in die 15-ml-Röhrchen, um die verbleibenden Zellen zu sammeln. Zentrifuge bei 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
   4. Überstand absaugen, 1 ml rTrypsin hinzufügen und bei 37 °C für 3 min inkubieren.
   5. Wirbel kurz, um EBs zu dissoziieren, fügen Sie 9 ml 10% FBS-Medium hinzu, Wirbel wieder und zählen Sie die Zellen.
   6. 1,5 x 10⁷ Zellen bei 300 x g, 4 °C für 3 min zentrifugieren, mit den in Schritt 1.4.2 vorbereiteten Medien wieder aufbereiten und in die gelatinierte Schale einsäen. 2 Tage bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren.
      HINWEIS: An Tag 7 oder 8 kann ein ausgedehntes Schlagen von PSC-CMs beobachtet werden.
6. Arzneimittelauswahl an den Differenzierungstagen 7 und 9: Refeed des Mediums mit Puromycin (2 μg/ml in der Endkonzentration), um Nicht-Kardiomyozyten am Tag 7 und 9 der Differenzierung zu eliminieren.
   HINWEIS: Die eltern Linie von SMM18 sind syNP4-Maus-ES-Zellen, die NCX1-promotorgetriebenes Puromycin-resistentes Gen^{20 beherbergen.}
7. Tag 10, Replate für zukünftige Experimente
   1. Beschichten Sie eine Glasbodenkulturplatte oder eine 35 mm abbildungsgebende Schale, die einen Polymerdeckel enthält, mit 0,1% Gelatine. Um die Reifung zu verbessern, beschichten Sie das Geschirr mit Laminin-511 E8-Fragment (LN511-E8) bei 1 μg/cm² für 30-60 min bei Raumtemperatur¹⁸. Um PSC-CMs in bestimmten Mustern von Interesse zu kulturieren, lesen Sie bitte die Schritte 4 und 5 für die Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempeln.
   2. Um SMM18 PSC-CMs zu ernten, waschen Sie die Schüssel zweimal mit PBS, tragen Sie 1 ml rTrypsin auf und inkubieren Sie 3 minuten bei 37 °C.
   3. Sammeln Sie Zellen in 9 ml 10% FBS-Medium, suspendieren Sie und zählen Sie die Zellen. Platten Sie die Zellen bei 50.000-100.000 Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte oder 250.000-500.000 Zellen in einer 35-mm-Bildgebungsschale.
   4. Zentrifugieren Sie eine ausreichende Anzahl von Zellen (300 x g, 3 min) und resuspendieren Sie die Zellen mit vollständiger SFD, ergänzt mit FBS (Endkonzentration bei 10%).
   5. Über Nacht inkubieren und das Kulturmedium wechseln, um SFD mit Puromycin abzuschließen.
   6. Wechseln Sie ab Tag 14 das Kulturmedium zwei- bis dreimal pro Woche mit vollständiger SFD bis zum Tag 21-28, wenn Myom2-RFP an Bedeutung gewinnt. Informationen zur AAV-basierten Transduktion von fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen finden Sie in Schritt 3.

2. Differenzierung humaner pluripotenter Stammzellen

1. Aufbereitung von Differenzierungsmedien
   1. RPMI+B27-Ins: Mischen Sie 500 ml RPMI 1640 Medium, 10 ml B27 minus Insulin und 5,25 ml L-Alanin-L-Glutamin.
   2. RPMI + B27 + Ins: Mischen Sie 500 ml RPMI, 10 ml B27-Ergänzung und 5,25 ml L-Alanin-L-Glutamin.
2. Erhaltung menschlicher iPS-Zellen
   1. Passage menschlicher iPS-Zellen zweimal pro Woche mit AK02N auf LN511-E8 nach zuvor veröffentlichter Methode mit einigen Modifikationen²¹.
   2. Ernten Sie Zellen mit einer 3-minütigen Behandlung von rTrypsin und sammeln Sie sie in 10% FBS-Medium. Zellen und Zentrifuge bei 300 x g für 3 min bei 4 °C zählen. Samen Sie 75.000-125.000 Zellen in einer Vertiefung von 6 Well-Platten mit 2 ml AK02N, ergänzt mit LN511-E8 und Y27632 in der Endkonzentrationvon 0,5 μg/ml (0,1 μg/cm2) bzw. 10 μM.
   3. Bei 37 °C und 5% CO₂ inkubieren und das Medium am Folgetag durch 2 ml AK02N ohne Zusatz ersetzen. Wechseln Sie alle zwei bis drei Tage die Medien und alle drei bis vier Tage.
3. Tag -4: Replate vor der Differenzierung
   1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 0,5 μg/cm² LN511-E8, verdünnt in PBS. Anschließend mindestens 30 min bei 37 °C und 5% CO 2 oder₁ h bei Raumtemperatur inkubieren. Saugbeschichtungslösung direkt vor der Aussaat von Zellen.
   2. Ernten Sie menschliche iPS-Zellen mit rTrypsin und zählen Sie Zellen wie in Schritt 2.2.2.
   3. Zentrifuge 1,25 x 10⁵ Zellen für eine Vertiefung einer 6-Well-Platte bei 300 x g für 3 min bei 4 °C und Resuspend in 2 mL AK02N ergänzt mit LN511-E8 (Endkonzentration 0,5 μg/ml oder 0,1 μg/cm2) und Y27632 (Endkonzentration 10 μM) pro Vertiefung.
   4. Saugbeschichtungslösung, Samen resuspendierte Zellen in die beschichtete Platte und inkubieren bei 37 °C und 5% CO₂.
4. Tage -3 und -1: Medium durch 2 ml AK02N ersetzen.
5. Tag 0: Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml RPMI+B27-Ins, ergänzt mit CHIR99021 (Endkonzentration 6 μM) pro Vertiefung, um mit der Differenzierung zu beginnen.
6. Tag 2: Ersetzen Sie das Medium durch 2 ml RPMI+B27-Ins durch WntC59 (Endkonzentration 2 μM) pro Vertiefung.
7. Tag 4: Ersetzen Sie medium durch 2 ml RPMI + B27-Ins pro Vertiefung.
8. Tag 7 und Tag 9: Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml RPMI + B27 + Ins mit Puromycin (Endkonzentration 10 μg / ml) pro Vertiefung, um PSC-CMs selektiv zu kulturieren.
   HINWEIS: Die actN2-mCherry-Linie, die in dieser Studie verwendet wird, verfügt über eine Kassette mit interner ribosomaler Eintrittsstelle (IRES), Ein Puromycin-resistentes Gen, das in die 3′-untranslierte Region (UTR) des TNNT2-Locus eingefügt wurde, und mCherry, das das Stop-Codon von ACTN2 ersetzt. Um Kardiomyozyten ohne Knock-in zu reinigen, lesen Sie bitte die Schritte 3 und 4.
9. Tag 10: Replate für zukünftige Experimente
   1. Beschichten Sie eine 35 mm abbildungsgebende Schale mit einem Polymerdeckel mit 0,5-1 μg/cm² LN511-E8 verdünnt in 0,1% Gelatine. Inkubieren Sie 2-4 h bei Raumtemperatur für eine langfristige Lebensfähigkeit. Um PSC-CMs in gewünschten Mustern zu kulturieren, lesen Sie bitte die Schritte 4 und 5 für die Vorbereitung von PDMS-Stempeln.
   2. Um menschliche PSC-CMs zu ernten, waschen Sie die Schale zweimal mit PBS, tragen Sie 1 ml rTrypsin pro Vertiefung auf und inkubieren Sie 3 Minuten bei 37 °C.
   3. Sammeln Sie Zellen in 4 ml 10% FBS-Medium, suspendieren Sie und zählen Sie die Zellen. Platte 250.000-500.000 Zellen pro 35 mm Bildschale.
   4. Zentrifugieren Sie eine ausreichende Anzahl von Zellen bei 300 x g für 3 min bei 4 °C, resuspendieren Sie mit RPMI + B27 + Ins mit Puromycin (10 μg / ml) und Platten auf der beschichteten 35 mm Bildgebungsschale.
   5. Über Nacht inkubieren. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das Kulturmedium durch RPMI+B27+Ins durch Puromycin (10 μg/ml).
   6. Wechseln Sie ab Tag 14 das Kulturmedium 2-3 mal pro Woche mit RPMI+B27+Ins bis zum Tag 21-28 für die Bildgebung. Informationen zur AAV-basierten Transduktion von fluoreszierend markierten Sarkomerproteinen finden Sie in Schritt 3.

3. Fluoreszierende Markierung von Sarkomeren mit Adeno-assoziierten Viren

1. Vorbereitung vor der AAV-Produktion
   1. Halten Sie HEK293T-Zellen in DMEM ergänzt mit FBS (Endkonzentration 10%) auf einer 10 cm großen Gewebekulturplatte. Passagezellen dreimal pro Woche.
   2. Polyethylenimin (PEI) bei 1 mg/ml vorbereiten. Mischen Sie 50 mg Polyethylenimin MAX 40000 und 40 ml Reinstwasser. Stellen Sie den pH-Wert mit 1 N NaOH auf 7,0 ein. Dann das endige Volumen mit Reinstwasser auf 50 ml bringen und durch ein 0,22 μm Sieb filtern.
   3. Bereiten Sie einen Shuttle-Vektor mit einem Sarkomer-Markierungsgen (z. B. TCAP oder PDLIM3, das mit einem grün fluoreszierenden Protein [GFP] verschmolzen ist) vor, der von einem Kardiomyozyten-spezifischen Promotor wie Herztroponin T (cTNT)²²angetrieben wird.
      HINWEIS: Für diesen Fall haben wir monomere verstärkte GFP mit Mutationen von V163A, S202T, L221V²³verwendet.
2. Tag 0, Durchgang HEK-Zellen
   1. Wenn die Zellen die Konfluenz erreichen, werden 2,0 x^{10 7} HEK293T-Zellen zu einer 15 cm großen Gewebekulturplatte mit 20 ml DMEM mit 10% FBS durchgereicht.
3. Tag 1, Transfektion
   1. Mischen Sie 13,5 μg des Shuttle-Vektors, 26 μg pHelper (ein Vektor, der E2A, E4 und VA des Adenovirus kodiert), 16,5 μg pRC6 (ein Vektor, der AAV2 Rep und AAV6 Cap Gene kodiert) und 1 ml DMEM ohne Natriumpyruvat (DMEM-Pyr).
   2. Mischen Sie 224 μL PEI (1 mg/ml, hergestellt in Schritt 3.1.2) und 776 μL DMEM-Pyr.
   3. Mischen und inkubieren Sie die Plasmidlösung und die PEI-Lösung bei Raumtemperatur für 30 min.
   4. Die Plasmid/PEI-Lösung wird den in Schritt 3.2 hergestellten HEK293T-Zellen zugesetzt.
4. Tag 2, mittlerer Wechsel
   1. Wechseln Sie 24 Stunden nach der Transfektion das Medium in DMEM-Pyr. Kulturzellen bis zur Ernte von AAV am Tag 7. AAV wird in den Kulturmedien veröffentlicht.
5. Tag 7, AAV-Sammlung, -Konzentration und Puffersubstitution mit minimaler Reinigungsmethode²⁴
   1. Inkubieren Sie eine zentrifugale Ultrafiltrationseinheit (100k Molekulargewichts-Cut-off [MWCO]) mit 5 mL 1% BSA in PBS bei Raumtemperatur für 15 min. Dann zentrifugieren Sie die Ultrafiltrationseinheit bei 500 x g für 2 min und saugen Sie sowohl gefilterte als auch verbleibende Lösungen an.
   2. Übertragen Sie das Medium von der 15-cm-Schüssel, die AAV erzeugt hat, in ein neues 50-ml-Konikalrohr und eine Zentrifuge (500 x g, 5 min). Filtern Sie den Überstand durch ein 0,45 μm Spritzensieb, um Zellrückstände zu entfernen und Suspension auf die Ultrafiltrationseinheit aufzutragen.
   3. Zentrifuge bei 2000 x g für 90 min oder bis zur Konzentration des Kulturüberstandes 0,5 bis 1 ml.
   4. Saugen Sie das Filtrat an und tragen Sie 15 ml PBS auf die Ultrafiltrationseinheit auf.
   5. Wiederholen Sie die Zentrifugation, bis das Konzentrat 0,5-1 ml wird.
   6. Wiederholen Sie 3.5.4 und 3.5.5.
   7. Konzentriertes AAV in ein neues 1,5-ml-Rohr geben und bei 4 °C oder -20 °C lagern.
      HINWEIS: AAV kann in P1-Einrichtungen verwendet werden, befolgt jedoch die lokalen Regeln und Vorschriften. AAV kann auch mit konventionellen Methoden hergestellt werden.
6. Berechnung des AAV-Titers
   1. Mischen Sie 5 μL AAV, 195 μL DMEM-Pyr und 10 U Benzonase und inkubieren Sie bei 37 °C für 1 h.
   2. 200 μL Proteinase K-Puffer (0,02 M Tris HCl und 1% SDS) und 5 μL Proteinase K (20 mg/ml) fündigen und bei 37 °C für 1 h inkubieren.
   3. Bereiten Sie sorgfältig 400 μL einer 25:24:1 Phenol/Chloroform/Isoamylalkohollösung, Wirbel für 1 min und Zentrifuge bei 20.000 x g für 1 min vor.
   4. Übertragen Sie 200 μL der wässrigen Phase auf eine neue 1,5-ml-Röhrchen, aus der etwa die Hälfte der ursprünglichen AAV-Genome hervorgeht.
   5. 1 μL Glykogen (20 mg/ml) zu 20 μL 3 M_CH3COONa (pH 5,2) und Wirbel hinzufügen. 250 μL 2-Propanol zu 100 μL 100% Ethanol und wirbeln Sie erneut hinzu.
   6. Bei -80 °C 15 min inkubieren. Dann Zentrifuge bei 20.000 x g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
   7. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie dem Röhrchen 70% Ethanol hinzu. Dann Zentrifuge bei 20.000 x g, 4 °C für 5 min.
   8. Überstand absaugen und an der Luft trocknen, bis das Pellet klar ist.
   9. Fügen Sie 200 μL Tris-Ethylendiamintetraessigsäure (TE; pH 8,0) hinzu, um die AAV-Genome aufzulösen. Anschließend die Probe 100-fach mit TE verdünnen.
   10. Erstellen Sie einen Standard mit pAAV-CMV-Vector bei 6,5 ng/μL mit TE, um 10⁹ Vektorgenome (vg)/μL zu erhalten. Machen Sie dann eine Reihe von 10-fachen Verdünnung von 10⁴ auf 10⁸ mit TE.
   11. Mischen Sie 1 μL Proben-DNA (oder die Standards), 0,4 μL Primer (5 μM), 3,6 μL destilliertes Wasser und 5 μL SYBR Green Master-Mix. Primer, die sich auf ITR befinden, sind 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ und 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
   12. Führen Sie eine Real-Time-PCR unter der folgenden Bedingung durch: Anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 60 s, 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 s und Glühen und Ausdehnung bei 60 °C für 30 s, gefolgt von einer Schmelzkurve.
   13. Basierend auf den Standards und Ct-Werten liefert eine Real-Time-PCR-Maschine die Kopienzahl des Vektorgenoms in 1 μL einer Probe. Berechnen Sie den ursprünglichen AAV-Titer mit der folgenden Gleichung: eine Kopienzahl, die von real-time PCR (vg/μL) x 8 x^{10 3} x 2 bereitgestellt wird, wobei 8 x^{10 3} als Verdünnungsfaktor während der AAV-Genomisolation und 2 als Differenzfaktor von AAV (Einzelstrang) und Plasmid (Doppelstrang) angegeben werden.
7. Transduktion zu PSC-CMs
   1. Zählen Sie PSC-CMs in einem extra Brunnen oder extra Gericht.
   2. Verdünnen Sie AAVs (1 x 10⁴ bis 1 x 10⁶ vg/Zelle), um 50 μL mit PBS zu bilden. AAVs bei der Multiplizität der Infektion (MOI) von 1 x 10⁴ bis 1 x 10⁶ vg/Zelle auf PSC-CMs auftragen und PSC-CMs 3 Tage lang mit AAV in den entsprechenden Differenzierungsmedien für Maus und Mensch PSC-CMs anlegen, dann Medien zu Kulturmedium ohne AAV wechseln.
   3. Verwenden Sie PSC-CMs für die Bildgebung von Lebendzellen nach 7 Tagen oder mehr nach der Transduktion.

4. [Optional] AAV-basierte Reinigung von PSC-CMs

1. Vorbereitung von AAV
   1. Bereiten Sie AAV wie in Schritt 3 beschrieben mit einem Shuttle-Vektor vor, der ein Blasticidin-resistentes Gen unter der Kontrolle des cTNT-Promotors exprimieren.
2. Transduktion zu differenzierenden iPS-Zellen
   1. Differenzieren Sie menschliche iPS-Zellen für 4 Tage nach dem in Schritt 2 beschriebenen Protokoll und zählen Sie die Anzahl der Zellen in einer zusätzlichen Vertiefung.
   2. Nachdem Sie das Medium an Tag 4 gewechselt haben, wenden Sie AAVs am MOI von 1 x 10⁵ vg/Zelle auf differenzierende PSCs in RPMI+B27-Ins-Medien an.
   3. Erfrischen Sie das Medium an Tag 7 mit RPMI + B27 + Ins und fügen Sie 2,5-10 μg / ml Blasticidin hinzu.
   4. An Tag 10 sind PSC-CMs bereit, neu zu platten.

5. Erstellung von PDMS-Stempeln

1. Entwerfen Sie das Gerätemuster von 200 μm-Streifen zusammen mit 10-25 μm-Nuten zwischen den Streifen mit einer CAD-Zeichnungssoftware (Computer Aided Design).
2. Zeichnen Sie das Muster der Geräte auf eine mit AZP1350 beschichtete Chrom-Fotomaske mit UV-Licht eines maskenlosen Lithographie-Werkzeugs.
3. Entwickeln Sie das Muster auf der Fotomaske in einer Reihe von positiven Fotolackentwicklern (z. B. Chromätzung) und spülen Sie es mit DI-Wasser ab.
4. Einen Siliziumwafer auf einer Heizplatte bei 120 °C für 15 min dehydrieren.
5. Lassen Sie den Wafer auf Raumtemperatur abkühlen und beschichten Sie einen negativen Fotolack SU-8 3010, um eine Höhe von 10-20 μm mit 1500 U / min für 30 s mit einem Spin-Coater zu erreichen.
6. Backen Sie die Waffel in zwei Schritten weich auf einer Kochplatte nach dem Protokoll des Herstellers.
7. Nachdem der Wafer auf Raumtemperatur abgekühlt ist, laden Sie den Wafer auf den Mask Aligner.
8. Verwenden Sie einen Mask Aligner, um die Maske auf dem Wafer auszurichten und den Wafer UV-Licht auszusetzen.
9. Führen Sie das Backen nach der Exposition auf die Waffel in zwei Schritten auf einer Heizplatte gemäß dem Protokoll des Herstellers durch.
10. Entwickeln Sie den Wafer in einer Serie von SU-8-Entwicklern und 2-Propanolen und trocknen Sie den Wafer dann mit einem Stickstoffstrom.
11. Den Wafer in eine Petrischale geeigneter Größe geben.
12. PDMS-Elastomer und sein Härter im Verhältnis 10:1 w/w mischen und die Mischung in die Petrischale gießen.
13. Entgasen Sie das PDMS in einem Trockenmittel, bis alle Luftblasen verschwinden, und härten Sie PDMS dann auf der Heizplatte bei 80 °C für 2 h aus.
14. Schälen Sie das ausgehärtete PDMS mit einer Pinzette von der Masterform ab und schneiden Sie dann den Teil mit dem Design aus, um ein PDMS-Stempel zu sein.
    HINWEIS: Die Form kann quadratisch sein, eine achteckige Form überträgt das Muster jedoch besser am Rand.

6. Gemusterte Kultur pluripotenter Stammzell-abgeleiteter Kardiomyozyten

1. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche von PDMS-Stempeln mit Ausrätband.
2. Tauchen Sie die Stempel in 70% Ethanol, um sie zu sterilisieren. Dann blasen Sie Ethanol mit einem Luftstaubwedel von der Oberfläche der Stempel ab.
3. 5-10 μL 0,5 Gew.-% 2-Methacryloyloxyethylphosphorylcholin (MPC)-Polymer/Ethanol auf die Oberfläche von PDMS-Stempeln auftragen.
   HINWEIS: Eine ungleichmäßige Verteilung des MPC-Polymers kann zu einem gestörten Muster führen.
4. Inkubieren Sie 10-30 min, bis das MPC-Polymer vollständig getrocknet ist.
5. Legen Sie die Stempel in Kontakt mit Abdecklippen einer Glasbodenkulturplatte oder einer 35-mm-Bildschale mit einem Polymerdeckel und legen Sie ein Gewicht (z. B. eine AAA-Batterie) für 10 Minuten auf den Stempel.
6. Entfernen Sie das Gewicht und die Stempel. Bestätigen Sie dann, dass das Muster unter dem Mikroskop übertragen wurde.
   HINWEIS: Gestempelte Teller/Geschirr können bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert werden.
7. Waschen Sie die gestempelten Brunnen / Geschirr zweimal mit PBS.
8. LN511-E8 mit PBS bei 2-4 μg/ml verdünnen und die Schale mit LN511-E8 bei 0,5-1 μg/cm2^beschichten. Für menschliche PSC-CMs LN511-E8 mit 0,1% iger Gelatinelösung anstelle von PBS verdünnen. Dann mindestens 1 h (optimal mehr als 4 h) inkubieren.
9. Plattenzellen wie in den vorherigen Abschnitten beschrieben.

7. Zeitrafferaufnahme von Sarkomeren unter dem Fluoreszenzmikroskop

1. Schalten Sie das Mikroskop, den zugehörigen Computer und alle erforderlichen Peripheriegeräte ein und schließen Sie sie an.
2. Um Zeitrafferbilder durchzuführen, nehmen Sie Zeitrafferbilder mit der höchsten Vergrößerung auf (100-faches Objektiv mit Ölemersion).
3. Wählen Sie Live-Imaging-Bedingungen aus. Um gute repräsentative Daten zu erhalten, versuchen Sie, sich an die höchste Framerate anzupassen (mindestens 20 ms oder 50 Bilder pro Sekunde werden empfohlen). Stellen Sie den Verschluss auf und wenden Sie ein notwendiges Binning (4 x 4) und einen Zuschnitt des Aufnahmebereichs an, um die kürzesten Intervalle zwischen den Bildern während der Zeitrafferaufnahme zu erreichen.
   HINWEIS: Die Einstellung kann je nach Konfiguration der Mikroskope variieren. Die Kamera muss hochempfindlich sein und ist in der Lage, die Daten schnell genug auf den angeschlossenen PC zu übertragen. Zu diesem Zweck haben wir ORCA-Blitz mit Camera-Link verwendet. Wir haben eine sich drehende konfokale Mikroskopie getestet und Bilder mit 400 Bildern pro Sekunde aufgenommen.
   1. [Optional] Wenn die Schlagrate der Zellen niedrig ist, rufen Sie die Zellen durch elektrische Feldstimulation hervor.
4. Ausführen des Zeitrafferdatensatzes
   1. Stellen Sie sicher, dass die abgebildeten Felder während der Aufzeichnung des Zeitrafferbilds im Fokus bleiben.
   2. Speichern Sie die Zeitrafferbilder in einem geeigneten Ordner.

8. Analyse der Zeitraffer-Bildgebung mit SarcOptiM, einem ImageJ/Fiji-Plugin

1. Laden Sie eine Reihe von Zeitrafferbildern in ImageJ. Öffnen Sie dateien für das Olympus VSI-Format über das OlympusViewer Plugin.
2. Passen Sie Helligkeit und Kontrast des Bildes an, um das Sarkomermuster deutlich zu beobachten (Bild | | anpassen Helligkeit/Kontrast).
3. Öffnen Sie SarcOptiM, indem Sie auf das Menü Weitere Tools (>>) klicken und SarcOptiMauswählen.
4. Kalibrieren Sie das Programm, indem Sie Strg + Umschalt + P und die 1 μm-Taste auf der Symbolleiste drücken und den Anweisungen der Dialogfelder folgen.
5. Zeichnen Sie eine Linie über den Bereich des Sarkomers, die zur Messung der Sarkomer-Verkürzung verwendet wird.
6. Starten Sie die Sarkomer-Verkürzungsanalyse, indem Sie SingleCell (AVI) auf der Symbolleiste drücken. Repräsentative Daten sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.

Ergebnisse

Messung der Sarkomerverkürzung mit Knock-in-PSC-CMs-Reporterlinien. Sarcomere-markierte PSC-CMs wurden verwendet, um die Sarkomerverkürzung zu messen. Die Linien exprimieren Myom2-RFP und ACTN2-mCherry aus endogenen Loci. TagRFP wurde in Myom2eingefügt und kodierte M-Proteine, die sich in der M-Linie lokalisieren, während mCherry in ACTN2eingelegt wurde, das α-Actinin kodiert, das auf die Z-Linie^18,

Diskussion

PSC-CMs haben ein großes Potenzial, als In-vitro-Plattform zur Modellierung von Herzerkrankungen und zur Prüfung der Wirkung von Medikamenten genutzt zu werden. Dennoch muss zunächst eine genaue, einheitliche Methode zur Bewertung der Funktionen von PSC-CMs etabliert werden. Die meisten Funktionstests arbeiten mit PSC-CMs, z. B. Elektrophysiologie, Calciumtransient und Stoffwechsel^26,und eine der ersten patientenbasierten PSC-CM-Studien war über das Long-QT-Syndrom^27...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,	NOF Corp.	LIPIDURE-CM5206
2-Propanol	Fujifilm wako	166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)	ibidi	81156
AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)	Takara	6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs	N.A.		We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504-044
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587-010
Benzonase (25 U/µL)	Merck Millipore	70746
Blasticidin S Hydrochloride	Fujifilm wako	029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,	R&D Systems, Inc.	314-BP-010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)	abcam	ab142216
CAD drawing software,	Robert McNeel and Associates, WA, USA	Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20	Sartorius	VS2042
CHIR99021	Cayman	13122
Chromium etchant	Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan	N14B
Chromium mask coated with AZP1350	Clean Surface Technology Co., Japan	CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))	Takara	9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	D5796
Ethanol (99.5)	Fujifilm wako	057-00456
Fetal Bovine Serum	Moregate	59301104
FGF-10, Human, Recombinant,	R&D Systems, Inc.	345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant	Fujifilm wako	060-04543
Gelatin from porcine skin powder	Sigma-Aldrich	G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)	Sigma-Aldrich	G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates	MatTek	P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12	Thermo Fisher Scientific	11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)	Thermo Fisher Scientific	35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	Fujifilm wako	196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)	Nippi	892012
Mask aligner	Union Optical Co., Ltd., Japan	PEM-800
Maskless lithography tool	NanoSystem Solutions, Inc., Japan	D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)	Merck Millipore	SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)	N.A.		Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
PD0325901	Stemgent	04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Petri dish	Sansei medical co. Ltd	01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)	Nippon Gene	311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer	Dow Corning Corp., MI, USA	SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)	Polyscience	24765-1
Positive photoresist developer	Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan	NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
Proteinase K	Takara	9034
Puromycin Dihydrochloride	Fujifilm wako	166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein	R&D Systems, Inc.	338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)	Thermo Fisher Scientific	12604-039
RPMI1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875-119
Silicon wafer	Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan	N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
Spin-coater	Mikasa Co., Ltd., Japan	MS-A100
Spininng confocal microscopy	Oxford Instruments	Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)	Fujifilm wako	195-16053
SU-8 3010	Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA	SU-8 3010
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA	SU-8 developer
Tris-EDTA	Nippon Gene	314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant	Fujifilm wako	226-01781