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Resumo

Este método pode ser usado para examinar o encurtamento do sarcomere usando cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco com proteínas de sarcomere marcadas por fluorescentes.

Resumo

Cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes (PSC-CMs) podem ser produzidos a partir de células pluripotentes embrionárias e induzidas (ES/iPS). Essas células fornecem fontes promissoras para a modelagem de doenças cardíacas. Para cardiomiopatias, o encurtamento de sarcomere é uma das avaliações fisiológicas padrão que são usadas com cardiomiócitos adultos para examinar seus fenótipos da doença. No entanto, os métodos disponíveis não são apropriados para avaliar a contratude dos PSC-CMs, uma vez que essas células têm sarcomeres subdesenvolvidos que são invisíveis sob microscopia de contraste de fase. Para abordar essa questão e realizar o encurtamento de sarcomere com PSC-CMs, foram utilizadas proteínas de sarcomere com marca fluorescente e imagens vivas fluorescentes. Linhas Z finas e uma linha M residem em ambas as extremidades e no centro de um sarcomere, respectivamente. As proteínas de linha Z — α-Actinin (ACTN2), Teletonina (TCAP) e proteína LIM associada à actina (PDLIM3) — e uma proteína de linha M — Myomesin-2 (Myom2) — foram marcadas com proteínas fluorescentes. Essas proteínas marcadas podem ser expressas a partir de alelos endógenos como knock-ins ou de vírus associados ao Adeno (AAVs). Aqui, introduzimos os métodos para diferenciar células-tronco pluripotentes de camundongos e humanos aos cardiomiócitos, produzir AAVs e realizar e analisar imagens ao vivo. Descrevemos também os métodos de produção de selos de polidimtilsiloxano (PDMS) para uma cultura padronizada de PSC-CMs, o que facilita a análise do encurtamento de sarcomere com proteínas fluorescentes marcadas. Para avaliar o encurtamento do sarcomere, as imagens de lapso de tempo das células batidas foram registradas em uma taxa de quadros alta (50-100 quadros por segundo) sob estimulação elétrica (0,5-1 Hz). Para analisar o comprimento do sarcomere ao longo da contração celular, as imagens gravadas de lapso de tempo foram submetidas ao SarcOptiM, um plug-in para ImageJ/Fiji. Nossa estratégia fornece uma plataforma simples para investigar fenótipos de doenças cardíacas em PSC-CMs.

Introdução

As doenças cardiovasculares são a principal causa de mortalidade em todo o mundo1 e a cardiomiopatia representa a terceira causa de mortes cardíacas2. Cardiomiopatia é um grupo coletivo de doenças que afetam os músculos cardíacos. Os recentes desenvolvimentos de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) e a diferenciação direcionada das células iPS em direção aos cardiomiócitos (PSC-CMs) abriram a porta para o estudo de cardiomiócitos com genoma do paciente como modelo in vitro de cardiomiopatia. Essas células podem ser utilizadas para entender a fisiopatologia de doenças cardíacas, para elucidar seus mecanismos moleculares e testar diferentes candidatos terapêuticos3. Há uma enorme quantidade de interesse, assim, células iPS derivadas do paciente têm sido geradas (por exemplo, cardiomiopatia hipertrófica [HCM]4,5, cardiomiopatia ventricular direita arrhythmogênica [ARVC]6, cardiomiopatia dilatada [DCM]7, e cardiomiopatias relacionadas à mitocondrial8,9). Como uma das características da cardiomiopatia é a disfunção e a interrupção dos sarcomeres, é necessária uma ferramenta válida que mede uniformemente a função sarcomere.

O encurtamento de Sarcomere é a técnica mais utilizada para avaliar a função de sarcomere e a contratilidade de cardiomiócitos adultos derivados de modelos animais e humanos. Para realizar o encurtamento de sarcomere, são necessários sarcomeres bem desenvolvidos que sejam visíveis sob contraste de fase. No entanto, os PSC-CMs cultivados in vitro exibem sarcomeres subdesenvolvidos e desorganizados e, portanto, não podem ser usados para medir adequadamente o encurtamento de sarcomere10. Essa dificuldade de avaliar adequadamente a contrateriedade dos PSC-CMs dificulta seu uso como plataforma para avaliar funções cardíacas in vitro. Para avaliar a contratilidade do PSC-CMs indiretamente, microscopia de força atômica, micro-matrizes pós-postes, microscopia de força de tração e medidas de impedância têm sido utilizadas para medir os efeitos do movimento exercido por essas células em seus arredores11,12,13. Gravações de vídeo-microscopia mais sofisticadas e menos invasivas do movimento celular real (por exemplo, SI8000 da SONY) podem ser usadas para avaliar alternativamente sua contratilidade, no entanto, este método não mede diretamente o movimento sarcomere ou força a geração cinética14.

Para medir diretamente o movimento do sarcomere em PSC-CMs, novas abordagens, como a marcação fluorescente à proteína sarcomere, estão surgindo. Por exemplo, lifeact é usado para rotular fisomotos actin (F-actin) para medir o movimento sarcomere15,16. Células iPS geneticamente modificadas são outra opção para a marcação de proteínas sarcomere (por exemplo, α-actinin [ACTN2] e Myomesin-2 [MYOM2]) por proteína fluorescente17,18,19.

Neste artigo, descrevemos como realizar imagens de lapso de tempo para medir o encurtamento de sarcomere usando myom2-TagRFP (células embrionárias de tronco de camundongo [ES] e ACTN2-mCherry (células iPS humanas). Também mostramos que uma cultura padronizada facilita o alinhamento do sarcomere. Além disso, descrevemos um método alternativo de rotulagem de sarcomere, usando vírus associados ao adeno (AAVs), que pode ser amplamente aplicado às células iPS derivadas do paciente.

Protocolo

1. Diferenciação de células-tronco pluripotentes do rato

  1. Manutenção de células ES do mouse
    1. Meio de manutenção: Misture 50 mL de soro bovino fetal (FBS), 5 mL de L-alanina-L-glutamina, 5 mL de aminoácido não essencial (NEAA), 5 mL de 100 mM Pyruato de Sódio e 909 μl de 55 mM 2-Mercaptoethanol com 450 mL de Meio Mínimo Essencial de Glasgow (GMEM). Fator inibidor de leucemia suplementar (LIF), CHIR-99021 e PD0325901 em uma concentração final de 1000 U/mL, 1 μM e 3 μM, respectivamente. Esterilize o meio através de um filtro de 0,22 μm.
    2. Meio FBS: Misture 55 mL de FBS, 5,5 mL de L-alanina-L-glutamina, 5,5 mL de Piruvato de Sódio e 5,5 mL de NEAA a 500 mL de alta glicose de Dulbecco(DMEM) alta glicose. Filtrar o meio através de um filtro de 0,22 μm para esterilizar.
    3. Cultura Células ES do mouse SMM18 em que TagRFP foi batido no lócus Myom2 em um prato gelatinizado de 6 cm em meio de manutenção como descrito anteriormente18. Passagem a cada 2-3 dias.
  2. Preparação do meio de diferenciação sem soro (SFD)
    1. Basal SFD: Misture 250 mL de F-12, 750 mL do Meio Modificado de Dulbecco (IMDM) da Iscove, 10 mL de suplemento B27 menos vitamina A, 5 mL de suplemento N2, 10 mL de L-alanina-L-glutamina, 5 mL de albumina de soro bovino de 10% em soro tamponado de fosfato (PBS), e 10 mL de penicilina e estreptomicina (10.000 U/mL). Filtrar através de 0,22 μm de coador para esterilizar.
    2. Dissolva o ácido ascórbico a 5 mg/mL em água destilada e filtre através de um filtro de 0,22 μm para esterilizar.
    3. Diluir 13 μL de 1-Thioglycerol a 1 mL de IMDM. Aqui, refira-se a este 1-Thioglycerol diluído como MTG.
    4. Adicione 10 μL de ácido ascórbico (5 mg/mL) e 3 μL de MTG a 1 mL de SFD basal no dia do uso. Aqui, consulte esta mistura como SFD completa.
  3. Dia 0, formação do corpo embrionário (EB) para diferenciação
    1. Colher células ES do mouse SMM18 com uma protease de trippsina recombinante (rTrypsin) e contar as células.
    2. Centrífuga 5 x 105 células a 300 x g por 3 min em 4 °C, resuspend em 10 mL de SFD completo, e semente em uma placa de Petri de 10 cm. Cultura as células a 37 °C e 5% DE CO2 para 50 h.
  4. Dia 2 de Diferenciação
    1. Adicione Activin A, fator de crescimento endotelial vascular humano (hVEGF) e proteína morfogenética óssea 4 (BMP4) para completar sfd em uma concentração final de 5 ng/mL, 5 ng/mL e 1,9 ng/mL, respectivamente.
      NOTA: As concentrações de BMP4 podem diferir dependendo do lote de BMP4. Teste várias concentrações em um teste de pequena escala antes de usar um novo lote e determine a melhor concentração para diferenciação cardíaca.
    2. Transfira EBs de uma placa de Petri em um tubo de 15 mL e centrífuga a 50-100 x g por 3 min a 4 °C.
    3. Enquanto isso, adicione o meio preparado na etapa 1.4.1 à placa de Petri para proteger que os EBs restantes estejam secos.
    4. Aspire o supernasal do tubo de 15 mL, resuspense os EBs com o meio na placa de Petri, e transfira a solução EB de volta para a placa. Em seguida, cultive os EBs a 37 °C e 5% de CO2 por 46 h.
  5. Dia 4 de diferenciação
    1. Gelatinize um prato tratado com cultura de tecido de 10 cm com 5 a 10 mL de gelatina de 0,1% por pelo menos 5 min. Gelatina aspirada antes de semear células.
    2. Prepare o meio: Misture o fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF), FGF10 e hVEGF para completar o SFD a 5 ng/mL, 25 ng/mL e 5 ng/mL concentrações finais, respectivamente. Para um prato de 10 cm, prepare 10 mL.
    3. Transfira células da placa de Petri para um tubo de 15 mL. Adicione 5 mL de PBS à placa de Petri, lave várias vezes e transfira para o tubo de 15 mL para coletar as células restantes. Centrifugar a 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspirar supernante, adicionar 1 mL de rTrypsin e incubar a 37 °C por 3 min.
    5. Vórtice brevemente para dissociar EBs, adicionar 9 mL de 10% de meio FBS, vórtice novamente, e contar as células.
    6. Centrífuga 1,5 x 107 células a 300 x g, 4 °C por 3 min, resuspend com a mídia preparada na etapa 1.4.2, e semente no prato gelatinizado. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 por 2 dias.
      NOTA: No dia 7 ou 8, pode-se observar uma extensa batida de PSC-CMs.
  6. Seleção de medicamentos nos dias 7 e 9 de diferenciação: Realimentar a mídia com puromicina (2 μg/mL na concentração final) para eliminar os não cardiomiócitos nos dias 7 e 9 de diferenciação.
    NOTA: A linha parental de SMM18 é células ES de mouse syNP4, abrigando o gene resistente à puramicinaNCX1 20.
  7. Dia 10, repllate para experimentos futuros
    1. Cubra uma placa de cultura de fundo de vidro ou um prato de imagem de 35 mm contendo uma tampa de polímero com 0,1% de gelatina. Para melhorar a maturação, cubra os pratos com fragmento laminin-511 E8 (LN511-E8) a 1 μg/cm2 por 30-60 min à temperatura ambiente18. Para cultivar PSC-CMs em padrões específicos de interesse, consulte as etapas 4 e 5 para preparar selos de polidimetilsiloxano (PDMS).
    2. Para colher SMM18 PSC-CMs, lave o prato duas vezes com PBS, aplique 1 mL de rTrypsin e incubar 3 min a 37 °C.
    3. Coletar células em 9 mL de 10% de meio FBS, suspender e contar as células. Plaque as células em 50.000-100.000 células em um poço de uma placa de 24 poços ou 250.000-500.000 células em uma placa de imagem de 35 mm.
    4. Centrifugar um número suficiente de células (300 x g, 3 min) e resuspengar as células com SFD completo complementado com FBS (concentração final em 10%).
    5. Incubar durante a noite e alterar o meio de cultura para completar o SFD com puramicina.
    6. A partir do dia 14, mude o meio de cultura de duas a três vezes por semana com SFD completo até o dia 21-28, quando Myom2-RFP se torna proeminente. Para transdução baseada em AAV de proteínas de sarcomere com marca fluorescente, consulte o Passo 3.

2. Diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas

  1. Preparação de mídia de diferenciação
    1. RPMI+B27-Ins: misture 500 mL de RPMI 1640 médio, 10 mL de B27 menos insulina, e 5,25 mL de L-alanina-L-glutamina.
    2. RPMI+B27+Ins: misture 500 mL de RPMI, 10 mL de suplemento B27 e 5,25 mL de L-alanina-L-glutamina.
  2. Manutenção de células iPS humanas
    1. Passagem células iPS humanas duas vezes por semana com AK02N no LN511-E8 seguindo método publicado anteriormente com algumas modificações21.
    2. Colher células com um tratamento de 3 min de rTrypsin e coletar em 10% de fbs médio. Conte células e centrífuga a 300 x g por 3 min a 4 °C. Semente 75.000-125.000 células em um poço de 6 placas de bem com 2 mL de AK02N complementadas com LN511-E8 e Y27632 na concentração final de 0,5 μg/mL (0,1 μg/cm2) e 10 μM, respectivamente.
    3. Incubar a 37 °C e 5% de CO2 e substituir o meio no dia seguinte por 2 mL de AK02N sem qualquer suplemento. Mude a mídia a cada dois ou três dias e passagem a cada três ou quatro dias.
  3. Dia -4: replate antes da diferenciação
    1. Cubra uma placa de 6 poços com 0,5 μg/cm2 de LN511-E8 diluída em PBS. Em seguida, incubar por pelo menos 30 min a 37 °C e 5% de CO2 ou 1h à temperatura ambiente. Solução de revestimento aspirado logo antes de semear células.
    2. Colher células iPS humanas com rTrypsin e contar células como no Passo 2.2.2.
    3. Centrífuga 1,25 x 105 células para um poço de placa de 6 poços a 300 x g por 3 min a 4 °C e resuspend em 2 mL de AK02N complementado com LN511-E8 (concentração final 0,5 μg/mL ou 0,1 μg/cm2) e Y27632 (concentração final 10 μM) por poço.
    4. Solução de revestimento aspirada, células resuspended semente na placa revestida, e incubar a 37 °C e 5% DE CO2.
  4. Dias -3 e -1: substitua o meio por 2 mL de AK02N.
  5. Dia 0: Substitua o meio por 2 mL de RPMI+B27-Ins complementado com CHIR99021 (concentração final 6 μM) por poço para iniciar a diferenciação.
  6. Dia 2: Substitua o meio por 2 mL de RPMI+B27-Ins por WntC59 (concentração final 2 μM) por poço.
  7. Dia 4: Substitua o meio por 2 mL de RPMI+B27-Ins por poço.
  8. Dia 7 e dia 9: substitua o médio por 2 mL de RPMI+B27+Ins por puromicina (concentração final 10 μg/mL) por poço para cultura seletiva PSC-CMs.
    NOTA: A linha ACTN2-mCherry, usada neste estudo, possui um de local interno de entrada ribossômica (IRES), gene resistente à puramicina inserido na região 3′-não traduzida (UTR) do lócus TNNT2, e mCherry substituindo o stop codon do ACTN2. Para purificar o cardiomiócito sem knock-in, consulte os passos 3 e 4.
  9. Dia 10: repllate para experimentos futuros
    1. Cubra um prato de imagem de 35 mm com uma tampa de polímero com 0,5-1 μg/cm2 de LN511-E8 diluído em 0,1% de gelatina. Incubar 2-4 h à temperatura ambiente para viabilidade a longo prazo. Para cultivar PSC-CMs nos padrões desejados, consulte as etapas 4 e 5 para preparar selos PDMS.
    2. Para colher PSC-CMs humanos, lave o prato duas vezes com PBS, aplique 1 mL de rTrypsin por poço e incubar 3 min a 37 °C.
    3. Coletar células em 4 mL de 10% de meio FBS, suspender e contar as células. Placa 250.000-500.000 células por 35 mm de imagem.
    4. Centrifugar um número suficiente de células a 300 x g para 3 min a 4 °C, resuspend com RPMI+B27+Ins com puromicina (10 μg/mL), e placa na placa revestida de imagem de 35 mm.
    5. Incubar durante a noite. Na manhã seguinte, substitua o meio de cultura por RPMI+B27+Ins por puromicina (10 μg/mL).
    6. A partir do dia 14, mude o meio de cultura 2-3 vezes por semana com RPMI+B27+Ins até o dia 21-28 para imagem. Para transdução baseada em AAV de proteínas de sarcomere com marca fluorescente, consulte o Passo 3.

3. Rotulagem fluorescente de sarcomeres usando vírus associados ao adeno

  1. Preparação antes da produção de AAV
    1. Manter células HEK293T em DMEM suplementadas com FBS (concentração final de 10%) em uma placa de cultura tecidual de 10 cm. Células de passagem três vezes por semana.
    2. Prepare a polietilenimina (PEI) a 1 mg/mL. Misture 50 mg de polietilenimina MAX 40000 e 40 mL de água ultrapura. Ajuste o pH para 7.0 usando 1 N NaOH. Em seguida, faça o volume final para 50 mL com água ultrauso e filtre através de um filtro de 0,22 μm.
    3. Prepare um vetor de transporte com um gene de rotulagem de sarcomere (por exemplo, TCAP ou PDLIM3 fundido com uma proteína fluorescente verde [GFP]), impulsionado por um promotor específico de cardiomiócito, como a troponina cardíaca T (cTNT)22.
      NOTA: Neste caso, utilizamos GFP monomérica aprimorada com mutações de V163A, S202T, L221V23.
  2. Dia 0, passagem de células HEK
    1. Quando as células atingem a confluência, a passagem 2.0 x 107 células HEK293T para uma placa de cultura tecidual de 15 cm com 20 mL de DMEM com 10% de FBS.
  3. Dia 1, transfecção
    1. Misture 13,5 μg do vetor de transporte, 26 μg de pHelper (uma codificação vetorial E2A, E4 e VA de adenovírus), 16,5 μg de pRC6 (um vetor codificando genes AAV2 Rep e AAV6 Cap) e 1 mL de DMEM sem pirutil de sódio (DMEM-Pyr).
    2. Misture 224 μL de PEI (1 mg/mL, preparado na etapa 3.1.2) e 776 μL de DMEM-Pyr.
    3. Misture e incuba a solução plasmid e a solução PEI à temperatura ambiente por 30 minutos.
    4. Adicione a solução plasmid/PEI às células HEK293T preparadas na etapa 3.2.
  4. Dia 2, mudança média
    1. Às 24 horas após a transfecção, mude de médio para DMEM-Pyr. Células de cultura até a colheita de AAV no dia 7. AAV será lançado na mídia cultural.
  5. Dia 7, coleta de AAV, concentração e substituição de buffer usando o método mínimo de purificação24
    1. Incubar uma unidade de ultrafiltração centrífugo (corte de peso molecular de 100k [MWCO]) com 5 mL de 1% de BSA em PBS à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, centrifufique a unidade de ultrafiltração a 500 x g por 2 min e aspire tanto as soluções filtradas quanto as demais.
    2. Transfira o meio do prato de 15 cm que produziu AAV para um novo tubo cônico de 50mL e centrífuga (500 x g, 5 min). Filtre o supernatante através de um coador de seringa de 0,45 μm para remover detritos celulares e aplicar suspensão à unidade de ultrafiltração.
    3. Centrifugar a 2000 x g por 90 min ou até concentrar a cultura supernaspesa de 0,5 a 1 mL.
    4. Aspire o filtrado e aplique 15 mL de PBS na unidade de ultrafiltração.
    5. Repita a centrifugação até que o concentrado se torne 0,5-1 mL.
    6. Repita 3.5.4 e 3.5.5.
    7. Transfira a AAV concentrada para um novo tubo de 1,5 mL e armazene a 4 °C ou -20 °C.
      NOTA: O AAV pode ser usado em instalações P1, mas seguir as regras e regulamentos locais. O AAV também pode ser produzido por métodos convencionais.
  6. Cálculo do título AAV
    1. Misture 5 μL de AAV, 195 μL de DMEM-Pyr e 10 U de benzonase e incubar a 37 °C por 1 h.
    2. Adicione 200 μL de tampão proteinase K (0,02 M Tris HCl e 1% SDS) e 5 μL de proteinase K (20 mg/mL) e incubar a 37 °C por 1 h.
    3. Prepare cuidadosamente 400 μL de uma solução de álcool fenol/clorofórmio/isoamyl cuidadosamente, vórtice por 1 min e centrífuga a 20.000 x g por 1 min.
    4. Transfira 200 μL da fase aquosa para um novo tubo de 1,5 mL, que produzirá aproximadamente metade dos genomas AAV originais.
    5. Adicione 1 μL de Glicogênio (20 mg/mL) a 20 μL de 3 M CH3COONa (pH 5.2) e vórtice. Adicione 250 μL de 2-Propanol a 100 μL de 100% de etanol e vórtice novamente.
    6. Incubar a -80 °C por 15 min. Em seguida, centrífuga a 20.000 x g para 30 min a 4 °C.
    7. Aspirar supernante e adicionar 70% de etanol ao tubo. Em seguida, centrífuga a 20.000 x g, 4 °C por 5 min.
    8. Aspirar supernasce e secar o ar até que a pelota fique clara.
    9. Adicione 200 μL de ácido tris-etilenodiaminetetraacético (TE; pH 8.0) para resolver os genomas AAV. Em seguida, diluir a amostra 100 vezes com TE.
    10. Prepare um padrão com pAAV-CMV-Vector a 6,5 ng/μL com TE para obter 109 genomas vetoriais (vg)/ μL. Em seguida, faça uma série de diluição de 10 vezes de 104 a 108 com TE.
    11. Misture 1 μL de DNA amostral (ou os padrões), 0,4 μL de primers (5 μM), 3,6 μL de água destilada e 5 μL de mistura mestre SYBR Green. Os primers, localizados no ITR, são 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ e 5'-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Executar PCR em tempo real com a seguinte condição: Denaturação inicial a 95 °C para 60 s, 40 ciclos de desnaturação a 95 °C para 15 s, e renas e extensão a 60 °C para 30 s, seguida de curva de fusão.
    13. Com base nos padrões e nos valores de TC, uma máquina PCR em tempo real fornece o número de cópia do genoma vetorial em 1 μL de uma amostra. Calcule o título original AAV usando a seguinte equação: um número de cópia fornecido por PCR em tempo real (vg/μL) x 8 x 103 x 2, em que 8 x 103 como fator de diluição durante o isolamento do genoma AAV, e 2 como fator de diferença de AAV (único fio) e plasmídeo (fio duplo).
  7. Transdução para PSC-CMs
    1. Conte PSC-CMs em um prato extra ou extra.
    2. AAVs diluídos (1 x 104 a 1 x 106 vg/célula) para compor 50 μL com PBS. Aplique AAVs na multiplicidade de infecção (MOI) de 1 x 104 a 1 x 106 vg/célula para PSC-CMs e cultura PSC-CMs por 3 dias com AAV nos meios de diferenciação correspondentes para PSC-CMs de mouse e humano, em seguida, mudar a mídia para o meio cultura sem AAV.
    3. Use PSC-CMs para imagens de células vivas após 7 dias ou mais após a transdução.

4. [Opcional] Purificação baseada em AAV de PSC-CMs

  1. Preparação da AAV
    1. Prepare o AAV como descrito no Passo 3 usando um vetor de transporte expressando gene resistente a blasticidina sob o controle do promotor cTNT.
  2. Transdução para diferenciar células iPS
    1. Diferencie as células iPS humanas por 4 dias após o protocolo descrito na Etapa 2 e conte o número de células em um poço extra.
    2. Depois de mudar o meio no dia 4, aplique AAVs no MOI de 1 x 105 vg/cell para diferenciar PSCs na mídia RPMI+B27-Ins.
    3. No dia 7, atualize o meio com RPMI+B27+Ins e adicione 2,5-10 μg/mL de blasticidina.
    4. No dia 10, os PSC-CMs estão prontos para se repelirem.

5. Preparação de selos PDMS

  1. Projete o padrão do dispositivo de tiras de 200 μm, juntamente com ranhuras de 10-25 μm entre as tiras usando um software de desenho CAD (Computer-Aided Design, design auxiliado por computador).
  2. Desenhe o padrão dos dispositivos em uma fotomasmak de cromo revestida com AZP1350 usando luz UV de uma ferramenta de litografia sem máscara.
  3. Desenvolva o padrão na máscara fotográfica em uma série de desenvolvedores fotoresist positivos (por exemplo, etchant de cromo) e enxágue com água DI.
  4. Desidratar uma bolacha de silício em uma placa quente a 120 °C por 15 min.
  5. Deixe o wafer esfriar até a temperatura ambiente e gire um fotoresist negativo SU-8 3010 para fazer uma altura de 10-20 μm com 1500 rpm por 30 s usando um spin-coater.
  6. Leve asse o wafer em dois passos em uma placa quente de acordo com o protocolo do fabricante.
  7. Depois que o wafer esfriar à temperatura ambiente, carregue o wafer no alinhador da máscara.
  8. Use um alinhador de máscara para alinhar a máscara no wafer e expor o wafer à luz UV.
  9. Conduza o assado pós-exposição ao wafer em duas etapas em uma placa quente de acordo com o protocolo do fabricante.
  10. Desenvolva o wafer em uma série de desenvolvedores SU-8 e 2-Propanol, em seguida, seque o wafer com um fluxo de nitrogênio.
  11. Transfira o wafer para uma placa de Petri de tamanho adequado.
  12. Misture o elastomer PDMS e seu agente de cura em uma proporção de 10:1 w/w e despeje a mistura na placa de Petri.
  13. Desgas o PDMS em um desiccator até que todas as bolhas de ar desapareçam, em seguida, cure PDMS em placa quente a 80 °C por 2 h.
  14. Retire o PDMS curado do molde mestre usando uma pinça e, em seguida, corte a porção com o design para ser um selo PDMS.
    NOTA: A forma pode ser quadrada, no entanto, uma forma octogonal transfere melhor o padrão na borda.

6. Cultura padronizada de cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco

  1. Remova o pó da superfície dos selos PDMS usando fita de remendamento.
  2. Submergir os selos em 70% de etanol para esterilizar. Em seguida, tire o etanol da superfície dos selos usando um espanador de ar.
  3. Aplique 5-10 μL de 0,5 wt% 2-methacryloyloxyethyl polímero/etanol na superfície dos selos PDMS.
    NOTA: A distribuição desigual do polímero MPC pode causar um padrão interrompido.
  4. Incubar 10-30 min até que o polímero MPC esteja completamente seco.
  5. Coloque os selos em contato com tampas de uma placa de cultura de fundo de vidro ou um prato de imagem de 35 mm com um deslizamento de cobertura de polímero e coloque um peso (por exemplo, uma bateria AAA) no selo por 10 minutos.
  6. Remova o peso e os selos. Então, confirme que o padrão foi transferido sob microscópio.
    NOTA: Placas/pratos estampados podem ser armazenados até 1 semana em temperatura ambiente.
  7. Lave os poços/pratos estampados com PBS duas vezes.
  8. Diluir LN511-E8 com PBS a 2-4 μg/mL e revestir o prato com LN511-E8 a 0,5-1 μg/cm2. Para PSC-CMs humanos, diluir LN511-E8 com solução de gelatina de 0,1% em vez de PBS. Em seguida, incubar por pelo menos 1h (o ideal, mais de 4h).
  9. Células de placas descritas em seções anteriores.

7. Imagem de lapso de tempo de sarcomeres sob microscópio fluorescente

  1. Ligue e conecte o microscópio, o computador associado e também todos os periféricos necessários.
  2. Para realizar imagens de lapso de tempo, capture imagens de lapso de tempo com a maior ampliação (lente objetiva 100X com emersão de óleo).
  3. Selecione condições de imagem ao vivo. Para obter bons dados representativos, tente ajustar-se à maior taxa de quadros (mínimo de 20 ms ou 50 quadros por segundo é recomendado). Defina o obturador aberto e aplique um binning necessário (4 X 4) e uma cultura da área de aquisição para obter os intervalos mais curtos entre as imagens durante a imagem de lapso de tempo.
    NOTA: A configuração pode variar dependendo das configurações dos microscópios. A câmera precisa ser de alta sensibilidade e é capaz de transferir os dados para o PC conectado rápido o suficiente. Para isso, usamos flash ORCA com link de câmera. Testamos uma microscopia confocal giratória e adquirimos imagens a 400 quadros por segundo.
    1. [Opcional] Se a taxa de espancamento das células for baixa, evoque as células por estimulação de campo elétrico.
  4. Execute o registro de lapso de tempo
    1. Certifique-se de que os campos de imagem permaneçam em foco durante a gravação da imagem de lapso de tempo.
    2. Salve as imagens de lapso de tempo em uma pasta apropriada.

8. Análise de imagens de lapso de tempo usando SarcOptiM, um plugin ImageJ/Fiji

  1. Carregue uma série de imagens de lapso de tempo no ImageJ. Para o formato Olympus VSI, abra arquivos através do Plugin OlympusViewer.
  2. Ajuste o brilho e o contraste da imagem para observar claramente o padrão sarcomere(Imagem | Ajuste | Brilho/Contraste).
  3. Abra o SarcOptiM clicando no menu Mais ferramentas (>>) e selecionando SarcOptiM.
  4. Calibrar o programa pressionando ctrl + shift + P e 1 μm na barra de ferramentas e seguindo as instruções das caixas de diálogo.
  5. Desenhe uma linha através da região do sarcomere que será usada para medir o encurtamento sarcomere.
  6. Inicie a análise de encurtamento do sarcomere pressionando o SingleCell (AVI) na barra de ferramentas. Os dados representativos são mostrados na Figura 1 e Figura 2.

Resultados

Medindo o encurtamento do sarcomere usando linhas de repórteres do PSC-CMs. Psc-CMs rotulados por Sarcomere foram usados para medir o encurtamento de sarcomere. As linhas expressam Myom2-RFP e ACTN2-mCherry de loci endógeno. TagRFP foi inserido no Myom2, codificando proteínas M que se localizam na linha M, enquanto mCherry foi derrubado no ACTN2, codificando α-Actinin, que se localiza para a linha Z18,

Discussão

Os PSC-CMs têm grande potencial para serem utilizados como uma plataforma in vitro para modelar doenças cardíacas e testar os efeitos das drogas. No entanto, um método preciso e unificado para avaliar as funções do PSC-CMs deve ser primeiro estabelecido. A maioria dos testes funcionais funciona com PSC-CMs, por exemplo, eletrofisiologia, transitório de cálcio e metabolismo26, e um dos primeiros estudos de PSC-CM derivados do paciente foi sobre a síndrome de QT longo

Divulgações

A H.U. registrou uma patente relacionada a este manuscrito.

Agradecimentos

Gostaríamos de reconhecer todos os membros do laboratório da Divisão de Medicina Regenerativa da Universidade Médica de Jichi pela discussão e assistência técnica úteis. Este estudo foi apoiado pelas bolsas da Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED; JP18bm0704012 e JP20bm0804018), a Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS; JP19KK0219), e a Sociedade de Circulação Japonesa (a Bolsa para Pesquisa Básica) para a H.U.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.A.We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonase (25 U/µL)Merck Millipore70746
Blasticidin S HydrochlorideFujifilm wako029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.314-BP-010
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
CAD drawing software,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Chromium etchantNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JapanN14B
Chromium mask coated with AZP1350Clean Surface Technology Co., JapanCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))Takara9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvateSigma-AldrichD5796
Ethanol (99.5)Fujifilm wako057-00456
Fetal Bovine SerumMoregate59301104
FGF-10, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinantFujifilm wako060-04543
Gelatin from porcine skin powderSigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
GLASS BOTTOM culture platesMatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium SaltFujifilm wako196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Mask alignerUnion Optical Co., Ltd., JapanPEM-800
Maskless lithography toolNanoSystem Solutions, Inc., JapanD-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.A.Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Petri dishSansei medical co. Ltd01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomerDow Corning Corp., MI, USASILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)Polyscience24765-1
Positive photoresist developerTokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., JapanNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Proteinase KTakara9034
Puromycin DihydrochlorideFujifilm wako166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A ProteinR&D Systems, Inc.338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)Thermo Fisher Scientific12604-039
RPMI1640 MediumThermo Fisher Scientific11875-119
Silicon waferMatsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., JapanN.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher Scientific11360-070
Spin-coaterMikasa Co., Ltd., JapanMS-A100
Spininng confocal microscopyOxford InstrumentsAndor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)Fujifilm wako195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8 developerKayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 developer
Tris-EDTANippon Gene314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinantFujifilm wako226-01781

Referências

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