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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo metodo può essere utilizzato per esaminare l'accorciamento del sarcomero utilizzando cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali con proteine sarcomere con tag fluorescente.

Abstract

I cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali (PSC-CMs) possono essere prodotti sia da cellule staminali pluripotenti embrionali che indotte (ES/iPS). Queste cellule forniscono fonti promettenti per la modellazione delle malattie cardiache. Per le cardiomiopatie, l'accorciamento del sarcomero è una delle valutazioni fisiologiche standard che vengono utilizzate con cardiomiociti adulti per esaminare i loro fenotipi di malattia. Tuttavia, i metodi disponibili non sono appropriati per valutare la contrattilità dei PSC-CRM, in quanto queste cellule hanno sarcomer sottosviluppati che sono invisibili sotto microscopia a contrasto di fase. Per risolvere questo problema e per eseguire l'accorciamento del sarcomero con PSC-CMs, sono state utilizzate proteine sarcomere con tag fluorescenti e imaging vivo fluorescente. Le linee Z sottili e una linea M risiedono rispettivamente ad entrambe le estremità e al centro di un sarcomero. Le proteine della linea Z - α-actinin (ACTN2), telethonin (TCAP), e proteina LIM associata all'actina (PDLIM3) - e una proteina M-line - Miomesin-2 (Myom2) - sono state taggate con proteine fluorescenti. Queste proteine taggate possono essere espresse da alleli endogeni come knock-in o da virus adeno-associati (AAV). Qui introduciamo i metodi per differenziare le cellule staminali pluripotenti del topo e dell'uomo dai cardiomiociti, per produrre AAV e per eseguire e analizzare l'imaging dal vivo. Descriviamo anche i metodi per la produzione di francobolli in polidimetilsiloxano (PDMS) per una coltura modellata di PSC-CRM, che facilita l'analisi dell'accorciamento del sarcomero con proteine con tag fluorescenti. Per valutare l'accorciamento del sarcomero, le immagini time-lapse delle cellule che battono sono state registrate a un framerate elevato (50-100 fotogrammi al secondo) sotto stimolazione elettrica (0,5-1 Hz). Per analizzare la lunghezza del sarcomero nel corso della contrazione cellulare, le immagini time-lapse registrate sono state sottoposte a SarcOptiM, un plug-in per ImageJ /Fiji. La nostra strategia fornisce una semplice piattaforma per indagare i fenotipi di malattie cardiache nei PSC-CRM.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di mortalità intutto il mondo 1 e la cardiomiopatia rappresenta la terza causa di decessi cardiaci2. La cardiomiopatia è un gruppo collettivo di malattie che colpiscono i muscoli cardiaci. I recenti sviluppi delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) e la differenziazione diretta delle cellule iPS verso i cardiomiociti (PSC-CMs) hanno aperto la porta allo studio dei cardiomiociti con il genoma del paziente come modello in vitro di cardiomiopatia. Queste cellule possono essere utilizzate per comprendere la fisiopatologia delle malattie cardiache, per chiarire i loro meccanismi molecolari e per testare diversi candidati terapeutici3. C'è un enorme interesse, quindi sono state generate cellule iPS derivate dal paziente (ad esempio, cardiomiopatia ipertrofica [HCM]4,5, cardiomiopatia ventricolare destra aritmogena [ARVC]6, cardiomiopatia dilatata [DCM]7e cardiomiopatie mitocondrialicorrelate 8,9). Poiché una delle caratteristiche della cardiomiopatia è la disfunzione e l'interruzione dei sarcomeri, è necessario uno strumento valido che misura uniformemente la funzione sarcomere.

L'accorciamento del sarcomero è la tecnica più utilizzata per valutare la funzione del sarcomero e la contrattilità dei cardiomiociti adulti derivati da modelli animali e umani. Per eseguire l'accorciamento del sarcomero, sono necessari sarcomer ben sviluppati visibili sotto il contrasto di fase. Tuttavia, i PSC-PM coltivati in vitro mostrano sarcomeres sottosviluppati e disorganizzati e, pertanto, non possono essere utilizzati per misurare correttamente l'accorciamento del sarcomero10. Questa difficoltà di valutare correttamente la contrattilità dei PSC-CRM ne ostacola l'utilizzo come piattaforma per valutare le funzioni cardiache in vitro. Per valutare indirettamente la contrattilità PSC-CMs, sono state utilizzate microscopie a forza atomica, array di micro-post, microscopia a forza di trazione e misurazioni dell'impedenza per misurare gli effetti del movimento esercitato da queste cellulesull'ambiente circostante 11,12,13. Registrazioni video-microscopie più sofisticate e meno invasive del moto cellulare effettivo (ad esempio, SI8000 di SONY) possono essere utilizzate per valutare in alternativa la loro contrattilità, tuttavia, questo metodo non misura direttamente il movimento del sarcomero o la cinetica di generazione di forza14.

Per misurare direttamente il movimento del sarcomero nei PSC-CRM, stanno emergendo nuovi approcci, come il tagging fluorescente alle proteine sarcomere. Ad esempio, Lifeact viene utilizzato per etichettare l'actina filamentosa (F-actin) per misurare il movimento del sarcomero15,16. Le cellule iPS geneticamente modificate sono un'altra opzione per etichettare le proteine del sarcomero (ad esempio, α-actina [ACTN2] e Miomesina-2 [MYOM2]) dalla proteina fluorescente17,18,19.

In questo documento, descriviamo come eseguire l'imaging time-lapse per misurare l'accorciamento del sarcomero utilizzando Myom2-TagRFP (cellule staminali embrionali di topo [ES]) e ACTN2-mCherry (cellule iPS umane). Mostriamo anche che una cultura modellata facilita l'allineamento dei sarcomei. Inoltre, descriviamo un metodo alternativo di etichettatura dei sarcomei, utilizzando virus associati ad adeno (AAV), che possono essere ampiamente applicati alle cellule iPS derivate dal paziente.

Protocollo

1. Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti del topo

  1. Manutenzione delle celle ES del mouse
    1. Mezzo di manutenzione: Mescolare 50 mL di siero bovino fetale (FBS), 5 mL di L-alanina-L-glutammina, 5 mL di amminoacido non essenziale (NEAA), 5 mL di 100 mM di piruvato di sodio e 909 μl di 55 mM 2-mercaptoetanolo con 450 mL di Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM). Integrare il fattore inibitorio della leucemia (LIF), CHIR-99021 e PD0325901 ad una concentrazione finale di 1000 U/mL, 1 μM e 3 μM, rispettivamente. Sterilizzare il mezzo attraverso un filtro da 0,22 μm.
    2. Mezzo FBS: Mescolare 55 mL di FBS, 5,5 mL di L-alanina-L-glutammina, 5,5 mL di Piruvato di sodio e 5,5 mL di NEAA a 500 mL di glucosio alto Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco. Filtrate il mezzo attraverso un filtro da 0,22 μm per sterilizzare.
    3. Coltura SMM18 cellule ES del mouse in cui TagRFP è stato bussato nel locus Myom2 su un piatto gelatinizzato da 6 cm in mezzo di manutenzione come descritto inprecedenza 18. Passaggio ogni 2-3 giorni.
  2. Preparazione del mezzo di differenziazione senza siero (SFD)
    1. SFD basale: Mescolare 250 mL di F-12 di Prosciutto, 750 mL del mezzo di dulbecco modificato (IMDM) di Iscove, 10 mL di integratore B27 meno vitamina A, 5 mL di supplemento N2, 10 mL di L-alanina-L-glutammina, 5 mL di albumina sierice bovina al 10% in salina tamponata da fosfati (PBS) e 10 mL di penicillina e streptomicina (10.000 U/mL). Filtrare attraverso il colino da 0,22 μm per sterilizzare.
    2. Sciogliere l'acido ascorbico a 5 mg/mL in acqua distillata e filtrare attraverso il colino da 0,22 μm per sterilizzare.
    3. Diluire 13 μL di 1-tioglicerolo a 1 mL di IMDM. Qui, si riferiscono a questo diluito 1-Tioglicerolo come MTG.
    4. Aggiungere 10 μL di acido ascorbico (5 mg/mL) e 3 μL di MTG a 1 mL di SFD basale il giorno dell'uso. Nel presente documento, fare riferimento a questa miscela come SFD completo.
  3. Giorno 0, formazione del corpo embrionale (EB) per la differenziazione
    1. Raccogliere le cellule ES del mouse SMM18 con una proteasi simile alla tripina ricombinante (rTrypsin) e contare le cellule.
    2. Centrifuga 5 x 105 celle a 300 x g per 3 minuti in 4 °C, risostipend in 10 mL di SFD completo e semina in una piastra di Petri da 10 cm. Coltura delle cellule a 37 °C e 5% CO2 per 50 h.
  4. Differenziazione giorno 2
    1. Aggiungere l'attivina A, il fattore di crescita endoteliale vascolare umano (hVEGF) e la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4) per completare sfd ad una concentrazione finale rispettivamente di 5 ng/mL, 5 ng/mL e 1,9 ng/mL.
      NOTA: le concentrazioni di BMP4 possono variare a seconda del lotto di BMP4. Testare diverse concentrazioni in uno studio su piccola scala prima di utilizzare un nuovo lotto e determinare la migliore concentrazione per la differenziazione cardiaca.
    2. Trasferire gli EB da una piastra di Petri in un tubo da 15 ml e centrifugare a 50-100 x g per 3 minuti a 4 °C.
    3. Nel frattempo, aggiungere il mezzo preparato al passaggio 1.4.1 alla piastra di Petri per proteggere gli EB rimanenti che si asciugano.
    4. Aspirare il supernatante dal tubo da 15 ml, risospendare gli EB con il mezzo nella piastra di Petri e trasferire la soluzione EB di nuovo nella piastra. Quindi, coltivare gli EB a 37 °C e 5% CO2 per 46 h.
  5. Giorno di differenziazione 4
    1. Gelatinizzare un piatto trattato con coltura tissutale da 10 cm con da 5 a 10 mL di gelatina allo 0,1% per almeno 5 minuti. Aspirare la gelatina proprio prima delle cellule di semina.
    2. Preparare il mezzo: Mescolare il fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF), FGF10 e hVEGF per completare sfd rispettivamente a 5 ng/mL, 25 ng/mL e 5 ng/mL concentrazioni finali. Per un piatto di 10 cm, preparare 10 mL.
    3. Trasferire le celle dalla piastra di Petri a un tubo da 15 ml. Aggiungere 5 ml di PBS alla piastra di Petri, lavare più volte e trasferire sul tubo da 15 ml per raccogliere le celle rimanenti. Centrifuga a 50-100 x g, 4 °C, 3 min.
    4. Aspirare il supernatante, aggiungere 1 mL di rTrypsin e incubare a 37 °C per 3 min.
    5. Vortice brevemente per dissociare gli EB, aggiungere 9 mL di mezzo FBS al 10%, vortice di nuovo e contare le cellule.
    6. Centrifuga 1,5 x 107 cellule a 300 x g, 4 °C per 3 minuti, risosopend con il supporto preparato al passaggio 1.4.2 e seme nel piatto gelatinizzato. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 2 giorni.
      NOTA: Entro il giorno 7 o 8, è possibile osservare un battito esteso di PSC-CRM.
  6. Selezione del farmaco ai giorni di differenziazione 7 e 9: Rialimentare il supporto con puromicina (2 μg / mL alla concentrazione finale) per eliminare i non-cardiomiociti al giorno 7 e 9 di differenziazione.
    NOTA: La linea parentale di SMM18 è cellule ES del mouse syNP4, che ospitano il gene resistente alla puromicina guidato dal promotore NCX120.
  7. Giorno 10, riprova per esperimenti futuri
    1. Rivestire una piastra di coltura con fondo di vetro o una piastra di imaging da 35 mm contenente una coverlip polimerica con gelatina 0,1%. Per migliorare la maturazione, rivestire i piatti con frammento laminin-511 E8 (LN511-E8) a 1 μg/cm2 per 30-60 min a temperatura ambiente18. Per coltura PSC-CMs in specifici modelli di interesse, fare riferimento ai passaggi 4 e 5 per la preparazione dei francobolli polidimetilossano (PDMS).
    2. Per raccogliere SMM18 PSC-MC, lavare il piatto due volte con PBS, applicare 1 mL di rTripsina e incubare 3 min a 37 °C.
    3. Raccogliere celle in 9 mL del mezzo FBS 10%, sospendere e contare le celle. Placcare le cellule a 50.000-100.000 cellule in un pozzo di una piastra da 24 po 'o 250.000-500.000 cellule in un piatto di imaging da 35 mm.
    4. Centrifugare un numero sufficiente di cellule (300 x g, 3 min) e rimorsi le cellule con SFD completo integrato con FBS (concentrazione finale al 10%).
    5. Incubare durante la notte e cambiare il mezzo di coltura per completare SFD con puromicina.
    6. Dal giorno 14, cambia il mezzo di coltura da due a tre volte a settimana con SFD completo fino al giorno 21-28, quando Myom2-RFP diventa prominente. Per la trasduzione a base di AAV di proteine sarcomere con tag fluorescenti, fare riferimento al passaggio 3.

2. Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane

  1. Preparazione dei mezzi di differenziazione
    1. RPMI+B27-Ins: mescolare 500 mL di RPMI 1640 medio, 10 mL di B27 meno insulina e 5,25 mL di L-alanina-L-glutammina.
    2. RPMI+B27+Ins: mescolare 500 mL di RPMI, 10 mL di integratore B27 e 5,25 mL di L-alanina-L-glutammina.
  2. Mantenimento delle cellule iPS umane
    1. Passare le cellule iPS umane due volte a settimana con AK02N su LN511-E8 seguendo il metodo precedentemente pubblicato con alcune modifiche21.
    2. Raccogliere le cellule con un trattamento di 3 minuti di rTrypsin e raccogliere in mezzo FBS al 10%. Contare le cellule e la centrifuga a 300 x g per 3 min a 4 °C. Seme 75.000-125.000 cellule in un pozzo di 6 piastre di pozzo con 2 mL di AK02N integrato con LN511-E8 e Y27632 alla concentrazione finale di 0,5 μg/mL (0,1 μg/cm2)e 10 μM, rispettivamente.
    3. Incubare a 37 °C e 5% CO2 e sostituire il mezzo il giorno seguente con 2 mL di AK02N senza alcun supplemento. Cambia supporto ogni due o tre giorni e passaggi ogni tre o quattro giorni.
  3. Giorno -4: rigonfiarsi prima della differenziazione
    1. Rivestire una piastra da 6 porri con 0,5 μg/cm2 di LN511-E8 diluito in PBS. Quindi, incubare per almeno 30 min a 37 °C e 5% CO2 o 1 h a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di rivestimento proprio prima delle cellule di semina.
    2. Raccogliere cellule iPS umane con rTripsina e contare le cellule come nel passaggio 2.2.2.
    3. Centrifuga 1,25 x 105 celle per un pozzo di una piastra a 6 pozzetti a 300 x g per 3 min a 4 °C e rimostranza in 2 mL di AK02N integrata con LN511-E8 (concentrazione finale 0,5 μg/mL o 0,1 μg/cm2)e Y27632 (concentrazione finale 10 μM) per pozzo.
    4. Soluzione di rivestimento aspirato, cellule rimostrate di semi nella piastra rivestita e incubare a 37 °C e 5% CO2.
  4. Giorni -3 e -1: sostituire il mezzo con 2 mL di AK02N.
  5. Giorno 0: Sostituire il mezzo con 2 mL di RPMI+B27-In integrati con CHIR99021 (concentrazione finale 6 μM) per bene per iniziare la differenziazione.
  6. Giorno 2: Sostituire il mezzo con 2 mL di RPMI+B27-Ins con WntC59 (concentrazione finale 2 μM) per pozzo.
  7. Giorno 4: Sostituire il mezzo con 2 mL di RPMI +B27-Ins per pozzo.
  8. Giorno 7 e giorno 9: sostituire il mezzo con 2 mL di RPMI+B27+Ins con puromicina (concentrazione finale 10 μg/mL) per pozzo per coltura selettiva PSC-CMs.
    NOTA: La linea ACTN2-mCherry, utilizzata in questo studio, ha una cassetta di sito di ingresso ribosomiale interno (IRES), gene resistente alla puromicina inserito nella regione 3′-non tradotta (UTR) del locus TNNT2, e mCherry che sostituisce il codone di arresto di ACTN2. Per purificare il cardiomiocita senza knock-in, fare riferimento ai passaggi 3 e 4.
  9. Giorno 10: rigonfiarsi per esperimenti futuri
    1. Rivestire una piastra di imaging da 35 mm con una coverlip polimerica con 0,5-1 μg/cm2 di LN511-E8 diluito in gelatina 0,1%. Incubare 2-4 ore a temperatura ambiente per una vitalità a lungo termine. Per culturare i PSC-CM nei modelli desiderati, fare riferimento ai passaggi 4 e 5 per la preparazione dei timbri PDMS.
    2. Per raccogliere psc-MC umani, lavare il piatto due volte con PBS, applicare 1 mL di rTrypsin per pozzo e incubare 3 min a 37 °C.
    3. Raccogliere celle in 4 mL del mezzo FBS 10%, sospendere e contare le celle. Piastra 250.000-500.000 cellule per piatto di imaging da 35 mm.
    4. Centrifugare un numero sufficiente di cellule a 300 x g per 3 min a 4 °C, risosopendire con RPMI+B27+Ins con puromicina (10 μg/mL) e piastra sulla piastra di imaging rivestita da 35 mm.
    5. Incubare durante la notte. La mattina seguente, sostituire il mezzo di coltura con RPMI+B27+Ins con puromicina (10 μg/mL).
    6. Dal giorno 14, cambiare il mezzo di coltura 2-3 volte a settimana con RPMI +B27+Ins fino al giorno 21-28 per l'imaging. Per la trasduzione a base di AAV di proteine sarcomere con tag fluorescenti, fare riferimento al passaggio 3.

3. Etichettatura fluorescente dei sarcomer che utilizzano virus associati ad adeno

  1. Preparazione prima della produzione AAV
    1. Mantenere le cellule HEK293T in DMEM integrate con FBS (concentrazione finale 10%) su una piastra di coltura tissutale di 10 cm. Cellule di passaggio tre volte a settimana.
    2. Preparare la polietilenimina (PEI) a 1 mg/mL. Mescolare 50 mg di polietilenimina MAX 40000 e 40 mL di acqua ultrapura. Regolare il pH a 7.0 utilizzando 1 N NaOH. Quindi, fare il volume finale a 50 mL con acqua ultrapura e filtrare attraverso un colino da 0,22 μm.
    3. Preparare un vettore navetta con un gene di etichettatura del sarcomero (ad esempio, TCAP o PDLIM3 fuso con una proteina fluorescente verde [GFP]), guidato da un promotore specifico per i cardiomiociti, come la troponina cardiaca T (cTNT)22.
      NOTA: Per questo caso, abbiamo usato GFP potenziato monomerico con mutazioni di V163A, S202T, L221V23.
  2. Giorno 0, passaggio cellule HEK
    1. Quando le cellule raggiungono la confluenza, passare 2,0 x 107 cellule HEK293T a una piastra di coltura tissutale di 15 cm con 20 mL di DMEM con FBS al 10%.
  3. Giorno 1, trasfezione
    1. Mescolare 13,5 μg del vettore shuttle, 26 μg di pHelper (un vettore codificante E2A, E4 e VA di adenovirus), 16,5 μg di pRC6 (un vettore che codifica i geni AAV2 Rep e AAV6 Cap) e 1 mL di DMEM senza piruvato di sodio (DMEM-Pyr).
    2. Mescolare 224 μL di PEI (1 mg/mL, preparato nella fase 3.1.2) e 776 μL di DMEM-Pyr.
    3. Mescolare e incubare la soluzione plasmotica e la soluzione PEI a temperatura ambiente per 30 min.
    4. Aggiungere la soluzione plasmide/PEI alle cellule HEK293T preparate al passaggio 3.2.
  4. Giorno 2, cambio medio
    1. A 24 ore dopo la trasfezione, cambiare medio in DMEM-Pyr. Cellule di coltura fino alla raccolta dell'AAV il giorno 7. AAV verrà rilasciato nei media culturali.
  5. Giorno 7, raccolta, concentrazione e sostituzione tampone AAV con metodo di purificazioneminimo 24
    1. Incubare un'unità di ultrafiltrazione centrifuga (taglio del peso molecolare di 100k [MWCO]) con 5 mL di 1% di BSA in PBS a temperatura ambiente per 15 minuti. Quindi, centrifugare l'unità di ultrafiltrazione a 500 x g per 2 minuti e aspirare soluzioni filtrate e rimanenti.
    2. Trasferire il mezzo dal piatto da 15 cm che ha prodotto AAV a un nuovo tubo conico da 50 mL e centrifuga (500 x g, 5 min). Filtrare il supernatante attraverso un filtro siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti cellulari e applicare la sospensione all'unità di ultrafiltrazione.
    3. Centrifuga a 2000 x g per 90 min o fino a concentrazione del supernatante di coltura da 0,5 a 1 mL.
    4. Aspirare il filtrato e applicare 15 mL di PBS all'unità di ultrafiltrazione.
    5. Ripetere la centrifugazione fino a quando il concentrato diventa 0,5-1 mL.
    6. Ripetere 3.5.4 e 3.5.5.
    7. Trasferire l'AAV concentrato in un nuovo tubo da 1,5 ml e conservare a 4 °C o -20 °C.
      NOTA: L'AAV può essere utilizzato nelle strutture P1 ma seguire le regole e i regolamenti locali. L'AAV può essere prodotto anche con metodi convenzionali.
  6. Calcolo del titer AAV
    1. Mescolare 5 μL di AAV, 195 μL di DMEM-Pyr e 10 U di benzonasi e incubare a 37 °C per 1 h.
    2. Aggiungere 200 μL di proteinasi K tampone (0,02 M Tris HCl e 1% SDS) e 5 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare a 37 °C per 1 h.
    3. Preparare con cura 400 μL di una soluzione di alcol fenolo/cloroformio/isoammil 25:24:1, vortice per 1 min e centrifugare a 20.000 x g per 1 min.
    4. Trasferire 200 μL della fase acquosa in un nuovo tubo da 1,5 ml, che produrrà circa la metà dei genomi AAV originali.
    5. Aggiungere 1 μL di glicogeno (20 mg/mL) a 20 μL di 3 M CH3COONa (pH 5.2) e vortice. Aggiungere nuovamente 250 μL di 2-propanolo a 100 μL di etanolo e vortice al 100%.
    6. Incubare a -80 °C per 15 min. Quindi centrifuga a 20.000 x g per 30 min a 4 °C.
    7. Aspirare il supernatante e aggiungere il 70% di etanolo al tubo. Quindi, centrifuga a 20.000 x g, 4 °C per 5 min.
    8. Aspirare il supernatante e asciugare all'aria fino a quando il pellet diventa chiaro.
    9. Aggiungere 200 μL di acido tris-etilendiamminatetraacetico (TE; pH 8.0) per risolvere i genomi AAV. Quindi, diluire il campione di 100 volte con TE.
    10. Preparare uno standard con pAAV-CMV-Vector a 6,5 ng/μL con TE per ottenere 109 genomi vettoriali (vg)/ μL. Quindi, fai una serie di diluizione di 10 volte da 104 a 108 con TE.
    11. Mescolare 1 μL di DNA campione (o gli standard), 0,4 μL di primer (5 μM), 3,6 μL di acqua distillata e 5 μL di miscela master verde SYBR. I primer, situati su ITR, sono 5′-GGAACCTAGTGATGGAGTT-3′ e 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Eseguire PCR in tempo reale con le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 °C per 60 s, 40 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s e ricottura ed estensione a 60 °C per 30 s, seguita da curva di fusione.
    13. In base agli standard e ai valori Ct, una macchina PCR in tempo reale fornisce il numero di copie del genoma vettoriale in 1 μL di un campione. Calcola il titer AAV originale usando la seguente equazione: un numero di copia fornito da PCR in tempo reale (vg/μL) x 8 x 103 x 2, in cui 8 x 103 come fattore di diluizione durante l'isolamento del genoma AAV e 2 come fattore di differenza di AAV (singolo filamento) e plasmide (doppio filamento).
  7. Trasduzione a PSC-CRM
    1. Conta le PSC-CMs in un piatto extra o extra.
    2. Diluire gli AAV (da 1 x 104 a 1 x 106 vg/cell) per realizzare 50 μL con PBS. Applicare AAV alla molteplicità di infezione (MOI) da 1 x 104 a 1 x 106 vg/cell a PSC-CRM e coltura PSC-CMs per 3 giorni con AAV nei corrispondenti mezzi di differenziazione per mouse e PSC-CM umani, quindi cambiare i supporti in mezzo di coltura senza AAV.
    3. Utilizzare psc-CRM per l'imaging a celle vive dopo 7 giorni o più dopo la trasduzione.

4. Purificazione [facoltativa] basata su AAV delle PSC-CRM

  1. Preparazione dell'AAV
    1. Preparare l'AAV come descritto nel passaggio 3 utilizzando un vettore shuttle che esprime un gene resistente alla blastidina sotto il controllo del promotore cTNT.
  2. Trasduzione a cellule iPS differenzianti
    1. Differenziare le cellule iPS umane per 4 giorni dopo il protocollo descritto nel passaggio 2 e contare il numero di celle in un pozzo aggiuntivo.
    2. Dopo aver cambiato supporto al giorno 4, applicare gli AAV al MOI di 1 x 105 vg/cell per differenziare i PSC nei supporti RPMI+B27-Ins.
    3. Al giorno 7, aggiornare il mezzo con RPMI +B27+Ins e aggiungere 2,5-10 μg/mL di blasticidina.
    4. Al giorno 10, i PSC-CM sono pronti a rigonfiarsi.

5. Preparazione di francobolli PDMS

  1. Progettare il modello di dispositivo di strisce da 200 μm insieme a scanalature da 10-25 μm tra le strisce utilizzando un software di disegno CAD (Computer-Aided Design).
  2. Disegna il modello di dispositivi su una fotomaschera al cromo rivestita con AZP1350 utilizzando la luce UV di uno strumento di litografia senza maschera.
  3. Sviluppa il modello sulla maschera fotografica in una serie di sviluppatori fotoresist positivi (ad esempio, incisione sul cromo) e risciacqua con acqua DI.
  4. Disidratare un wafer di silicio su una piastra calda a 120 °C per 15 minuti.
  5. Lasciare raffreddare il wafer a temperatura ambiente e girare-coat un fotoresist negativo SU-8 3010 per fare un'altezza di 10-20 μm con 1500 giri/min per 30 s utilizzando uno spin-coater.
  6. Cuocere il wafer in due passaggi su una piastra calda secondo il protocollo del produttore.
  7. Dopo che il wafer si raffredda a temperatura ambiente, caricare il wafer sull'allineatore della maschera.
  8. Utilizzare un allineatore maschera per allineare la maschera sul wafer ed esporre il wafer alla luce UV.
  9. Condurre la cottura post-esposizione al wafer in due passaggi su una piastra calda secondo il protocollo del produttore.
  10. Sviluppare il wafer in una serie di sviluppatori SU-8 e 2-Propanol, quindi asciugare il wafer con un flusso di azoto.
  11. Trasferire il wafer in una piastra di Petri di dimensioni adeguate.
  12. Mescolare l'elastomero PDMS e il suo agente polimerizzante in un rapporto di 10:1 con e versare il composto nella piastra di Petri.
  13. Degasa il PDMS in un essiccatore fino a quando tutte le bolle d'aria scompaiono, quindi polimerizza il PDMS su piastra calda a 80 °C per 2 ore.
  14. Staccare il PDMS stagionato dallo stampo principale utilizzando una pinzetta, quindi tagliare la porzione con il design come timbro PDMS.
    NOTA: La forma può essere quadrata, tuttavia, una forma ottagonale trasferisce meglio il motivo sul bordo.

6. Coltura modellata di cardiomiociti pluripotenti derivati da cellule staminali

  1. Rimuovere la polvere dalla superficie dei francobolli PDMS utilizzando il nastro di riparo.
  2. Immergere i francobolli in 70% di etanolo per sterilizzare. Quindi, soffiare l'etanolo dalla superficie dei francobolli usando uno spolverino d'aria.
  3. Applicare 5-10 μL di 0,5 wt% 2-metacriloilossietile fosforilcolina (MPC) polimero/etanolo sulla superficie dei francobolli PDMS.
    NOTA: Una distribuzione irregolare del polimero MPC può causare un modello interrotto.
  4. Incubare 10-30 min fino a quando il polimero MPC non viene completamente asciugato.
  5. Posizionare i timbri a contatto con le copertine di una piastra di coltura con fondo di vetro o di una piastra di imaging da 35 mm con un copriscivolo polimerico e mettere un peso (ad esempio, una batteria AAA) sul timbro per 10 minuti.
  6. Rimuovere il peso e i timbri. Quindi, confermare che il modello è stato trasferito al microscopio.
    NOTA: I piatti/piatti stampati possono essere conservati fino a 1 settimana a temperatura ambiente.
  7. Lavare i pozzi / piatti stampati con PBS due volte.
  8. Diluire LN511-E8 con PBS a 2-4 μg/mL e rivestire il piatto con LN511-E8 a 0,5-1 μg/cm2. Per i PSC-CRM umani, diluire LN511-E8 con soluzione di gelatina dello 0,1% al posto del PBS. Quindi, incubare per almeno 1 h (in modo ottimale, più di 4 ore).
  9. Celle a piastre come descritto nelle sezioni precedenti.

7. Imaging time-lapse di sarcomi al microscopio fluorescente

  1. Accendere e collegare il microscopio, il computer associato e anche tutte le periferiche richieste.
  2. Per eseguire l'imaging time-lapse, cattura immagini time-lapse con il più alto ingrandimento (obiettivo 100X con emersione dell'olio).
  3. Selezionare le condizioni di imaging dal vivo. Per ottenere dati rappresentativi, provare ad adattarli alla frequenza fotogrammi più alta (si consiglia un minimo di 20 ms o 50 fotogrammi al secondo). Aprire l'otturatore e applicare un binning necessario (4 X 4) e un ritaglio dell'area di acquisizione per ottenere gli intervalli più brevi tra le immagini durante l'imaging time-lapse.
    NOTA: L'impostazione può variare a seconda delle configurazioni dei microscopi. La fotocamera deve essere ad alta sensibilità ed è in grado di trasferire i dati al PC collegato abbastanza velocemente. A tal fine, abbiamo usato il flash ORCA con Camera-link. Abbiamo testato una microscopia confocale rotante e abbiamo acquisito immagini a 400 fotogrammi al secondo.
    1. [Facoltativo] Se la velocità di battiaggio delle cellule è bassa, evocare le cellule mediante stimolazione del campo elettrico.
  4. Eseguire il record time-lapse
    1. Assicurarsi che i campi con immagini rimangano a fuoco durante la registrazione dell'immagine time-lapse.
    2. Salvare le immagini time-lapse in una cartella appropriata.

8. Analisi dell'imaging time-lapse utilizzando SarcOptiM, un plugin ImageJ/Fiji

  1. Caricare una serie di immagini time-lapse in ImageJ. Per il formato VSI Olympus, aprire i file tramite Plug-in OlympusViewer.
  2. Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine per osservare chiaramente il motivo del sarcomero (Immagine | Regola | Luminosità/Contrasto).
  3. Aprite SarcOptiM scegliendo Altri strumenti (>>) e SarcOptiM.
  4. Calibrare il programma premendo CTRL+MAIUSC + P e 1 μm sulla barra degli strumenti e seguendo le istruzioni delle finestre di dialogo.
  5. Tracciare una linea attraverso la regione del sarcomero che verrà utilizzata per misurare l'accorciamento del sarcomero.
  6. Avviare l'analisi di accorciamento sarcomere premendo SingleCell (AVI) sulla barra degli strumenti. I dati rappresentativi sono riportati nella figura 1 e nella figura 2.

Risultati

Misurazione dell'accorciamento del sarcomere mediante linee di reporter PSC-CMs knock-in. Le PSC-CRM con etichetta sarcomere sono state utilizzate per misurare l'accorciamento del sarcomero. Le linee esprimono Myom2-RFP e ACTN2-mCherry da loci endogeni. TagRFP è stato inserito in Myom2, codificando le M-proteine che si localizzano sulla linea M, mentre mCherry è stato inserito in ACTN2, codificando α-Actinin, che si localizza sulla linea Z

Discussione

I PSC-CRM hanno un grande potenziale per essere utilizzati come piattaforma in vitro per modellare le malattie cardiache e testare gli effetti dei farmaci. Tuttavia, è necessario prima stabilire un metodo accurato e unificato per valutare le funzioni PSC-CMs. La maggior parte dei test funzionali funziona con PSC-MC, ad esempio elettrofisiologia, transitore di calcio e metabolismo26,e uno dei primi studi PSC-CM derivati dal paziente riguardava la sindrome del QT lungo27<...

Divulgazioni

H.U. ha depositato un brevetto relativo a questo manoscritto.

Riconoscimenti

Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio della Divisione di Medicina Rigenerativa dell'Università medica di Jichi per l'utile discussione e assistenza tecnica. Questo studio è stato sostenuto dalle sovvenzioni dell'Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED; JP18bm0704012 e JP20bm0804018), la Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), e la Japanese Circulation Society (la Grant for Basic Research) a H.U.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.A.We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonase (25 U/µL)Merck Millipore70746
Blasticidin S HydrochlorideFujifilm wako029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.314-BP-010
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
CAD drawing software,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Chromium etchantNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JapanN14B
Chromium mask coated with AZP1350Clean Surface Technology Co., JapanCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))Takara9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvateSigma-AldrichD5796
Ethanol (99.5)Fujifilm wako057-00456
Fetal Bovine SerumMoregate59301104
FGF-10, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinantFujifilm wako060-04543
Gelatin from porcine skin powderSigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
GLASS BOTTOM culture platesMatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium SaltFujifilm wako196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Mask alignerUnion Optical Co., Ltd., JapanPEM-800
Maskless lithography toolNanoSystem Solutions, Inc., JapanD-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.A.Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Petri dishSansei medical co. Ltd01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomerDow Corning Corp., MI, USASILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)Polyscience24765-1
Positive photoresist developerTokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., JapanNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Proteinase KTakara9034
Puromycin DihydrochlorideFujifilm wako166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A ProteinR&D Systems, Inc.338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)Thermo Fisher Scientific12604-039
RPMI1640 MediumThermo Fisher Scientific11875-119
Silicon waferMatsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., JapanN.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher Scientific11360-070
Spin-coaterMikasa Co., Ltd., JapanMS-A100
Spininng confocal microscopyOxford InstrumentsAndor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)Fujifilm wako195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8 developerKayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 developer
Tris-EDTANippon Gene314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinantFujifilm wako226-01781

Riferimenti

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