АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод может быть использован для исследования укорочения саркомера с использованием плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, с флуоресцентными белками саркомера.

Аннотация

Плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (PSC-CMs), могут быть получены как из эмбриональных, так и из индуцированных плюрипотентных стволовых (ES / iPS) клеток. Эти клетки являются перспективными источниками для моделирования сердечных заболеваний. Для кардиомиопатий укорочение саркомера является одной из стандартных физиологических оценок, которые используются со взрослыми кардиомиоцитами для изучения фенотипов их заболевания. Однако имеющиеся методы не подходят для оценки сократимости PSC-CMs, так как эти клетки имеют недостаточно развитые саркомеры, которые невидимы при фазово-контрастной микроскопии. Для решения этой проблемы и выполнения укорочения саркомера с помощью PSC-CMs использовались флуоресцентные помеченные белки саркомера и флуоресцентная живая визуализация. Тонкие Z-линии и М-линия находятся на обоих концах и в центре саркомера соответственно. Белки Z-линии — α-актинин (ACTN2), телетонин (TCAP) и актин-ассоциированный белок LIM (PDLIM3) — и один белок M-линии — Myomesin-2 (Myom2) — были помечены флуоресцентными белками. Эти помеченные белки могут быть экспрессированы из эндогенных аллелей в виде нокаутов или из аденоассоциированных вирусов (AAV). Здесь мы представляем методы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека к кардиомиоцитам, для производства AAV, а также для выполнения и анализа живой визуализации. Описаны также методы получения полидиметилсилоксановых (PDMS) штампов для узорчатой культуры PSC-CMs, что облегчает анализ укорочения саркомера флуоресцентно-помеченными белками. Для оценки укорочения саркомера были записаны покадровые изображения бьющихся клеток с высокой частотой кадров (50-100 кадров в секунду) при электрической стимуляции (0,5-1 Гц). Для анализа длины саркомера в ходе сокращения клеток записанные покадровые изображения были подвергнуты SarcOptiM, плагину для ImageJ / Fiji. Наша стратегия предоставляет простую платформу для исследования фенотипов сердечных заболеваний в PSC-CMs.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности во всем мире1, а кардиомиопатия представляет собой третью причину смертности, связанной с сердцем2. Кардиомиопатия – это коллективная группа заболеваний, поражающих сердечную мышцу. Последние разработки индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток и направленная дифференцировка iPS-клеток в сторону кардиомиоцитов (PSC-CMs) открыли двери для изучения кардиомиоцитов с геномом пациента в качестве модели кардиомиопатии in vitro. Эти клетки могут быть использованы для понимания патофизиологии сердечных заболеваний, для выяснения их молекулярных механизмов и для тестирования различных терапевтических кандидатов3. Существует огромный интерес, таким образом, были сгенерированы iPS-клетки, полученные от пациента (например, гипертрофическая кардиомиопатия [HCM]4,5,аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка [ARVC]6,дилатационная кардиомиопатия [DCM]7и кардиомиопатии, связанные с митохондриями,8,9). Поскольку одной из характеристик кардиомиопатии является дисфункция и нарушение саркомер, необходим действительный инструмент, который равномерно измеряет функцию саркомера.

Укорочение саркомера является наиболее широко используемым методом оценки функции саркомера и сократимости взрослых кардиомиоцитов, полученных от животных моделей и людей. Для выполнения укорочения саркомера требуются хорошо развитые саркомы, которые видны при фазово-контрастном. Однако PSC-CMs, культивируемые in vitro, демонстрируют недоразвитые и дезорганизованные саркомеры и, следовательно, не могут быть использованы для правильного измерения укорочения саркомера10. Эта трудность правильной оценки сократимости PSC-CMs препятствует их использованию в качестве платформы для оценки сердечных функций in vitro. Для косвенной оценки сократимости PSC-CMs использовались атомно-силовая микроскопия, микропостойные массивы, микроскопия силы тяги и измерения импеданса для измерения влияния движения, оказываемого этими клетками на их окружение11,12,13. Более сложные и менее инвазивные видеомикроскопические записи фактического клеточного движения (например, SI8000 от SONY) могут быть использованы для альтернативной оценки их сократимости, однако этот метод не измеряет непосредственно саркомерное движение или кинетику генерации силы14.

Для непосредственного измерения движения саркомера в PSC-CMs появляются новые подходы, такие как флуоресцентная маркировка белка саркомера. Например, Lifeact используется для маркировки нитевидных актинов (F-актина) для измерения саркомерного движения15,16. Генетически модифицированные iPS-клетки являются еще одним вариантом маркировки саркомерных белков (например, α-актинина [ACTN2] и миомезина-2 [MYOM2]) флуоресцентным белком17,18,19.

В этой статье мы описываем, как выполнить покадровую визуализацию для измерения укорочения саркомера с использованием Myom2-TagRFP (эмбриональные стволовые клетки мыши [ES]) и ACTN2-mCherry (человеческие iPS-клетки). Мы также показываем, что узорчатая культура облегчает выравнивание саркомера. Кроме того, мы описываем альтернативный метод маркировки саркомера с использованием аденоациациированных вирусов (AAV), который может быть широко применен к iPS-клеткам, полученным от пациента.

протокол

1. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток мышей

  1. Обслуживание ES ячеек мыши
    1. Поддерживающая среда: Смешайте 50 мл фетальной бычий сыворотки (FBS), 5 мл L-аланин-L-глутамина, 5 мл незамененной аминокислоты (NEAA), 5 мл 100 мМ пирувата натрия и 909 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанола с 450 мл минимальной незаменимой среды Глазго (GMEM). Дополняйте фактор ингибирования лейкемии (LIF), CHIR-99021 и PD0325901 в конечной концентрации 1000 Ед/мл, 1 мкМ и 3 мкМ соответственно. Стерилизуйте среду через фильтр 0,22 мкм.
    2. Среда FBS: смешайте 55 мл FBS, 5,5 мл L-аланина-L-глутамина, 5,5 мл пирувата натрия и 5,5 мл NEAA до 500 мл высокой глюкозы Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM). Фильтруйте среду через фильтр 0,22 мкм для стерилизации.
    3. Культура SMM18 мыши ES клеток, в которых TagRFP был выбит в локус Myom2 на желатинизированной 6 см посуде в поддерживающей среде, как описаноранее 18. Прохождение каждые 2-3 дня.
  2. Получение безывороточной дифференцировочной среды (SFD)
    1. Базальный SFD: смешайте 250 мл F-12 Хамса, 750 мл модифицированной среды Dulbecco (IMDM), 10 мл добавки B27 без витамина A, 5 мл добавки N2, 10 мл L-аланина-L-глутамина, 5 мл 10% бычих сывороточных альбуминов в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) и 10 мл пенициллина и стрептомицина (10 000 ЕД / мл). Фильтровать через ситечко 0,22 мкм для стерилизации.
    2. Растворить аскорбиновую кислоту в 5 мг/мл в дистиллированной воде и процедить через ситечко 0,22 мкм для стерилизации.
    3. Развести 13 мкл 1-тиоглицерина до 1 мл ИМДМ. Здесь относятся к этому разбавленный 1-тиоглицерин как MTG.
    4. Добавьте 10 мкл аскорбиновой кислоты (5 мг/мл) и 3 мкл МТГ к 1 мл базального СФД в день использования. В данном описании эта смесь называется полным SFD.
  3. День 0, формирование эмбриоидного тела (EB) для дифференцировки
    1. Соберите ES-клетки SMM18 мыши с рекомбинантной трипсин-подобной протеазой (rTrypsin) и подсчитайте клетки.
    2. Центрифуга 5 х 105 клеток при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C, повторно суспендировать в 10 мл полного SFD и посеять в 10-сантиметровую чашку Петри. Культивьяйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 50 ч.
  4. Дифференциация день 2
    1. Добавьте активин А, фактор роста эндотелия сосудов человека (hVEGF) и костный морфогенетический белок 4 (BMP4) для полного SFD в конечной концентрации 5 нг / мл, 5 нг / мл и 1,9 нг / мл соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации БМП4 могут различаться в зависимости от партии БМП4. Протестируйте несколько концентраций в небольшом исследовании перед использованием новой партии и определите лучшую концентрацию для сердечной дифференцировки.
    2. Переложите ЭБ из чашки Петри в трубку 15 мл и центрифугу при 50-100 х г в течение 3 мин при 4 °C.
    3. Тем временем добавьте среду, приготовленную на этапе 1.4.1, в чашку Петри, чтобы защитить оставшиеся ЭБ, будучи сухими.
    4. Аспирировать супернатант из трубки 15 мл, повторно суспендировать ЭБ со средой в чашке Петри и перенести раствор EB обратно в чашку. Затем культивируют ЭБ при 37 °C и 5% CO2 в течение 46 ч.
  5. Дифференциация день 4
    1. Желатинизируйте 10 см тканевую культуру блюда с 5-10 мл 0,1% желатина в течение не менее 5 минут. Аспират желатина непосредственно перед посевом клеток.
    2. Приготовление среды: Смешайте основной фактор роста фибробластов (bFGF), FGF10 и hVEGF для получения конечных концентраций SFD при 5 нг/мл, 25 нг/мл и 5 нг/мл соответственно. Для блюда 10 см приготовить 10 мл.
    3. Перенесите клетки из чашки Петри в трубку 15 мл. Добавьте 5 мл PBS в чашку Петри, вымойте несколько раз и переложите в 15-мл трубку, чтобы собрать оставшиеся клетки. Центрифуга при 50-100 х г, 4 °C, 3 мин.
    4. Аспират супернатант, добавляют 1 мл rTrypsin и инкубируют при 37 °C в течение 3 мин.
    5. Вихрь ненадолго, чтобы диссоциировать ЭБ, добавить 9 мл 10% среды FBS, снова вихрь и подсчитать клетки.
    6. Центрифуга 1,5 х 107 клеток при 300 х г, 4 °С в течение 3 мин, повторно суспендируют со средой, приготовленной на этапе 1.4.2, и высевают в желатинизированную посуду. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: К 7 или 8 дню можно наблюдать обширное биение PSC-CMs.
  6. Подбор препарата на 7 и 9 день дифференцировки: Повторное заполнение среды пуромицином (2 мкг/мл в конечной концентрации) для устранения некримиоцитов на 7 и 9 день дифференцировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Родительской линией SMM18 является syNP4 мышиные ES-клетки, в удерживающие промоторный ген NCX1, устойчивый к пуромицину20.
  7. День 10, перекладывать для будущих экспериментов
    1. Покрыть стеклянную культурную пластину или 35-миллиметровую тарелку для визуализации, содержащую полимерный покровный лист, 0,1% желатина. Для усиления созревания покрываем посуду фрагментом ламинина-511 Е8 (LN511-E8) по 1 мкг/см2 в течение 30-60 мин при комнатной температуре18. Для культивирования PSC-CMs по конкретным шаблонам, представляющим интерес, пожалуйста, обратитесь к шагам 4 и 5 для приготовления штампов полидиметилсилоксана (PDMS).
    2. Чтобы собрать урожай SMM18 PSC-CMs, дважды вымойте посуду PBS, нанесите 1 мл rTrypsin и инкубировать 3 мин при 37 °C.
    3. Соберите клетки в 9 мл 10% среды FBS, приостановите и подсчитайте клетки. Размещайте ячейки на 50 000-100 000 клеток в одной скважине из 24-скважинной пластины или 250 000-500 000 клеток в 35-миллиметровой тарелке для визуализации.
    4. Центрифугируют достаточное количество клеток (300 х г, 3 мин) и повторно суспендируют клетки полным СФД, дополненным ФБС (конечная концентрация в 10%).
    5. Инкубируют на ночь и меняют культурную среду до полного СФД с пуромицином.
    6. С 14-го дня меняйте культурную среду два-три раза в неделю с полным СФД до 21-28 дня, когда Myom2-RFP становится заметным. Для трансдукции на основе AAV флуоресцентных помеченных саркомерных белков, пожалуйста, обратитесь к Шагу 3.

2. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека

  1. Подготовка дифференцированных сред
    1. RPMI+B27-Ins: смешайте 500 мл среды RPMI 1640, 10 мл B27 минус инсулин и 5,25 мл L-аланина-L-глутамина.
    2. RPMI+B27+Ins: смешайте 500 мл RPMI, 10 мл добавки B27 и 5,25 мл L-аланина-L-глутамина.
  2. Поддержание iPS-клеток человека
    1. Прохождение человеческих iPS-клеток два раза в неделю с AK02N на LN511-E8 по ранее опубликованному методу с некоторыми модификациями21.
    2. Соберите клетки с помощью 3-минутной обработки rTrypsin и соберите в 10% среду FBS. Подсчитайте ячейки и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C. Посеять 75 000-125 000 клеток в одной скважине из 6 пластин с 2 мл AK02N, дополненных LN511-E8 и Y27632 в конечной концентрации0,5 мкг/мл (0,1 мкг/см2) и 10 мкМ соответственно.
    3. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 и заменить среду на следующий день 2 мл AK02N без каких-либо добавок. Меняйте носитель каждые два-три дня и проходите каждые три-четыре дня.
  3. День -4: перекладывание перед дифференциацией
    1. Покрыть 6-скважинную пластину 0,5 мкг/см2 LN511-E8, разбавленной в PBS. Затем инкубируют в течение не менее 30 мин при 37°С и 5% СО2 или 1 ч при комнатной температуре. Раствор для покрытия аспирата непосредственно перед посевом клеток.
    2. Соберите человеческие iPS-клетки с помощью rTrypsin и подсчитайте клетки, как на шаге 2.2.2.
    3. Центрифуга 1,25 х 105 ячеек для скважины из 6-й пластины при 300 х г в течение 3 мин при 4 °С и повторное суспендование в 2 мл АК02Н с добавлением LN511-E8 (конечная концентрация 0,5 мкг/мл или 0,1 мкг/см2) и Y27632 (конечная концентрация 10 мкМ) на скважину.
    4. Аспиратное покрытие раствора, семена повторно суспендируют клетки в покрытую пластину и инкубируют при 37 °C и 5% CO2.
  4. Дни -3 и -1: заменить средний на 2 мл АК02Н.
  5. День 0: Замените среду 2 мл RPMI+B27-Ins, дополненными CHIR99021 (конечная концентрация 6 мкМ) на скважину, чтобы начать дифференциацию.
  6. День 2: Заменить среду 2 мл RPMI+B27-Ins на WntC59 (конечная концентрация 2 мкМ) на скважину.
  7. День 4: Замените среду 2 мл RPMI+B27-Ins на скважину.
  8. День 7 и день 9: заменить среду 2 мл RPMI+B27+Ins на пуромицин (конечная концентрация 10 мкг/мл) на скважину для селективного культивирования PSC-CMs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Линия ACTN2-mCherry, используемая в этом исследовании, имеет кассету внутреннего рибосомального входа (IRES), пуромицин-резистентный ген, вставленный в 3'-нетранслированную область (UTR) локуса TNNT2, и mCherry, заменяющий стоп-кодон ACTN2. Чтобы очистить кардиомиоциты без стука, пожалуйста, обратитесь к шагам 3 и 4.
  9. День 10: перекладывать для будущих экспериментов
    1. Покрыть 35-миллиметровую тарелку для визуализации полимерным чехловым слипом с 0,5-1 мкг/см2 LN511-E8, разведенным в 0,1% желатина. Инкубировать 2-4 ч при комнатной температуре для длительной жизнеспособности. Чтобы культивировать PSC-CMs по желаемым образцам, обратитесь к шагам 4 и 5 для подготовки штампов PDMS.
    2. Чтобы собрать у человека PSC-CMs, дважды вымойте посуду PBS, нанесите 1 мл rTrypsin на скважину и инкубировать 3 мин при 37 °C.
    3. Соберите клетки в 4 мл 10% среды FBS, приостановите и подсчитайте клетки. Пластина 250 000-500 000 клеток на 35 мм тарелку для визуализации.
    4. Центрифугируют достаточное количество клеток при 300 х г в течение 3 мин при 4 °C, повторно суспендируют RPMI+B27+Ins с пуромицином (10 мкг/мл) и пластину на покрытой 35 мм пластине для визуализации.
    5. Инкубировать на ночь. На следующее утро замените питательную среду rpmI+B27+Ins на пуромицин (10 мкг/мл).
    6. С 14-го дня меняйте культурную среду 2-3 раза в неделю с RPMI+B27+Ins до 21-28 дня для визуализации. Для трансдукции на основе AAV флуоресцентных помеченных саркомерных белков, пожалуйста, обратитесь к Шагу 3.

3. Флуоресцентная маркировка саркомер с использованием аденоациациированных вирусов

  1. Подготовка перед производством ААВ
    1. Поддерживать клетки HEK293T в DMEM с добавлением FBS (конечная концентрация 10%) на 10 см тканевой культурной пластине. Прохождение клеток три раза в неделю.
    2. Готовят полиэтиленимин (PEI) в 1 мг/мл. Смешать 50 мг полиэтиленимина MAX 40000 и 40 мл сверхчистой воды. Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью 1 N NaOH. Затем сделайте конечный объем до 50 мл сверхчистой водой и процедите через сетчатый фильтр 0,22 мкм.
    3. Подготовьте челночный вектор с геном маркировки саркомера (например, TCAP или PDLIM3, слитым с зеленым флуоресцентным белком [GFP]), управляемым кардиомиоцит-специфическим промотором, таким как сердечный тропонин T (cTNT)22.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого случая мы использовали мономерный усиленный GFP с мутациями V163A, S202T, L221V23.
  2. День 0, прохождение HEK клеток
    1. Когда клетки достигают слияния, проходя 2,0 х 107 клеток HEK293T в 15 см тканевую культурную пластину с 20 мл DMEM с 10% FBS.
  3. День 1, трансфекция
    1. Смешайте 13,5 мкг челночного вектора, 26 мкг pHelper (вектор, кодирующий E2A, E4 и VA аденовируса), 16,5 мкг pRC6 (вектор, кодирующий гены AAV2 Rep и AAV6 Cap) и 1 мл DMEM без пирувата натрия (DMEM-Pyr).
    2. Смешайте 224 мкл PEI (1 мг/мл, приготовленный на этапе 3.1.2) и 776 мкл DMEM-Pyr.
    3. Смешайте и инкубируют плазмидный раствор и раствор ПЭИ при комнатной температуре в течение 30 мин.
    4. Добавьте раствор плазмиды/PEI к клеткам HEK293T, приготовленным на этапе 3.2.
  4. День 2, среднее изменение
    1. Через 24 ч после трансфекции меняют среду на DMEM-Pyr. Культивирование клеток до сбора AAV на 7 день. AAV будет выпущен в культурные среды.
  5. День 7, Сбор, концентрация и замена буфера AAV с использованием метода минимальной очистки24
    1. Инкубировать центробежную ультрафильтрационную установку (100k molecular weight cut-off [MWCO]) с 5 мл 1% BSA в PBS при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем центрифугируют установку ультрафильтрации при 500 х г в течение 2 мин и аспирируют как отфильтрованные, так и оставшиеся растворы.
    2. Перенесите среду с 15-сантиметровой тарелки, на которую был изготовлен AAV, на новую коническую трубку и центрифугу 50 мл (500 x g, 5 мин). Отфильтруйте супернатант через сетчатый фильтр 0,45 мкм для удаления остатков клеток и нанесите суспензию на установку ультрафильтрации.
    3. Центрифугу при 2000 х г в течение 90 мин или до концентрирования культуры супернатанта 0,5 - 1 мл.
    4. Аспирировать фильтрат и нанести 15 мл PBS на ультрафильтрационную установку.
    5. Центрифугирование повторяют до тех пор, пока концентрат не станет 0,5-1 мл.
    6. Повторите 3.5.4 и 3.5.5.
    7. Переложите концентрированный AAV в новую трубку 1,5 мл и храните при 4 °C или -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: AAV можно использовать на объектах P1, но следовать местным правилам и положениям. AAV также может быть получен обычными методами.
  6. Расчет титра AAV
    1. Смешайте 5 мкл AAV, 195 мкл DMEM-Pyr и 10 ЕД бензоназы и инкубировать при 37 °C в течение 1 ч.
    2. Добавьте 200 мкл буфера протеиназы K (0,02 M Tris HCl и 1% SDS) и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл) и инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
    3. Тщательно приготовьте 400 мкл раствора фенола/хлороформа/изоамилового спирта 25:24:1, вихрь в течение 1 мин и центрифугу при 20 000 х г в течение 1 мин.
    4. Перенесите 200 мкл водной фазы в новую трубку 1,5 мл, которая даст примерно половину исходных геномов AAV.
    5. Добавьте 1 мкл гликогена (20 мг/мл) к 20 мкл 3 M CH3COONa (рН 5,2) и вихря. Добавьте 250 мкл 2-пропанола к 100 мкл 100% этанола и снова вихрь.
    6. Инкубировать при -80 °C в течение 15 мин. Затем центрифугу при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
    7. Аспирировать супернатант и добавить 70% этанола в пробирку. Затем центрифугу при 20 000 х г, 4 °C в течение 5 мин.
    8. Аспирировать супернатант и сушить на воздухе до тех пор, пока гранула не станет прозрачной.
    9. Добавьте 200 мкл трис-этилендиаминтетрауксусной кислоты (TE; рН 8,0) для разрешения геномов AAV. Затем разбавьте образец в 100 раз ТЕ.
    10. Подготовьте стандарт с pAAV-CMV-Vector при 6,5 нг/мкл с TE для получения 109 векторных геномов (vg)/мкл. Затем делают серию 10-кратного разведения от 104 до 108 с ТЭ.
    11. Смешайте 1 мкл образца ДНК (или эталонов), 0,4 мкл праймеров (5 мкМ), 3,6 мкл дистиллированной воды и 5 мкл мастер-микса SYBR Green. Грунтовки, расположенные на ITR, 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ и 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′.
    12. Выполняйте ПЦР в режиме реального времени со следующим условием: начальная денатура при 95 °C в течение 60 с, 40 циклов денатурирования при 95 °C в течение 15 с, а также отжиг и удлинение при 60 °C в течение 30 с последующей кривой плавления.
    13. Основываясь на стандартах и значениях Ct, аппарат ПЦР в режиме реального времени обеспечивает число копий векторного генома в 1 мкл образца. Рассчитайте исходный титр AAV, используя следующее уравнение: число копий, предоставляемое ПЦР в реальном времени (vg/μL) x 8 x 103 x 2, где 8 x 103 в качестве разбавляемого фактора во время выделения генома AAV и 2 в качестве разностного фактора AAV (одноцепочечный) и плазмиды (двухцепочечный).
  7. Трансдукция в PSC-CMs
    1. Считайте PSC-CMs в дополнительном колодце или дополнительном блюде.
    2. Разбавьте AAV (1 x 104 до 1 x 106 vg/ячейка) до 50 мкл с PBS. Применяют AAV при кратности инфекции (MOI) от 1 х 10 4 до1 х 106 vg/клетка к PSC-CMs и культивируют PSC-CMs в течение 3 дней с AAV в соответствующих дифференцированных средах для мыши и человека PSC-CMs, затем меняют среду на культуральную среду без AAV.
    3. Используйте PSC-CMs для визуализации живых клеток через 7 дней или более после трансдукции.

4. [Опционально] Очистка PSC-CMs на основе AAV

  1. Подготовка ААВ
    1. Приготовьте AAV, как описано в Шаге 3, используя челночный вектор, экспрессирующий бластицидин-резистентный ген под контролем промотора cTNT.
  2. Трансдукция к дифференцированным iPS-клеткам
    1. Дифференцируйте человеческие iPS-клетки в течение 4 дней в соответствии с протоколом, описанным в шаге 2, и подсчитайте количество клеток в дополнительном колодец.
    2. После изменения среды на 4-й день примените AAVs в MOI 1 x 105 vg/ячейку для дифференцирования PSC в средах RPMI+B27-Ins.
    3. На 7-й день обновите среду RPMI+B27+Ins и добавьте 2,5-10 мкг/мл бластицидина.
    4. На 10-й день PSC-CMs готовы к перекладке.

5. Подготовка штампов PDMS

  1. Спроектируйте рисунок устройства из полос 200 мкм вместе с канавками 10-25 мкм между полосами с помощью программного обеспечения для рисования автоматизированного проектирования (CAD).
  2. Нарисуйте рисунок устройств на хромированной фотомаске, покрытой AZP1350, используя ультрафиолетовый свет инструмента литографии без маски.
  3. Разработайте рисунок на фотомаске в серии положительных фоторезистов (например, хромовый травилка) и промойте водой DI.
  4. Обезвоживать кремниевую пластину на конфорке при 120 °C в течение 15 мин.
  5. Дайте пластине остыть до комнатной температуры и отспилите негативное фоторезист СУ-8 3010, чтобы сделать высоту 10-20 мкм с 1500 об/мин в течение 30 с помощью спин-коатера.
  6. Мягко запекайте в два этапа на конфорке согласно протоколу производителя.
  7. После того, как пластина остынет до комнатной температуры, загрузите пластину на выравниватель маски.
  8. Используйте выравнивание маски, чтобы выровнять маску на пластине и подвергнуть пластину воздействию ультрафиолетового излучения.
  9. Проведите постэкспозиционное выпекание к пластине в два этапа на конфорке согласно протоколу производителя.
  10. Разрабатываем пластину в серии СУ-8 разработчика и 2-Пропанола, затем сушим пластину струей азота.
  11. Переложите в чашку Петри подходящего размера.
  12. Смешайте эластомер PDMS и его отверждающее средство в соотношении 10:1 w/w и перелейте смесь в чашку Петри.
  13. Дегазируйте PDMS в адсорбаторе до тех пор, пока все пузырьки воздуха не исчезнут, затем отвержите PDMS на конфорке при 80 °C в течение 2 ч.
  14. Отклейте отвержденный PDMS от основной формы с помощью пинцетка, затем вырежьте часть с конструкцией, чтобы она была штампом PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Форма может быть квадратной, однако восьмиугольная форма лучше передает узор по краю.

6. Узорчатая культура кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток

  1. Удалите пыль с поверхности штампов PDMS с помощью починочной ленты.
  2. Погрузьте штампы в 70% этанол для стерилизации. Затем выдуйте этанол с поверхности штампов с помощью воздушного пылесосы.
  3. Нанесите 5-10 мкл 0,5 мас.% 2-метанрилоксиэтилфосфорилхолин (MPC) полимера/этанола на поверхность марок PDMS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное распределение полимера MPC может привести к нарушению рисунка.
  4. Инкубировать 10-30 мин до полного высыхания полимера MPC.
  5. Поместите штампы в контакт с крышками пластины для культивовки со стеклянным дном или 35-миллиметровой тарелки для визуализации с полимерным чехловым слипом и наденьте вес (например, батарею ААА) на штамп в течение 10 минут.
  6. Снимите вес и штампы. Затем подтвердите, что рисунок был передан под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Штампованные тарелки/посуда могут храниться до 1 недели при комнатной температуре.
  7. Дважды вымойте штампованные колодцы/посуду PBS.
  8. Разбавить LN511-E8 PBS при 2-4 мкг/мл и покрыть блюдо LN511-E8 при 0,5-1мкг/см2. Для человека PSC-CMs разбавьте LN511-E8 0,1% раствором желатина вместо PBS. Затем инкубируют не менее 1 ч (оптимально, более 4 ч).
  9. Пластинчатые ячейки, как описано в предыдущих разделах.

7. Покадровая визуализация саркомер под флуоресцентным микроскопом

  1. Включите и подключите микроскоп, связанный компьютер, а также все необходимые периферийные устройства.
  2. Для выполнения покадровой съемки захватывайте покадровые изображения с наибольшим увеличением (объектив 100X с масляным выступом).
  3. Выберите условия визуализации в реальном времени. Чтобы получить хорошие репрезентативные данные, попробуйте настроиться на самую высокую частоту кадров (рекомендуется минимум 20 мс или 50 кадров в секунду). Установите затвор открытым и примените необходимое биннинг (4 X 4) и обрезку области сбора для достижения кратчайших интервалов между изображениями во время покадрового изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка может варьироваться в зависимости от конфигурации микроскопов. Камера должна быть высокочувствительной и способна передавать данные на подключенный ПК достаточно быстро. Для этого мы использовали вспышку ORCA с Camera-link. Мы протестировали вращающуюся конфокальную микроскопию и получили изображения со скоростью 400 кадров в секунду.
    1. [Необязательно] Если скорость биения клеток низкая, вызвате клетки стимуляцией электрического поля.
  4. Запуск покадровой записи
    1. Убедитесь, что изображенные поля остаются в фокусе во время записи покадрового изображения.
    2. Сохраните покадровые изображения в соответствующую папку.

8. Анализ покадровой съемки с помощью плагина ImageJ/Fiji SarcOptiM

  1. Загрузите серию покадровых изображений в ImageJ. Для формата Olympus VSI открывайте файлы с помощью плагина OlympusViewer.
  2. Отрегулируйте яркость и контрастность изображения, чтобы четко наблюдать саркомерную картину (Image | Отрегулируйте | Яркость/Контрастность).
  3. Откройте SarcOptiM, щелкнув меню Дополнительные инструменты (>>) и выбрав SarcOptiM.
  4. Откалибруйте программу, нажав Ctrl + Shift + P и кнопку 1 мкм на панели инструментов и следуя инструкциям диалоговых окон.
  5. Провести линию через область саркомера, которая будет использоваться для измерения укорочения саркомера.
  6. Начните анализ сокращения саркомера, нажав SingleCell (AVI) на панели инструментов. Репрезентативные данные показаны на рисунках 1 и 2.

Результаты

Измерение укорочения саркомера с помощью выбивающихся репортерных линий PSC-CMs. Меченые саркомером PSC-CMs использовались для измерения укорочения саркомера. Линии выражают Myom2-RFP и ACTN2-mCherry из эндогенных локусов. TagRFP был вставлен в Myom2,кодируя M-белки, которые ?...

Обсуждение

PSC-CMs имеют большой потенциал для использования в качестве платформы in vitro для моделирования сердечных заболеваний и тестирования эффектов лекарств. Тем не менее, сначала необходимо разработать точный, унифицированный метод оценки функций PSC-CMs. Большинство функциональных тестов р...

Раскрытие информации

H.U. подал патент, связанный с этой рукописью.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории в отделе регенеративной медицины Медицинского университета Джичи за полезную дискуссию и техническую помощь. Это исследование было поддержано грантами Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED; JP18bm0704012 и JP20bm0804018), Японское общество содействия развитию науки (JSPS; JP19KK0219) и Японское общество циркуляции (грант на фундаментальные исследования) для H.U.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)		Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.A.We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonase (25 U/µL)Merck Millipore70746
Blasticidin S HydrochlorideFujifilm wako029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.314-BP-010
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
CAD drawing software,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Chromium etchantNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JapanN14B
Chromium mask coated with AZP1350Clean Surface Technology Co., JapanCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))Takara9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvateSigma-AldrichD5796
Ethanol (99.5)Fujifilm wako057-00456
Fetal Bovine SerumMoregate59301104
FGF-10, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinantFujifilm wako060-04543
Gelatin from porcine skin powderSigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
GLASS BOTTOM culture platesMatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium SaltFujifilm wako196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Mask alignerUnion Optical Co., Ltd., JapanPEM-800
Maskless lithography toolNanoSystem Solutions, Inc., JapanD-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.A.Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Petri dishSansei medical co. Ltd01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomerDow Corning Corp., MI, USASILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)Polyscience24765-1
Positive photoresist developerTokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., JapanNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Proteinase KTakara9034
Puromycin DihydrochlorideFujifilm wako166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A ProteinR&D Systems, Inc.338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)Thermo Fisher Scientific12604-039
RPMI1640 MediumThermo Fisher Scientific11875-119
Silicon waferMatsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., JapanN.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher Scientific11360-070
Spin-coaterMikasa Co., Ltd., JapanMS-A100
Spininng confocal microscopyOxford InstrumentsAndor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)Fujifilm wako195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8 developerKayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 developer
Tris-EDTANippon Gene314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinantFujifilm wako226-01781

Ссылки

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
  22. Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
  25. Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены