Саркомерное укорочение кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, с использованием флуоресцентно-помеченных саркомерных белков.

Резюме

Этот метод может быть использован для исследования укорочения саркомера с использованием плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, с флуоресцентными белками саркомера.

Аннотация

Плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (PSC-CMs), могут быть получены как из эмбриональных, так и из индуцированных плюрипотентных стволовых (ES / iPS) клеток. Эти клетки являются перспективными источниками для моделирования сердечных заболеваний. Для кардиомиопатий укорочение саркомера является одной из стандартных физиологических оценок, которые используются со взрослыми кардиомиоцитами для изучения фенотипов их заболевания. Однако имеющиеся методы не подходят для оценки сократимости PSC-CMs, так как эти клетки имеют недостаточно развитые саркомеры, которые невидимы при фазово-контрастной микроскопии. Для решения этой проблемы и выполнения укорочения саркомера с помощью PSC-CMs использовались флуоресцентные помеченные белки саркомера и флуоресцентная живая визуализация. Тонкие Z-линии и М-линия находятся на обоих концах и в центре саркомера соответственно. Белки Z-линии — α-актинин (ACTN2), телетонин (TCAP) и актин-ассоциированный белок LIM (PDLIM3) — и один белок M-линии — Myomesin-2 (Myom2) — были помечены флуоресцентными белками. Эти помеченные белки могут быть экспрессированы из эндогенных аллелей в виде нокаутов или из аденоассоциированных вирусов (AAV). Здесь мы представляем методы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека к кардиомиоцитам, для производства AAV, а также для выполнения и анализа живой визуализации. Описаны также методы получения полидиметилсилоксановых (PDMS) штампов для узорчатой культуры PSC-CMs, что облегчает анализ укорочения саркомера флуоресцентно-помеченными белками. Для оценки укорочения саркомера были записаны покадровые изображения бьющихся клеток с высокой частотой кадров (50-100 кадров в секунду) при электрической стимуляции (0,5-1 Гц). Для анализа длины саркомера в ходе сокращения клеток записанные покадровые изображения были подвергнуты SarcOptiM, плагину для ImageJ / Fiji. Наша стратегия предоставляет простую платформу для исследования фенотипов сердечных заболеваний в PSC-CMs.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности во всем мире^1, а кардиомиопатия представляет собой третью причину смертности, связанной с сердцем^2. Кардиомиопатия – это коллективная группа заболеваний, поражающих сердечную мышцу. Последние разработки индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток и направленная дифференцировка iPS-клеток в сторону кардиомиоцитов (PSC-CMs) открыли двери для изучения кардиомиоцитов с геномом пациента в качестве модели кардиомиопатии in vitro. Эти клетки могут быть использованы для понимания патофизиологии сердечных заболеваний, для выяснения их молекуля....

протокол

1. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток мышей

1. Обслуживание ES ячеек мыши
   1. Поддерживающая среда: Смешайте 50 мл фетальной бычий сыворотки (FBS), 5 мл L-аланин-L-глутамина, 5 мл незамененной аминокислоты (NEAA), 5 мл 100 мМ пирувата натрия и 909 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанола с 450 мл минимальной незаменимой среды Глазго (GMEM). Дополняйте фактор ингибирования лейкемии (LIF), CHIR-99021 и PD0325901 в конечной концентрации 1000 Ед/мл, 1 мкМ и 3 мкМ соответственно. Стерилизуйте среду через фильтр 0,22 мкм.
   2. Среда FBS: смешайте 55 мл FBS, 5,5 мл L-аланина-L-глутамина, 5,5 мл пирувата натрия и 5,5 мл NEAA до 500 мл высокой глюкозы Dulbecco....

Результаты

Измерение укорочения саркомера с помощью выбивающихся репортерных линий PSC-CMs. Меченые саркомером PSC-CMs использовались для измерения укорочения саркомера. Линии выражают Myom2-RFP и ACTN2-mCherry из эндогенных локусов. TagRFP был вставлен в Myom2,кодируя M-белки, которые ?.......

Обсуждение

PSC-CMs имеют большой потенциал для использования в качестве платформы in vitro для моделирования сердечных заболеваний и тестирования эффектов лекарств. Тем не менее, сначала необходимо разработать точный, унифицированный метод оценки функций PSC-CMs. Большинство функциональных тестов р.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)	Thermo Fisher Scientific	21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,	NOF Corp.	LIPIDURE-CM5206
2-Propanol	Fujifilm wako	166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)	ibidi	81156
AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)	Takara	6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs	N.A.		We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504-044
B-27 Supplement, minus insulin	Thermo Fisher Scientific	A18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin A	Thermo Fisher Scientific	12587-010
Benzonase (25 U/µL)	Merck Millipore	70746
Blasticidin S Hydrochloride	Fujifilm wako	029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,	R&D Systems, Inc.	314-BP-010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)	abcam	ab142216
CAD drawing software,	Robert McNeel and Associates, WA, USA	Rhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20	Sartorius	VS2042
CHIR99021	Cayman	13122
Chromium etchant	Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan	N14B
Chromium mask coated with AZP1350	Clean Surface Technology Co., Japan	CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))	Takara	9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	D5796
Ethanol (99.5)	Fujifilm wako	057-00456
Fetal Bovine Serum	Moregate	59301104
FGF-10, Human, Recombinant,	R&D Systems, Inc.	345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant	Fujifilm wako	060-04543
Gelatin from porcine skin powder	Sigma-Aldrich	G1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)	Sigma-Aldrich	G5154-500
GLASS BOTTOM culture plates	MatTek	P24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12	Thermo Fisher Scientific	11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)	Thermo Fisher Scientific	35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt	Fujifilm wako	196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)	Nippi	892012
Mask aligner	Union Optical Co., Ltd., Japan	PEM-800
Maskless lithography tool	NanoSystem Solutions, Inc., Japan	D-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Thermo Fisher Scientific	11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)	Merck Millipore	SLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)	N.A.		Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)	Thermo Fisher Scientific	17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera	Hamamatsu	C13440-20CU
PD0325901	Stemgent	04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Petri dish	Sansei medical co. Ltd	01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)	Nippon Gene	311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer	Dow Corning Corp., MI, USA	SILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)	Polyscience	24765-1
Positive photoresist developer	Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan	NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
Proteinase K	Takara	9034
Puromycin Dihydrochloride	Fujifilm wako	166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein	R&D Systems, Inc.	338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)	Thermo Fisher Scientific	12604-039
RPMI1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875-119
Silicon wafer	Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan	N.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360-070
Spin-coater	Mikasa Co., Ltd., Japan	MS-A100
Spininng confocal microscopy	Oxford Instruments	Andor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)	Fujifilm wako	195-16053
SU-8 3010	Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA	SU-8 3010
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA	SU-8 developer
Tris-EDTA	Nippon Gene	314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant	Fujifilm wako	226-01781