Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод может быть использован для исследования укорочения саркомера с использованием плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, с флуоресцентными белками саркомера.

Аннотация

Плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (PSC-CMs), могут быть получены как из эмбриональных, так и из индуцированных плюрипотентных стволовых (ES / iPS) клеток. Эти клетки являются перспективными источниками для моделирования сердечных заболеваний. Для кардиомиопатий укорочение саркомера является одной из стандартных физиологических оценок, которые используются со взрослыми кардиомиоцитами для изучения фенотипов их заболевания. Однако имеющиеся методы не подходят для оценки сократимости PSC-CMs, так как эти клетки имеют недостаточно развитые саркомеры, которые невидимы при фазово-контрастной микроскопии. Для решения этой проблемы и выполнения укорочения саркомера с помощью PSC-CMs использовались флуоресцентные помеченные белки саркомера и флуоресцентная живая визуализация. Тонкие Z-линии и М-линия находятся на обоих концах и в центре саркомера соответственно. Белки Z-линии — α-актинин (ACTN2), телетонин (TCAP) и актин-ассоциированный белок LIM (PDLIM3) и один белок M-линии Myomesin-2 (Myom2) были помечены флуоресцентными белками. Эти помеченные белки могут быть экспрессированы из эндогенных аллелей в виде нокаутов или из аденоассоциированных вирусов (AAV). Здесь мы представляем методы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека к кардиомиоцитам, для производства AAV, а также для выполнения и анализа живой визуализации. Описаны также методы получения полидиметилсилоксановых (PDMS) штампов для узорчатой культуры PSC-CMs, что облегчает анализ укорочения саркомера флуоресцентно-помеченными белками. Для оценки укорочения саркомера были записаны покадровые изображения бьющихся клеток с высокой частотой кадров (50-100 кадров в секунду) при электрической стимуляции (0,5-1 Гц). Для анализа длины саркомера в ходе сокращения клеток записанные покадровые изображения были подвергнуты SarcOptiM, плагину для ImageJ / Fiji. Наша стратегия предоставляет простую платформу для исследования фенотипов сердечных заболеваний в PSC-CMs.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности во всем мире1, а кардиомиопатия представляет собой третью причину смертности, связанной с сердцем2. Кардиомиопатия – это коллективная группа заболеваний, поражающих сердечную мышцу. Последние разработки индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток и направленная дифференцировка iPS-клеток в сторону кардиомиоцитов (PSC-CMs) открыли двери для изучения кардиомиоцитов с геномом пациента в качестве модели кардиомиопатии in vitro. Эти клетки могут быть использованы для понимания патофизиологии сердечных заболеваний, для выяснения их молекуля....

протокол

1. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток мышей

  1. Обслуживание ES ячеек мыши
    1. Поддерживающая среда: Смешайте 50 мл фетальной бычий сыворотки (FBS), 5 мл L-аланин-L-глутамина, 5 мл незамененной аминокислоты (NEAA), 5 мл 100 мМ пирувата натрия и 909 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанола с 450 мл минимальной незаменимой среды Глазго (GMEM). Дополняйте фактор ингибирования лейкемии (LIF), CHIR-99021 и PD0325901 в конечной концентрации 1000 Ед/мл, 1 мкМ и 3 мкМ соответственно. Стерилизуйте среду через фильтр 0,22 мкм.
    2. Среда FBS: смешайте 55 мл FBS, 5,5 мл L-аланина-L-глутамина, 5,5 мл пирувата натрия и 5,5 мл NEAA до 500 мл высокой глюкозы Dulbecco....

Результаты

Измерение укорочения саркомера с помощью выбивающихся репортерных линий PSC-CMs. Меченые саркомером PSC-CMs использовались для измерения укорочения саркомера. Линии выражают Myom2-RFP и ACTN2-mCherry из эндогенных локусов. TagRFP был вставлен в Myom2,кодируя M-белки, которые ?.......

Обсуждение

PSC-CMs имеют большой потенциал для использования в качестве платформы in vitro для моделирования сердечных заболеваний и тестирования эффектов лекарств. Тем не менее, сначала необходимо разработать точный, унифицированный метод оценки функций PSC-CMs. Большинство функциональных тестов р.......

Раскрытие информации

H.U. подал патент, связанный с этой рукописью.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории в отделе регенеративной медицины Медицинского университета Джичи за полезную дискуссию и техническую помощь. Это исследование было поддержано грантами Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED; JP18bm0704012 и JP20bm0804018), Японское общество содействия развитию науки (JSPS; JP19KK0219) и Японское общество циркуляции (грант на фундаментальные исследования) для H.U.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1-ThioglycerolSigma-AldrichM6145-25
2-Mercaptoethanol (55mM)Thermo Fisher Scientific21985-023
2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer,NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-PropanolFujifilm wako166-04836
35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high)ibidi81156
AAVproR Helper Free System (AAV6)
(vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector)
Takara6651
ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCsN.A.We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press)
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504-044
B-27 Supplement, minus insulinThermo Fisher ScientificA18956-01
B27 supplement (50X), minus Vitamin AThermo Fisher Scientific12587-010
Benzonase (25 U/µL)Merck Millipore70746
Blasticidin S HydrochlorideFujifilm wako029-18701
BMP-4, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.314-BP-010
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503-100g
C59, Wnt Antagonist (WntC59)abcamab142216
CAD drawing software,Robert McNeel and Associates, WA, USARhinoceros 6.0
Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20SartoriusVS2042
CHIR99021Cayman13122
Chromium etchantNihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., JapanN14B
Chromium mask coated with AZP1350Clean Surface Technology Co., JapanCBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2))Takara9094
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucoseSigma-AldrichD6429-500
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) - high glucose, without sodium pyruvateSigma-AldrichD5796
Ethanol (99.5)Fujifilm wako057-00456
Fetal Bovine SerumMoregate59301104
FGF-10, Human, Recombinant,R&D Systems, Inc.345-FG-025
Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinantFujifilm wako060-04543
Gelatin from porcine skin powderSigma-AldrichG1890-100g
Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM)Sigma-AldrichG5154-500
GLASS BOTTOM culture platesMatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)Thermo Fisher Scientific12440-061
L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM)Thermo Fisher Scientific35050-061
L(+)-Ascorbic Acid Sodium SaltFujifilm wako196-01252
Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511)Nippi892012
Mask alignerUnion Optical Co., Ltd., JapanPEM-800
Maskless lithography toolNanoSystem Solutions, Inc., JapanD-Light DL-1000
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter)Merck MilliporeSLHVR33RS
Myom2-RFP (SMM18)N.A.Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020)
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS cameraHamamatsuC13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Petri dishSansei medical co. Ltd01-004
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomerDow Corning Corp., MI, USASILPOT 184
polyethylenimine MAX (MW. 40,000)Polyscience24765-1
Positive photoresist developerTokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., JapanNMD-3
PowerUp SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742
Proteinase KTakara9034
Puromycin DihydrochlorideFujifilm wako166-23153
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A ProteinR&D Systems, Inc.338-AC-050
Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express)Thermo Fisher Scientific12604-039
RPMI1640 MediumThermo Fisher Scientific11875-119
Silicon waferMatsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., JapanN.A.
Sodium Pyruvate (100 mM)Thermo Fisher Scientific11360-070
Spin-coaterMikasa Co., Ltd., JapanMS-A100
Spininng confocal microscopyOxford InstrumentsAndor Dragonfly Spinning Disk System
StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U)Fujifilm wako195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 3010
SU-8 developerKayaku Advanced Materials, Inc., MA, USASU-8 developer
Tris-EDTANippon Gene314-90021
Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinantFujifilm wako226-01781

Ссылки

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены