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Resumen

Aquí se describen los métodos utilizados para estudiar el efecto funcional de las mutaciones RYR1 expresadas endógenamente en los linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y las células satélite derivadas de biopsia muscular diferenciadas en miotubos.

Resumen

Se han identificado más de 700 variantes en el gen RYR1 en pacientes con diferentes trastornos neuromusculares incluyendo susceptibilidad a hipertermias malignas, miopatías centrales y miopatía centronuclear. Debido a los diversos fenotipos vinculados a las mutaciones RYR1 es fundamental caracterizar sus efectos funcionales para clasificar las variantes que portan los pacientes para futuras intervenciones terapéuticas e identificar variantes no patógenas. Muchos laboratorios se han interesado en desarrollar métodos para caracterizar funcionalmente las mutaciones RYR1 expresadas en las células de los pacientes. Este enfoque tiene numerosas ventajas, que incluyen: las mutaciones se expresan endógenamente, RyR1 no se sobreexpresa, se evita el uso de células heterólogas que expresan RyR1. Sin embargo, dado que los pacientes pueden presentar mutaciones en diferentes genes aparte de RYR1, es importante comparar los resultados del material biológico de individuos que albergan la misma mutación, con diferentes antecedentes genéticos. El presente manuscrito describe métodos desarrollados para estudiar los efectos funcionales de las variantes RYR1 expresadas endógenamente en: (a) linfocitos B humanos inmortalizados por el virus de Epstein Barr y (b) células satélite derivadas de biopsias musculares y diferenciadas en miotubos. Luego se monitorean los cambios en la concentración intracelular de calcio desencadenados por la adición de un activador farmacológico de RyR1. El tipo de célula seleccionado está cargado con un indicador de calcio fluorescente ratiométrico y los cambios intracelulares [Ca2+] se monitorean a nivel de una sola célula mediante microscopía de fluorescencia o en poblaciones celulares utilizando un espectrofluorómetro. Las curvas de respuesta a dosis agonistas en reposo [Ca2+],se comparan entre las células de los controles sanos y los pacientes que albergan variantes de RYR1, lo que lleva a una idea del efecto funcional de una variante dada.

Introducción

Hasta la fecha, se han identificado más de 700 variantes de RYR1 en la población humana y se han relacionado con diversos trastornos neuromusculares, incluida la susceptibilidad a la hipertermia maligna (MHS), la rabdomiólisis inducida por el ejercicio, la enfermedad del núcleo central (CCD), la enfermedad multi-minicore (MmD), la miopatía centronuclear (CNM)1,2,3 ; sin embargo, los estudios para caracterizar sus efectos funcionales están rezagados y solo aproximadamente el 10% de las mutaciones se han probado funcionalmente. Se pueden utilizar diferentes enfoques experimentales para evaluar el impacto de una variante RyR1 dada, incluida la transfección de células heterólogas como las células HEK293 y COS-7 con plásmido que codifica para el WT y el mutante RYR1 cDNA4,5, transducción de fibroblastos de ratón dispédicos con plásmidos y vectores que codifican para el WT y mutante RYR1 cDNA, seguido de transducción con myo-D y diferenciación en miotubos6 , generación de modelos animales transgénicos portadores de mutantes RyR1s7,8,9, caracterización de células de pacientes que expresan la variante RYR1 endógenamente10,11,12. Tales métodos han ayudado a establecer cómo las diferentes mutaciones afectan funcionalmente el canal RyR1 Ca2+.

Aquí, se describen los métodos desarrollados para evaluar los efectos funcionales de las mutaciones de RYR1. Se investigan varios parámetros de la homeostasis del calcio intracelular en células humanas que expresan endógenamente el canal de calcio RyR1, incluidos los miotubos y los linfocitos B inmortalizados por el virus de Epstein Barr (VEB). Las células se obtienen de los pacientes, se expanden en cultivo y se cargan con indicadores de calcio fluorescentes ratiométricos como Fura-2 o indo-1. Los parámetros que se ha informado que están alterados debido a mutaciones patógenas de RYR1, incluido el reposo [Ca2+],la sensibilidad a diferentes agonistas farmacológicos y el tamaño de las reservas intracelulares de Ca2+ se miden a nivel de una sola célula, utilizando microscopía de fluorescencia, o en poblaciones celulares utilizando un fluorímetro. Los resultados obtenidos en células de portadores de mutaciones se comparan con los obtenidos de miembros sanos de la familia de control. Este enfoque ha demostrado que: (i) muchas mutaciones relacionadas con MHS conducen a un aumento en el reposo [Ca2+] y un desplazamiento hacia la izquierda en la curva de dosis-respuesta a la despolarización inducida por KCl o a la activación farmacológica de RyR1 con 4-cloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) las mutaciones relacionadas con CCD conducen a una disminución en el pico [Ca2+] liberado por activación farmacológica del RyR1 y a una disminución del tamaño si el Ca2+ intracelular almacena12,13,14,15; (iii) algunas variantes no afectan a la homeostasis de Ca2+13. Las ventajas de este enfoque experimental son: la proteína RyR1 no está sobreexpresada y los niveles fisiológicos están presentes, las células pueden ser inmortalizadas (tanto las células musculares como los linfocitos B) proporcionando líneas celulares que contienen mutaciones. Algunas desventajas se relacionan con el hecho de que los pacientes pueden portar mutaciones en más de un gen que codifica proteínas involucradas en la homeostasis del calcio y / o el acoplamiento de contracción de excitación (ECC) y esto puede complicar las conclusiones experimentales. Por ejemplo, se identificaron dos variantes de JP-45 en la población MHS y control y se demostró que su presencia impacta la sensibilidad del receptor de dihidropiridina (DHPR) a la activación16. Los pacientes deben estar disponibles, el material biológico debe ser recién recolectado y los permisos éticos deben obtenerse de las juntas éticas locales.

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Protocolo

Los protocolos que se describen a continuación cumplen con las directrices éticas de la Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Preparación de las líneas celulares de linfocitos B inmortalizadas de Epstein Barr11

  1. Después del consentimiento informado, recolecte 30 ml de sangre total en tubos estériles tratados con EDTA de la probanda portadora de una mutación RYR1 y de miembros sanos de la familia sin mutación.
    NOTA: Mantenga todas las soluciones estériles y trabaje en una campana de cultivo de tejidos.
  2. Aislar células mononucleares de sangre total por medio de centrifugación de gradiente de densidad (por ejemplo, Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
    1. Coloque 30 ml de sangre estéril en un tubo estéril cónico de 50 ml.
    2. Coloque la punta de una pipeta Pasteur que contenga el medio de centrifugación de gradiente de densidad en la parte inferior del tubo y la capa 20 ml estéril de solución de medios de centrifugación de gradiente de densidad lentamente debajo de la sangre.
    3. Centrifugar durante 30 min a 900 x g a 18°-20°C, sin rotura.
      NOTA: La capa de células mononucleares aparece como un anillo turbio en la interfase entre la capa de medios de centrifugación de gradiente de densidad y la capa superior que contiene plasma enriquecido con plaquetas.
  3. Con una pipeta estéril, retire suavemente la capa interfase que contiene células mononucleares (aproximadamente 3-5 ml) y transfiera la solución a un tubo cónico estéril limpio de 50 ml.
  4. Agregue 20 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) para enjuagar las células, centrífuga durante 10 min a 600 x g a temperatura ambiente y resuspender el pellet en PBS. Repetir por un total de tres veces; esto garantiza que se eliminen todos los medios.
  5. Después del último lavado, resuspenda las células en 1-2 ml de medio de cultivo de tejidos (medio RPMI suplementado con suero fetal de ternero al 10%, 2 mM de L-glutamina y 100 unidades de penicilina y estreptomicina). Coloque las células mononucleares (aproximadamente 1 x 106 células) en un matraz de cultivo de tejidos T125 que contenga 20 ml de medio de cultivo de tejidos.
  6. Infectar células mononucleares con el virus de Epstein-Barr.
    1. Utilizar sobrenadantes de cultivos de líneas celulares B95.8 (que contengan10 2-10 3 unidades transformadoras/ml almacenados a -80 °C) como fuente de VEB.
    2. Resuspendir 1 x 106 células mononucleares del paso 1.5 en 20 mL de medio de cultivo tisular y exponerlas a 2 mL de sobrenadante de la línea celular B95.8 en presencia de ciclosporina A (concentración final de 0.2 μg/mL) para la infección.
  7. Coloque el matraz en una incubadora de cultivo celular a 37 °C y permita que las células crezcan. Después de una semana cambiar el medio de cultivo.
    NOTA: Una vez que las células B comienzan a proliferar, forman grupos reconocibles y crecen rápidamente para que los cultivos puedan expandirse y congelarse.
  8. Extraer el ADN genómico de las líneas celulares de linfocitos B inmortalizadas por el VEB11 para confirmar la presencia o ausencia de la mutación dada.

2. Mediciones intracelulares de Ca2+

NOTA: Los cambios en la concentración intracelular de calcio de las líneas celulares de linfocitos B transformadas por el VEB se pueden monitorear en poblaciones celulares, con un espectrofluorómetro equipado con un agitador magnético y un soporte de cubeta ajustado a 37 ° C. Alternativamente, los cambios de Ca2+ se pueden monitorear en células individuales mediante microscopía de fluorescencia. En ambos casos se extraen células del matraz de cultivo tisular, se lavan dos veces con solución de Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM glucosa, pH 7,4 que contiene 1 mM CaCl2)y se cuentan.

  1. Para experimentos en poblaciones celulares utilizando un espectrofluorómetro11,13,14
    1. Resuspend las células a una concentración final de 1 x 107 células/mL en la solución de Krebs Ringer e incubar a 37°C durante 30 min con una concentración final de 5 μM Fura-2/AM.
    2. Centrifugar las células a 900 x g durante 10 min y resuspenderlas en la solución de Krebs Ringer a una concentración de 2 x 106 células/ml.
    3. Mida los cambios de fluorescencia (relación 340/380 nm) utilizando un espectrofluorómetro equipado con un agitador magnético ajustado a velocidad máxima y ajustado a 37 °C.
    4. Justo antes del experimento girar las células a 900 x g durante 5 min en una microcentrífuga y resuspendir rápidamente el pellet en 1,5 mL de la solución de Krebs Ringer con 0,5 mM de EGTA pero sin Ca2+añadido.
    5. Coloque las células en una cubeta de espectrofluorómetro de vidrio de 3 ml y registre la relación de fluorescencia (excitación de 340 nm / 380 nm, emisión de 510 nm).
    6. Lograr una línea base estable (aproximadamente 30 segundos), agregar la concentración seleccionada de agonista RyR1 (4-cloro-m-cresol, o 4-cmc) y registrar el transitorio de calcio.
      NOTA: Se utiliza una solución madre de 300 mM de 4 cmc fabricada en DMSO como reactivo de partida. Esta solución se puede hacer por adelantado, alicitar y almacenar a -20 °C durante varios meses.
    7. Realizar experimentos para diferentes concentraciones de 4 cmc.
      NOTA: Incluya 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM a 1 mM para generar una curva dosis-respuesta de agonista versus cambio en [Ca2+]. Las diferentes concentraciones de 4 cmc se obtienen añadiendo el volumen apropiado de 4 cmc de la solución madre, directamente en la cubeta que contiene las celdas cargadas con Fura-2. Por ejemplo, para una concentración final de 300 μM 4-cmc, se agregan 1,5 μL de la solución madre a la cubeta que contiene 1,5 ml de células en la solución de Krebs Ringer. Para concentraciones agonistas más bajas, la solución madre de 300 mM debe diluirse a 75 mM con DMSO y agregarse el volumen apropiado a la cubeta que contiene 1,5 ml de células en la solución de Krebs Ringer.
    8. Agregue 400 nM de talasgargina a las células para calcular la cantidad total de Ca2+ presente en las reservas intracelulares. Registre el pico Ca2+.
    9. Trazar el pico de calcio inducido por una concentración dada de 4 cmc versus el pico de calcio inducido por la talasgargina, que se considera 100% y construir una curva de respuesta a la dosis de 4 cmc comparando las células de un pariente proband y sano
  2. Para experimentos con células individuales13
    1. Diluya la poli-L-lisina 1:10 en H2O estéril y trate previamente las cubiertas de vidrio durante 30 min. Deje secar al aire bajo una campana de cultivo de tejidos estériles.
    2. Vuelva a suspender los linfocitos B transformados en VEB a una concentración final de 1 x 106 células/ml en la solución de Krebs Ringer que contiene 1 mM de CaCl2 y agregue una concentración final de 5 μM de Fura-2/AM.
    3. Coloque 1 ml de células en los cobertores tratados con poli-L-lisina e incube a 37 °C en una incubadora de cultivo celular humidificado durante 30 minutos para permitir que las células del VEB se adhieran a la cubierta de vidrio durante la carga.
    4. Coloque el recambio en la cámara de perfusión e inicie la perfusión (a razón de 2 ml/min) con la solución de Krebs Ringer que contiene 1 mM Ca2+.
    5. Utilice un microscopio fluorescente invertido (equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 40x (apertura numérica de 0,17), filtros (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) para registrar mediciones en línea, con un accesorio de cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) controlado por software.
    6. Adquiera imágenes a intervalos de 1 s a un tiempo de exposición fijo (100 ms para longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm). Utilice software de imágenes para analizar los cambios en la fluorescencia. Mida el valor medio de píxeles para cada celda en longitudes de onda de excitación de 340 y 380 nm13.
    7. Para lograr la estimulación celular, use un estimulador de perfusión celular con 12 válvulas y agregue diferentes concentraciones de 4 cmc. La válvula de descarga contiene la solución de Krebs Ringer sin Ca2+ añadido más 100 μM La3+ para controlar la liberación de calcio de las reservas intracelulares solamente.
    8. Construir una curva dosis-respuesta de 4-cmc versus cambio en [Ca2+], como se describió anteriormente.

3. Preparación de miotubos humanos a partir de biopsias musculares10,12,15

NOTA: Diferentes laboratorios han utilizado diferentes métodos para obtener mioblastos y miotubos derivados de células satélite. A continuación se muestra la descripción del método utilizado en Basilea.

  1. Enjuague la biopsia muscular con PBS estéril para eliminar el exceso de sangre y cortar en pequeños fragmentos de aproximadamente 0.5-1 mm.
  2. Prepare 6 platos de cultivo de tejidos bien con inserto. Agregue 1.5 ml de medio de crecimiento muscular humano a cada pozo y 0.5 ml de medio de crecimiento muscular humano a cada inserto.
    NOTA: El medio de crecimiento se compone de la siguiente manera: 500 ml del medio eagle modificado de Dulbecco con glucosa alta, o DMEM (4,5 mg / ml), que contiene 10% de suero de caballo, 5 ng / ml de insulina, 3 mM de glutamina, 600 ng / ml de penicilina G y estreptomicina, y 7 mM HEPES, pH 7.4. También se puede utilizar el medio de crecimiento del músculo esquelético disponible comercialmente.
  3. Coloque 2-3 pequeños fragmentos musculares en cada inserto(Figura 1A)y coloque los platos de cultivo en la incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 ° C). Después de aproximadamente 8-10 días, se pueden ver células satélite creciendo fuera y alrededor de la biopsia muscular, unidas al inserto(Figura 1,B y C, flechas).
  4. Libere un número suficiente de células de la biopsia (después de aproximadamente 10-14 días), tripsinique de la siguiente manera:
    1. Retire todo el medio de cultivo, enjuague las células una vez con 1 ml de PBS, agregue 0,5 ml de solución de tripsina/EDTA (0,025% de tripsina y 0,01% de EDTA) e incube a 37 °C durante 5 min.
    2. Agregue 1 ml de medio de crecimiento a las células para neutralizar el efecto de la tripsina y transferir las células satélite a un nuevo matraz de cultivo de células T25; añadir 3 ml de medio de crecimiento y colocar las células en una incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 °C).
    3. Cambie el medio de crecimiento al día siguiente para eliminar el EDTA y posteriormente cambie el medio una vez por semana.
  5. Cuando los mioblastos son aproximadamente 75% confluentes, tripsinícelos y transfiéralos a una cubierta de vidrio tratada con laminina.
    NOTA: Como proporción, las células que crecen en un matraz T25 deben transferirse a una cubierta de vidrio tratada con laminina de 43 mm de diámetro. La cubierta de vidrio debe colocarse dentro de una placa de cultivo de tejidos de 60 mm de diámetro que contenga 3 ml de medio de crecimiento.
  6. Cultive células en la cubierta de vidrio en medio de crecimiento en una incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 ° C) cambiando el medio una vez por semana. Al 90% de confluencia, cambie al medio de diferenciación compuesto de la siguiente manera: DMEM de glucosa alta (4,5 mg / ml), albúmina sérica bovina al 0,5%, factor de crecimiento epidérmico de 10 ng / ml, creatina de 0,15 mg / ml, insulina de 5 ng / ml, glutamina de 200 mM, penicilina G y estreptomicina 600 ng / ml, y 7 mM HEPES, pH 7.4). También se puede utilizar un medio de diferenciación disponible comercialmente. Cambie el medio de diferenciación una vez por semana.
  7. Después de 7-10 días en medio de diferenciación, los miotubos multinucleados son visibles. Evalúe los cambios en [Ca2+] dentro de una semana, como se describe a continuación.

4. [Ca2+]i medidas de relación determinadas con Fura-2

  1. Cargue miotubos cultivados con virutas de vidrio con Fura-2/AM (concentración final de 5 μM) diluidos en DMEM durante 30 min a 37 °C. Brevemente, retire el medio de diferenciación de las células cultivadas con cubierta de vidrio y agregue 2 ml de medio de diferenciación fresco. Añadir 10 μL de Fura-2 AM a partir de una solución madre de 1 mM e incubar 30 min en una incubadora de cultivo celular (5% CO2, 37 °C).
  2. Transfiera la tapa de vidrio a la cámara de perfusión y enjuague las células con la solución de Krebs Ringer que contiene 2 mM CaCl2.
  3. Realice mediciones en línea [Ca2+] como se describió anteriormente en la sección de celda única del VEB con el uso de un objetivo FLUAR de inmersión en agua de 20x (apertura numérica de 0.17).

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Resultados

[Ca2+]i mediciones en poblaciones de linfocitos B inmortalizados por el VEB
Los linfocitos B primarios expresan la isoforma RyR1 que funciona como un canal de liberación de Ca2+ durante los procesos de señalización estimulados por el receptor de antígeno de células B17. La inmortalización de células B con VEB, un procedimiento utilizado rutinariamente por los genetistas ...

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Discusión

Los protocolos descritos en este artículo han sido utilizados con éxito por varios laboratorios para estudiar el impacto de las mutaciones RYR1 en la homeostasis del calcio. Los pasos críticos de los enfoques descritos en este documento se refieren a la esterilidad, las habilidades y técnicas de cultivo celular y la disponibilidad de material biológico. En principio, el uso de linfocitos B inmortalizados por EBV es más simple y permite generar líneas celulares que contienen canales RyR1 mutantes. Las células se p...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias (SNF) y la Fundación Suiza del Músculo.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-m-cresolFluka24940
Blood collection tubesSarstedt172202
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906
caffeineMerk102584
Cascade 125+ CCD cameraPhotometrics
Cascade 128+ CCDPhotometrics
CreatineSigma-AldrichC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-AldrichE9644
Ficoll PaqueCytiva17144002
Foetal calf serumThermoFisher Scientific26140079
Fura-2/AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
Horse serumThermo Fisher Scientific16050122
InsulinThermoFisher ScientificA11382II
IonomycinSigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
LamininThermoFisher Scientific23017015
LanthanumFluka61490
Microperfusion systemALA-ScientificDAD VM 12 valve manifold
Origin SoftwareOriginLab CorpSoftware
Pennicillin/StreptomycinGibco Life Sciences15140-122
Perfusion chamber POC-RPecon000000-1116-079
poly-L-lysineSigma-AldrichP8920
RPMIThermoFisher Scientific21875091
SpectrofluorimeterPerkin ElmerLS50
ThapsigarginCalbiochem586005
Tissue culture dishesFalcon353046
Tissue culture flaskFalcon353107
Tissue culture insertsFalcon353090
Trypsin/EDTA solutionThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHSoftware
Zeiss Axiovert S100 TV microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss glass coverslipsCarl Zeiss AG0727-016

Referencias

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