Funktionelle Charakterisierung endogen exprimierter humaner RYR1-Varianten

Zusammenfassung

Hier werden Methoden zur Untersuchung der funktionellen Wirkung von RYR1-Mutationen beschrieben, die endogen in immortalisierten menschlichen B-Lymphozyten und muskelbiopsiebasierten Satellitenzellen exprimiert werden, die in Myotuben differenziert sind.

Zusammenfassung

Mehr als 700 Varianten des RYR1-Gens wurden bei Patienten mit verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen identifiziert, darunter maligne Hyperthermie-Anfälligkeit, Kernmyopathien und zentronukleäre Myopathie. Aufgrund der vielfältigen Phänotypen, die mit RYR1-Mutationen verbunden sind, ist es von grundlegender Bedeutung, ihre funktionellen Wirkungen zu charakterisieren, um Varianten, die von Patienten getragen werden, für zukünftige therapeutische Interventionen zu klassifizieren und nicht-pathogene Varianten zu identifizieren. Viele Labore waren daran interessiert, Methoden zur funktionellen Charakterisierung von RYR1-Mutationen zu entwickeln, die in Patientenzellen exprimiert werden. Dieser Ansatz hat zahlreiche Vorteile, darunter: Mutationen werden endogen exprimiert, RyR1 ist nicht überexprimiert, die Verwendung von heterologen RyR1-exprimierenden Zellen wird vermieden. Da Patienten jedoch neben RYR1 Mutationen in verschiedenen Genen aufweisen können, ist es wichtig, Die Ergebnisse aus biologischem Material von Individuen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zu vergleichen. Das vorliegende Manuskript beschreibt Methoden, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte endogen exprimierter RYR1-Varianten zu untersuchen: (a) Epstein-Barr-Virus immortalisierte menschliche B-Lymphozyten und (b) Satellitenzellen, die aus Muskelbiopsien gewonnen und in Myotuben differenziert wurden. Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration, die durch die Zugabe eines pharmakologischen RyR1-Aktivators ausgelöst werden, werden dann überwacht. Der ausgewählte Zelltyp wird mit einem ratiometrischen fluoreszierenden Calciumindikator beladen und intrazelluläre [Ca^2+]Veränderungen werden entweder auf Einzelzellebene durch Fluoreszenzmikroskopie oder in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer überwacht. Die Ruhedosis-Wirkungskurven [Ca^2+]werden dann zwischen Zellen gesunder Kontrollen und Patienten mit RYR1-Varianten verglichen, was zu einem Einblick in die funktionelle Wirkung einer bestimmten Variante führt.

Einleitung

Bis heute wurden mehr als 700 RYR1-Varianten in der menschlichen Bevölkerung identifiziert und mit verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter maligne Hyperthermie-Suszeptibilität (MHS), belastungsinduzierte Rhabdomyolyse, zentrale Kernerkrankung (CCD), Multi-Minicore-Erkrankung (MmD), zentronukleäre Myopathie (CNM)^1,2,3 ; Dennoch hinken Studien zur Charakterisierung ihrer funktionellen Effekte hinterher und nur etwa 10% der Mutationen wurden funktionell getestet. Verschiedene experimentelle Ansätze können verwendet werden, um die Auswirkungen einer bestimmten RyR1-Variante zu bewerten, einschließlich der Transfektion von heterologen Zellen wie HEK293 und COS-7-Zellen mit Plasmid, das für die WT und die mutierte RYR1 cDNA^4kodiert,5, Transduktion von dyspedischen Mausfibroblasten mit Plasmiden und Vektoren, die für die WT und die mutierte RYR1 cDNA kodieren, gefolgt von Transduktion mit Myo-D und Differenzierung in Myotuben⁶ , Generierung transgener Tiermodelle mit mutiertem RyR1s^7,8,9, Charakterisierung von Zellen von Patienten, die die RYR1-Variante endogen exprimieren^10,11,12. Solche Methoden haben dazu beigetragen, festzustellen, wie sich verschiedene Mutationen funktionell auf den RyR1 Ca^2+-Kanal auswirken.

Hier werden Methoden beschrieben, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte von RYR1-Mutationen zu bewerten. Verschiedene Parameter der intrazellulären Calciumhomöostase werden in menschlichen Zellen untersucht, die den RyR1-Calciumkanal endogen exprimieren, einschließlich Myotuben und Epstein Barr Virus (EBV) immortalisierter B-Lymphozyten. Zellen werden von Patienten gewonnen, in Kultur expandiert und mit ratiometrisch fluoreszierenden Calciumindikatoren wie Fura-2 oder Indo-1 beladen. Parameter, von denen berichtet wurde, dass sie aufgrund pathogener RYR1-Mutationen verändert sind, einschließlich der Ruhephase [Ca^2+],der Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen pharmakologischen Agonisten und der Größe der intrazellulären Ca^2+-Speicher, werden entweder auf Einzelzellebene mittels Fluoreszenzmikroskopie oder in Zellpopulationen mit einem Fluorimeter gemessen. Ergebnisse, die in Zellen von Mutationsträgern erhalten werden, werden dann mit denen verglichen, die von gesunden Mitgliedern der Kontrollfamilie erhalten wurden. Dieser Ansatz hat gezeigt, dass: (i) viele Mutationen im Zusammenhang mit MHS zu einer Zunahme des Ruhezustands^[Ca2+]und einer Verschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve nach links entweder zur KCl-induzierten Depolarisation oder zur pharmakologischen RyR1-Aktivierung mit 4-Chlor-m-Kresol^10,11,12,13führen ; ii) Mutationen, die mit CCD in Verbindung gebracht werden, führen zu einer Abnahme des Peaks^[Ca2+],der durch pharmakologische Aktivierung des RyR1 freigesetzt wird, und zu einer Abnahme der Größe, wenn das intrazelluläre^{Ca2+ 12,13,14,15}speichert ; (iii) einige Varianten haben keinen Einfluss auf ca2+ homöostase¹³. Vorteile dieses experimentellen Ansatzes sind: Das RyR1-Protein ist nicht überexprimiert und physiologische Werte vorhanden, Zellen können verewigt werden (sowohl Muskelzellen als auch B-Lymphozyten), die Zelllinien mit Mutationen liefern. Einige Nachteile beziehen sich auf die Tatsache, dass Patienten Mutationen in mehr als einem Gen tragen können, das für Proteine kodiert, die an der Calciumhomöostase und / oder erregungskontraktionskopplung (ECC) beteiligt sind, und dies kann experimentelle Schlussfolgerungen erschweren. Zum Beispiel wurden zwei JP-45-Varianten in der MHS- und Kontrollpopulation identifiziert und es wurde gezeigt, dass ihre Anwesenheit die Empfindlichkeit des Dihydropyridinrezeptors (DHPR) gegenüber der Aktivierung^{beeinflusst 16}. Patienten müssen verfügbar sein, biologisches Material muss frisch gesammelt werden und ethische Genehmigungen müssen von den lokalen Ethikkommissionen eingeholt werden.

Protokoll

Die nachfolgend beschriebenen Protokolle entsprechen den Ethikrichtlinien der Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Herstellung von Epstein Barr immortalisierten B-Lymphozyten-Zelllinien¹¹

1. Sammeln Sie nach Einverständniserklärung 30 ml Vollblut in EDTA-behandelten sterilen Röhrchen aus dem Probanden, der eine RYR1-Mutation trägt, und von gesunden Familienmitgliedern ohne Mutation.
   HINWEIS: Halten Sie alle Lösungen steril und arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube.
2. Isolierung mononukleärer Zellen aus Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugationsmedien (z. B. Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
   1. Geben Sie 30 ml steriles Blut in ein 50 ml konisches steriles Röhrchen.
   2. Legen Sie die Spitze einer Pasteurpipette, die das Dichtegradientenzentrifugationsmedium enthält, auf den Boden des Röhrchens und schichten Sie 20 ml sterile Dichtegradientenzentrifugationsmedienlösung langsam unter das Blut.
   3. Zentrifuge für 30 min bei 900 x g bei 18°-20°C, ohne Bruch.
      HINWEIS: Die mononukleare Zellschicht erscheint als wolkiger Ring in der Interphase zwischen der Medienschicht der Dichtegradientenzentrifugation und der obersten Schicht, die plättchenangereichertes Plasma enthält.
3. Mit einer sterilen Pipette vorsichtig die Interphasenschicht mit mononukleären Zellen (ca. 3-5 ml) entfernen und die Lösung in ein sauberes 50 ml steriles konisches Röhrchen überführen.
4. 20 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) in die Spülzellen geben, 10 min bei 600 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren und das Pellet in PBS resuspenieren. Insgesamt dreimal wiederholen; Dadurch wird sichergestellt, dass alle Medien entfernt werden.
5. Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 1-2 ml Gewebekulturmedium (RPMI-Medium ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und Streptomycin). Mononukleäre Zellen (ca. 1 x 10⁶ Zellen) werden in einen T125-Gewebekulturkolben mit 20 ml Gewebekulturmedium gegeben.
6. Infizieren Sie mononukleäre Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus.
   1. Verwenden Sie Überstände aus B95.8 Zelllinienkulturen (mit 10²-10³ Transformationseinheiten/ml bei -80 °C gelagert) als EBV-Quelle.
   2. Resuspendieren Sie 1 x 10⁶ mononukleäre Zellen aus Schritt 1,5 in 20 ml Gewebekulturmedium und setzen Sie sie 2 mL Überstand aus der B95,8-Zelllinie in Gegenwart von Cyclosporin A (0,2 μg/ml Endkonzentration) zur Infektion aus.
7. Stellen Sie den Kolben in einen 37 °C Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Zellen wachsen. Nach einer Woche wechseln Sie das Kulturmedium.
   HINWEIS: Sobald sich B-Zellen zu vermehren beginnen, bilden sie erkennbare Klumpen und wachsen schnell, so dass die Kulturen erweitert und eingefroren werden können.
8. Extrahieren Sie die genomische DNA aus den EBV-immortalisierten B-Lymphozyten-Zelllinien^11, um das Vorhandensein oder Fehlen der gegebenen Mutation zu bestätigen.

2. Intrazelluläre Ca²⁺ Messungen

ANMERKUNG: Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration der EBV-transformierten B-Lymphozytenzelllinien können in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer mit Magnetrührer und Küvettenhalter auf 37 °C überwacht werden. Alternativ können^{Ca2+-Veränderungen} in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden. In beiden Fällen werden Zellen aus dem Gewebekulturkolben entnommen, zweimal mit Krebs Ringers Lösung (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 ,₂₀mM HEPES, 1 mM NaHPO₄, 5,5 mM Glucose, pH 7,4 enthaltend 1 mM_CaCl2) gewaschen und gezählt.

1. Für Experimente in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer^11,13,14
   1. Resuspendieren Sie Die Zellen in einer Endkonzentration von 1 x 10⁷ Zellen/ ml in der Lösung von Krebs Ringer und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min mit einer Endkonzentration von 5 μM Fura-2/AM.
   2. Zentrifugieren Sie Die Zellen bei 900 x g für 10 min und resuspenieren Sie sie in der Lösung von Krebs Ringer in einer Konzentration von 2 x 10⁶ Zellen/ml.
   3. Messen Sie Fluoreszenzänderungen (Verhältnis 340/380 nm) mit einem Spektrofluorometer, das mit einem Magnetrührer ausgestattet ist, der auf maximale Geschwindigkeit eingestellt und auf 37 °C eingestellt ist.
   4. Kurz vor dem Experiment spinnen Sie Zellen bei 900 x g für 5 min in einer Mikrozentrifuge und resuspendieren Sie schnell das Pellet in 1,5 ml Krebs Ringers Lösung mit 0,5 mM EGTA, aber ohne Zusatz von Ca^2+.
   5. Legen Sie die Zellen in eine 3 mL Glasspektrofluorometer-Küvette und zeichnen Sie das Fluoreszenzverhältnis (340 nm/380 nm Anregung, 510 nm Emission) auf.
   6. Erreichen Sie eine stabile Basislinie (ca. 30 Sekunden), fügen Sie die ausgewählte Konzentration des RyR1-Agonisten (4-Chlor-m-Kresol oder 4 cmc) hinzu und zeichnen Sie das transiente Kalzium auf.
      HINWEIS: Eine 300 mM Stammlösung von 4-cmc aus DMSO wird als Ausgangsreagenz verwendet. Diese Lösung kann im Voraus hergestellt, aliquoted und bei -20 °C für mehrere Monate gelagert werden.
   7. Führen Sie Experimente für verschiedene 4-cmc-Konzentrationen durch.
      HINWEIS: Schließen Sie 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM bis 1 mM ein, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve von Agonist versus Änderung in [Ca^{2+ ]}zu erzeugen. Die verschiedenen 4-cmc-Konzentrationen werden erhalten, indem das entsprechende Volumen von 4-cmc aus der Stammlösung direkt in die Küvette gegeben wird, die die Fura-2-beladenen Zellen enthält. Zum Beispiel werden für eine Endkonzentration von 300 μM 4-cmc 1,5 μL der Stammlösung in die Küvette gegeben, die 1,5 ml Zellen in der Lösung von Krebs Ringer enthält. Bei niedrigeren Agonistenkonzentrationen sollte die 300 mM Stammlösung mit DMSO auf 75 mM verdünnt und das entsprechende Volumen in die Küvette gegeben werden, die 1,5 ml Zellen in der Lösung von Krebs Ringer enthält.
   8. Fügen Sie 400 nM Thapsigargin zu Zellen hinzu, um die Gesamtmenge an Ca²⁺ in intrazellulären Speichern zu berechnen. Zeichnen Sie den Peak Ca^{2+ auf.}
   9. Zeichnen Sie das durch eine gegebene Konzentration von 4 cmc induzierte Peak-Calcium im Vergleich zum durch Thapsigargin induzierten Peak-Calcium auf, das als 100% angesehen wird, und erstellen Sie eine 4-cmc-Dosis-Wirkungs-Kurve, die Zellen aus einem Probanden und einem gesunden Verwandten vergleicht
2. Für Experimente an Einzelzellen¹³
   1. Poly-L-Lysin 1:10 in sterilem_H2Overdünnen und die Glasdeckgläser 30 min vorbehandeln. Unter einer sterilen Gewebekulturhaube an der Luft trocknen lassen.
   2. Suspendieren Sie EBV-transformierte B-Lymphozyten auf eine Endkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml in Krebs Ringers Lösung, die 1 mM_CaCl2 enthält, und fügen Sie eine Endkonzentration von 5 μM Fura-2/AM hinzu.
   3. 1 ml Zellen auf die mit Poly-L-Lysin behandelten Deckgläser geben und bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator für 30 min inkubieren, damit die EBV-Zellen während der Beladung am Glasdeckglas haften können.
   4. Legen Sie den Deckglas in die Perfusionskammer und beginnen Sie mit der Perfusion (mit einer Rate von 2 ml/min) mit der Lösung von Krebs Ringer, die 1 mM Ca²⁺enthält.
   5. Verwenden Sie ein inverses Fluoreszenzmikroskop (ausgestattet mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv (0,17 numerische Apertur), Filter (BP 340/380, FT 425, BP 500/530), um Online-Messungen mit einem softwaregesteuerten CCD-Kameraaufsatz (Charge Coupled Device) aufzuzeichnen.
   6. Aufnahme von Bildern in 1 s-Intervallen bei einer festen Belichtungszeit (100 ms für Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm). Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Veränderungen der Fluoreszenz zu analysieren. Messen Sie den durchschnittlichen Pixelwert für jede Zelle bei Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm¹³.
   7. Um eine Zellstimulation zu erreichen, verwenden Sie einen Zellperfusionsstimulator mit 12 Ventilen und fügen Sie verschiedene Konzentrationen von 4 cmc hinzu. Das Spülventil enthält die Lösung von Krebs Ringer ohne Zusatz von Ca²⁺ plus 100 μM La^3+, um nur die Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern zu überwachen.
   8. Konstruieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve von 4 cmc gegenüber der Veränderung von [Ca^2+],wie oben beschrieben.

3. Herstellung menschlicher Myotuben aus Muskelbiopsien^10,12,15

HINWEIS: Verschiedene Labore haben unterschiedliche Methoden verwendet, um aus Satellitenzellen gewonnene Myoblasten und Myotuben zu erhalten. Nachfolgend finden Sie eine Beschreibung der in Basel verwendeten Methode.

1. Spülen Sie die Muskelbiopsie mit sterilem PBS aus, um überschüssiges Blut zu entfernen, und schneiden Sie sie in kleine Fragmente von etwa 0, 5-1 mm.
2. Bereiten Sie 6 Gut-Gewebekulturschalen mit Einsatz zu. Fügen Sie jedem Bohrloch 1,5 ml menschliches Muskelwachstumsmedium und jedem Einsatz 0,5 ml menschliches Muskelwachstumsmedium hinzu.
   HINWEIS: Das Wachstumsmedium setzt sich wie folgt zusammen: 500 ml dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit hoher Glucose oder DMEM (4,5 mg/ml), enthaltend 10% Pferdeserum, 5 ng/ml Insulin, 3 mM Glutamin, 600 ng/ml Penicillin G und Streptomycin sowie 7 mM HEPES, pH 7,4. Handelsübliches Skelettmuskelwachstumsmedium kann ebenfalls verwendet werden.
3. Legen Sie 2-3 kleine Muskelfragmente in jeden Einsatz (Abbildung 1A) und legen Sie Kulturschalen in den Zellkultur-Inkubator (5%_CO2,37 °C). Nach etwa 8-10 Tagen können Satellitenzellen gesehen werden, die aus der Muskelbiopsie wachsen und diese umgeben, die am Insert befestigt ist(Abbildung 1,B und C, Pfeile).
4. Setzen Sie eine ausreichende Anzahl von Zellen aus der Biopsie frei (nach ca. 10-14 Tagen), trypsinisieren Sie wie folgt:
   1. Entfernen Sie alle Kulturmedien, spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS aus, fügen Sie 0,5 ml Trypsin / EDTA-Lösung (0,025% Trypsin und 0,01% EDTA) hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 5 min.
   2. 1 ml Wachstumsmedium zu den Zellen hinzufügen, um die Wirkung von Trypsin zu neutralisieren und die Satellitenzellen in einen neuen T25-Zellkulturkolben zu übertragen; 3 ml Wachstumsmedium zugeben und die Zellen in einen Zellkultur-Inkubator (5%_CO2,37 °C) geben.
   3. Wechseln Sie das Wachstumsmedium am nächsten Tag, um die EDTA zu entfernen, und wechseln Sie anschließend das Medium einmal pro Woche.
5. Wenn Myoblasten zu etwa 75% konfluent sind, trypsinisieren und auf lamininbehandeltes Glasdeckglas übertragen.
   HINWEIS: Im Verhältnis sollten Zellen, die in einem T25-Kolben wachsen, auf einen lamininbehandelten Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 43 mm übertragen werden. Der Glasdeckglas sollte in eine Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 60 mm gelegt werden, die 3 ml Wachstumsmedium enthält.
6. Züchten Sie Zellen auf dem Glasdecker im Wachstumsmedium in einem Zellkultur-Inkubator (5%_CO2,37 °C) und wechseln Sie das Medium einmal pro Woche. Wechseln Sie bei 90% Konfluenz zu einem Differenzierungsmedium, das sich wie folgt zusammensetzt: DMEM mit hohem Glukosegehalt (4,5 mg/ml), 0,5% Rinderserumalbumin, 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 0,15 mg/ml Kreatin, 5 ng/ml Insulin, 200 mM Glutamin, 600 ng/ml Penicillin G und Streptomycin sowie 7 mM HEPES, pH 7,4). Handelsübliche Differenzierungsmedien können ebenfalls verwendet werden. Wechseln Sie das Differenzierungsmedium einmal pro Woche.
7. Nach 7-10 Tagen im Differenzierungsmedium sind mehrkernige Myotuben sichtbar. Bewerten Sie Änderungen in [Ca²⁺] innerhalb einer Woche, wie unten beschrieben.

4. [Ca²⁺]_i Verhältnismessungen mit Fura-2 bestimmt

1. Laden Sie glasgewachsene Myotuben mit Fura-2/AM (Endkonzentration von 5 μM), verdünnt in DMEM für 30 min bei 37 °C. Entfernen Sie kurz das Differenzierungsmedium aus den glasgewachsenen Zellen und fügen Sie 2 ml frisches Differenzierungsmedium hinzu. 10 μL Fura-2 AM aus einer Stammlösung von 1 mM zugeben und 30 min in einem Zellkulturinkubator (5%_CO2,37 °C) inkubieren.
2. Glasdeckglas in die Perfusionskammer überführen und Zellen mit Krebs Ringers Lösung spülen, die 2 mM_{CaCl2 enthält.}
3. Führen Sie Online-Messungen [Ca^2+]durch, wie oben im EBV-Einzelzellabschnitt beschrieben, unter Verwendung eines 20-fachen Wasserimmersions-FLUAR-Objektivs (numerische Apertur 0,17).

Ergebnisse

[Ca²⁺]_i Messungen in Populationen von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten
Primäre B-Lymphozyten exprimieren die RyR1-Isoform, die während B-Zell-Antigenrezeptor-stimulierten Signalprozessen als Ca^{2+-Freisetzungskanal} fungiert¹⁷. Die Immortalisierung von B-Zellen mit EBV, ein Verfahren, das routinemäßig von Genetikern verwendet wird, um Zelllinien zu erhalten, die genomische I...

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden von mehreren Labors erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von RYR1-Mutationen auf die Calciumhomöostase zu untersuchen. Die kritischen Schritte der in diesem Papier beschriebenen Ansätze befassen sich mit Sterilität, Zellkulturfähigkeiten und -techniken sowie der Verfügbarkeit von biologischem Material. Prinzipiell ist die Verwendung von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten einfacher und ermöglicht es, Zelllinien zu erzeugen, die mutierte RyR1-Kanäle enthal...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-chloro-m-cresol	Fluka	24940
Blood collection tubes	Sarstedt	172202
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
caffeine	Merk	102584
Cascade 125+ CCD camera	Photometrics
Cascade 128+ CCD	Photometrics
Creatine	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
Foetal calf serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	16050122
Insulin	ThermoFisher Scientific	A11382II
Ionomycin	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lanthanum	Fluka	61490
Microperfusion system	ALA-Scientific	DAD VM 12 valve manifold
Origin Software	OriginLab Corp	Software
Pennicillin/Streptomycin	Gibco Life Sciences	15140-122
Perfusion chamber POC-R	Pecon	000000-1116-079
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
Spectrofluorimeter	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Tissue culture dishes	Falcon	353046
Tissue culture flask	Falcon	353107
Tissue culture inserts	Falcon	353090
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss AG
Zeiss glass coverslips	Carl Zeiss AG	0727-016