Caratterizzazione funzionale di varianti RYR1 umane espresse endogenamente

Riepilogo

Qui vengono descritti i metodi utilizzati per studiare l'effetto funzionale delle mutazioni RYR1 endogenamente espresse nel virus di Epstein Barr immortalato nei linfociti B umani e nelle cellule satelliti derivate dalla biopsia muscolare differenziate in miotubi.

Abstract

Più di 700 varianti del gene RYR1 sono state identificate in pazienti con diversi disturbi neuromuscolari tra cui suscettibilità all'ipertermia maligna, miopatie core e miopatia centronucleare. A causa dei diversi fenotipi legati alle mutazioni RYR1 è fondamentale caratterizzare i loro effetti funzionali per classificare le varianti trasportate dai pazienti per futuri interventi terapeutici e identificare le varianti non patogene. Molti laboratori sono stati interessati a sviluppare metodi per caratterizzare funzionalmente le mutazioni RYR1 espresse nelle cellule dei pazienti. Questo approccio presenta numerosi vantaggi, tra cui: le mutazioni sono espresse endogenamente, RyR1 non è sovraespresso, l'uso di cellule eterologhe che esprimono RyR1 è evitato. Tuttavia, poiché i pazienti possono presentare mutazioni in geni diversi oltre a RYR1, è importante confrontare i risultati di materiale biologico di individui che ospitano la stessa mutazione, con background genetici diversi. Il presente manoscritto descrive i metodi sviluppati per studiare gli effetti funzionali delle varianti RYR1 espresse endogenamente in: (a) il virus di Epstein Barr ha immortalato i linfociti B umani e (b) le cellule satelliti derivate da biopsie muscolari e differenziate in miotubi. Vengono quindi monitorate le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio innescate dall'aggiunta di un attivatore RyR1 farmacologico. Il tipo di cellula selezionato viene caricato con un indicatore di calcio fluorescente raziometrico e le variazioni intracellulari [Ca²⁺] vengono monitorate a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza o in popolazioni cellulari utilizzando uno spettrofluorometro. Le curve di risposta alla dose agonista [Ca²⁺], a riposo vengono quindi confrontate tra cellule provenienti da controlli sani e pazienti che ospitano varianti RYR1 portando a comprendere l'effetto funzionale di una determinata variante.

Introduzione

Ad oggi sono state identificate più di 700 varianti di RYR1 nella popolazione umana e legate a vari disturbi neuromuscolari tra cui la suscettibilità all'ipertermia maligna (MHS), la rabdomiolisi indotta dall'esercizio, la malattia del nucleo centrale (CCD), la malattia multi-minicore (MmD), la miopatia centronucleare (CNM)^1,2,3 ; tuttavia, gli studi per caratterizzare i loro effetti funzionali sono in ritardo e solo circa il 10% delle mutazioni sono state testate funzionalmente. Diversi approcci sperimentali possono essere utilizzati per valutare l'impatto di una data variante di RyR1, compresa la trasfezione di cellule eterologhe come cellule HEK293 e COS-7 con plasmide che codifica per il WT e mutante RYR1 cDNA^4,5, trasduzione di fibroblasti di topo dispedici con plasmidi e vettori che codificano per il WT e il cDNA RYR1 mutante, seguita da trasduzione con mio-D e differenziazione in miotubi⁶ , generazione di modelli animali transgenici portatori mutanti RyR1s^7,8,9,caratterizzazione di cellule da pazienti che esprimono la variante RYR1 endogenamente^10,11,12. Tali metodi hanno contribuito a stabilire come diverse mutazioni influiscano funzionalmente sul canale RyR1 Ca^2+.

Qui vengono descritti i metodi sviluppati per valutare gli effetti funzionali delle mutazioni RYR1. Vari parametri dell'omeostasi intracellulare del calcio sono studiati nelle cellule umane che esprimono endogenamente il canale del calcio RyR1, compresi i miotubi e i linfociti B immortalati del virus di Epstein Barr (EBV). Le cellule sono ottenute da pazienti, espanse in coltura e caricate con indicatori di calcio fluorescenti raziometrici come Fura-2 o indo-1. I parametri che sono stati segnalati per essere alterati a causa di mutazioni patogenetiche di RYR1 tra cui il riposo [Ca^2+],la sensibilità a diversi agonisti farmacologici e la dimensione delle riserve intracellulari di Ca²⁺ sono misurati a livello di singola cellula, usando la microscopia a fluorescenza, o in popolazioni cellulari usando un fluorimetro. I risultati ottenuti in cellule da portatori di mutazioni vengono quindi confrontati con quelli ottenuti da membri sani della famiglia di controllo. Questo approccio ha dimostrato che: (i) molte mutazioni legate alla MHS portano ad un aumento del riposo [Ca^2+]e ad uno spostamento a sinistra nella curva dose-risposta alla depolarizzazione indotta da KCl o all'attivazione farmacologica di RyR1 con 4-cloro-m-cresolo^10,11,12,13; (ii) le mutazioni legate alla CCD portano ad una diminuzione del picco [Ca²⁺] rilasciato dall'attivazione farmacologica del RyR1 e alla diminuzione delle dimensioni se il Ca²⁺ intracellulare immagazzina^12,13,14,15; (iii) alcune varianti non influiscono sull'omeostasi del Ca2+¹³. I vantaggi di questo approccio sperimentale sono: la proteina RyR1 non è sovraespressa e sono presenti livelli fisiologici, le cellule possono essere immortalate (sia cellule muscolari che linfociti B) fornendo linee cellulari contenenti mutazioni. Alcuni svantaggi riguardano il fatto che i pazienti possono portare mutazioni in più di un gene che codifica per proteine coinvolte nell'omeostasi del calcio e/o nell'accoppiamento di contrazione dell'eccitazione (ECC) e questo può complicare le conclusioni sperimentali. Ad esempio, due varianti di JP-45 sono state identificate nella mhS e nella popolazione di controllo e la loro presenza ha dimostrato di influire sulla sensibilità del recettore della diidropiridina (DHPR) all'attivazione¹⁶. I pazienti devono essere disponibili, il materiale biologico deve essere appena raccolto e i permessi etici devono essere ottenuti dai comitati etici locali.

Protocollo

I protocolli descritti di seguito sono conformi alle linee guida etiche dell'Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Preparazione delle linee cellulari dei linfociti B immortalati di Epstein Barr¹¹

1. Dopo il consenso informato, raccogliere 30 ml di sangue intero in tubi sterili trattati con EDTA dal proband portatore di una mutazione RYR1 e da membri sani della famiglia senza mutazione.
   NOTA: Mantenere tutte le soluzioni sterili e lavorare in una cappa di coltura di tessuto.
2. Isolare le cellule mononucleate dal sangue intero mediante centrifugazione a gradiente di densità (ad esempio, Ficoll-Hypaque, .077 g/L).
   1. Posizionare 30 ml di sangue sterile in un tubo sterile conico da 50 ml.
   2. Posizionare la punta di una pipetta Pasteur contenente il mezzo di centrifugazione a gradiente di densità sul fondo del tubo e lo strato 20 mL sterile di soluzione di centrifugazione a gradiente di densità lentamente sotto il sangue.
   3. Centrifuga per 30 min a 900 x g a 18°-20°C, senza interruzioni.
      NOTA: Lo strato di cellule mononucleate appare come un anello torbido nell'interfase tra lo strato di centrifugazione a gradiente di densità e lo strato superiore contenente plasma arricchito di piastrine.
3. Con una pipetta sterile rimuovere delicatamente lo strato interfase contenente cellule mononucleate (circa 3-5 ml) e trasferire la soluzione in un tubo conico sterile pulito da 50 ml.
4. Aggiungere 20 ml di soluzione salina tampone fosfato (PBS) per risciacquare le cellule, centrifugare per 10 minuti a 600 x g a temperatura ambiente e risospese il pellet in PBS. Ripeti per un totale di tre volte; questo assicura che tutti i supporti vengano rimossi.
5. Dopo l'ultimo lavaggio, risospese le cellule in 1-2 mL di terreno di coltura tissutale (mezzo RPMI integrato con il 10% di siero fetale del vitello, 2 mM di L-glutammina e 100 unità di penicillina e streptomicina). Collocare le cellule mononucleate (circa 1 x 10 6 cellule) in un pallone di^coltura tissutale T125 contenente 20 ml di terreno di coltura tissutale.
6. Infettare le cellule mononucleate con il virus di Epstein-Barr.
   1. Utilizzare supernatanti provenienti da colture cellulari B95.8 (contenenti^{10 2}-10³ unità trasformanti/mL stoccate a -80 °C) come fonte di EBV.
   2. Sospendere 1 x 10⁶ cellule mononucleate dallo stadio 1,5 in 20 mL di terreno di coltura tissutale ed esporle a 2 mL di surnatante dalla linea cellulare B95.8 in presenza di ciclosporina A (concentrazione finale di 0,2 μg/mL) per l'infezione.
7. Posizionare il matraccio in un incubatore di colture cellulari a 37 °C e consentire alle cellule di crescere. Dopo una settimana cambia il mezzo culturale.
   NOTA: Una volta che le cellule B iniziano a proliferare, formano grumi riconoscibili e crescono rapidamente in modo che le colture possano essere espanse e congelate.
8. Estrarre il DNA genomico dalle linee cellulari di linfociti B immortalizzate EBV¹¹ per confermare la presenza o l'assenza della mutazione data.

2. Misurazioni intracellulari di Ca²⁺

NOTA: Le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio delle linee cellulari dei linfociti B trasformate in EBV possono essere monitorate nelle popolazioni cellulari, con uno spettrofluorometro dotato di agitatore magnetico e portacuvette impostato a 37 °C. In alternativa, le variazioni di Ca²⁺ possono essere monitorate in singole cellule mediante microscopia a fluorescenza. In entrambi i casi le cellule vengono rimosse dal pallone di coltura tissutale, lavate due volte con la soluzione di Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl_2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO_4,5,5 mM glucosio, pH 7,4 contenente 1 mM CaCl₂₎e contate.

1. Per esperimenti in popolazioni cellulari utilizzando uno spettrofluorometro^11,13,14
   1. Risospendare le cellule ad una concentrazione finale di 1 x 10⁷ cellule/mL nella soluzione di Krebs Ringer e incubare a 37°C per 30 min con una concentrazione finale di 5 μM Fura-2/AM.
   2. Centrifugare le celle a 900 x g per 10 minuti e risospendarle nella soluzione di Krebs Ringer ad una concentrazione di 2 x 10⁶ celle/ml.
   3. Misurare le variazioni di fluorescenza (rapporto 340/380 nm) utilizzando uno spettrofluorometro dotato di un agitatore magnetico impostato alla massima velocità e impostato su 37 °C.
   4. Poco prima dell'esperimento spin le celle a 900 x g per 5 minuti in una microcentrifuga e risospende rapidamente il pellet in 1,5 ml di soluzione di Krebs Ringer con 0,5 mM EGTA ma senza Aggiunta di Ca^2+.
   5. Posizionare le cellule in una cuvetta spettrofluorometrica di vetro da 3 mL e registrare il rapporto di fluorescenza (eccitazione 340 nm/380 nm, emissione 510 nm).
   6. Raggiungere una linea di base stabile (circa 30 secondi), aggiungere la concentrazione selezionata di agonista RyR1 (4-cloro-m-cresolo o 4-cmc) e registrare il transitorio di calcio.
      NOTA: Una soluzione madre da 300 mM di 4-cmc prodotta in DMSO viene utilizzata come reagente di partenza. Questa soluzione può essere preparata in anticipo, aliquotata e conservata a -20 °C per diversi mesi.
   7. Eseguire esperimenti per diverse concentrazioni di 4 cmc.
      NOTA: Includere 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, da 750 μM a 1 mM per generare una curva dose-risposta dell'agonista rispetto alla variazione in [Ca^2+]. Le diverse concentrazioni di 4-cmc si ottengono aggiungendo il volume appropriato di 4-cmc dalla soluzione madre, direttamente nella cuvetta contenente le celle caricate Fura-2. Ad esempio, per una concentrazione finale di 300 μM 4-cmc, 1,5 μL della soluzione madre vengono aggiunti alla cuvetta contenente 1,5 mL di cellule nella soluzione di Krebs Ringer. Per concentrazioni di agonisti più basse, la soluzione madre da 300 mM deve essere diluita a 75 mM con DMSO e il volume appropriato aggiunto alla cuvetta contenente 1,5 mL di cellule nella soluzione di Krebs Ringer.
   8. Aggiungere 400 nM thapsigargin alle cellule per calcolare la quantità totale di Ca²⁺ presente nei depositi intracellulari. Registrare il picco Ca²⁺.
   9. Tracciare il picco di calcio indotto da una data concentrazione di 4-cmc rispetto al picco di calcio indotto da thapsigargin, che è considerato al 100% e costruire una curva di risposta alla dose di 4 cmc confrontando le cellule di un proband e di un parente sano
2. Per esperimenti su singole cellule¹³
   1. Diluire la poli-L-lisina 1:10 in H₂O sterile e pretrattare le coperture in vetro per 30 min. Lasciare asciugare all'aria sotto un cappuccio sterile per la coltura del tessuto.
   2. Sospendere nuovamente i linfociti B trasformati in EBV ad una concentrazione finale di 1 x 10⁶ cellule/mL nella soluzione di Krebs Ringer contenente 1 mM di CaCl₂ e aggiungere una concentrazione finale di 5 μM Fura-2/AM.
   3. Posizionare 1 mL di cellule sui coverslip trattati con poli-L-lisina e incubare a 37 °C in un incubatore di colture cellulari umidificate per 30 minuti per consentire alle cellule EBV di aderire al coperchio di vetro durante il carico.
   4. Posizionare il coverslip nella camera di perfusione e iniziare la perfusione (ad una velocità di 2 mL/min) con la soluzione di Krebs Ringer contenente 1 mM Ca²⁺.
   5. Utilizzare un microscopio fluorescente invertito (dotato di un obiettivo ad immersione in olio 40x (apertura numerica 0,17), filtri (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) per registrare misurazioni in linea, con un attacco per telecamera CCD (Charge Coupled Device) controllato da software.
   6. Acquisire immagini a intervalli di 1 s a un tempo di esposizione fisso (100 ms per entrambe le lunghezze d'onda di eccitazione a 340 e 380 nm. Utilizzare un software di imaging per analizzare i cambiamenti nella fluorescenza. Misurare il valore medio dei pixel per ogni cella a lunghezze d'onda di eccitazione di 340 e 380 nm¹³.
   7. Per ottenere la stimolazione cellulare, utilizzare uno stimolatore di perfusione cellulare con 12 valvole e aggiungere diverse concentrazioni di 4-cmc. La valvola di scarico contiene la soluzione di Krebs Ringer senza aggiunta di Ca²⁺ più 100 μM La³⁺ per monitorare il rilascio di calcio solo dalle riserve intracellulari.
   8. Costruire una curva dose-risposta di 4-cmc rispetto alla variazione in [Ca²⁺], come descritto sopra.

3. Preparazione di miotubi umani da biopsie muscolari^10,12,15

NOTA: Diversi metodi sono stati utilizzati da diversi laboratori per ottenere mioblasti e miotubi derivati da cellule satelliti. Di seguito è riportata la descrizione del metodo utilizzato a Basilea.

1. Risciacquare la biopsia muscolare con PBS sterile per rimuovere il sangue in eccesso e tagliare in piccoli frammenti di circa 0,5-1 mm.
2. Preparare 6 piatti di coltura di tessuti ben con inserto. Aggiungere 1,5 ml di terreno di crescita muscolare umano a ciascun pozzetto e 0,5 ml di terreno di crescita muscolare umano a ciascun inserto.
   NOTA: Il mezzo di crescita è composto come segue: 500 mL di eagle modificato di Dulbecco con glicemia alta, o DMEM (4,5 mg / mL), contenente il 10% di siero di cavallo, 5 ng / mL di insulina, 3 mM di glutammina, 600 ng / mL di penicillina G e streptomicina e 7 mM HEPES, pH 7,4. Può essere utilizzato anche un mezzo di crescita muscolare scheletrica disponibile in commercio.
3. Posizionare 2-3 piccoli frammenti muscolari in ogni inserto (Figura 1A) e posizionare i piatti di coltura nell'incubatore di colture cellulari (5% CO₂, 37 ° C). Dopo circa 8-10 giorni si possono vedere cellule satelliti crescere fuori e intorno alla biopsia muscolare, attaccate all'inserto(Figura 1,B e C, frecce).
4. Rilasciare un numero sufficiente di cellule dalla biopsia (dopo circa 10-14 giorni), tripsinizzare come segue:
   1. Rimuovere tutto il terreno di coltura, sciacquare le cellule una volta con 1 mL di PBS, aggiungere 0,5 mL di soluzione di tripsina/EDTA (0,025% tripsina e 0,01% EDTA) e incubare a 37 °C per 5 minuti.
   2. Aggiungere 1 mL di terreno di crescita alle cellule per neutralizzare l'effetto della tripsina e trasferire le cellule satelliti in un nuovo pallone di coltura cellulare T25; aggiungere 3 ml di terreno di coltura e collocare le cellule in un incubatore di colture cellulari (5% CO_2,37 °C).
   3. Cambiare il mezzo di crescita il giorno successivo per rimuovere l'EDTA e successivamente cambiare il mezzo una volta alla settimana.
5. Quando i mioblasti sono confluenti per circa il 75%, tripsilizzarli e trasferirli su un coperchio di vetro trattato con laminina.
   NOTA: in proporzione, le cellule che crescono in un pallone T25 devono essere trasferite su un coperchio di vetro trattato con laminina di 43 mm di diametro. Il coperchio di vetro deve essere posizionato all'interno di una piastra di coltura tissutale di 60 mm di diametro contenente 3 ml di terreno di coltura.
6. Coltivare cellule sul coperchio di vetro nel mezzo di crescita in un incubatore di colture cellulari (5% CO₂, 37 ° C) cambiando il mezzo una volta alla settimana. Con una confluenza del 90%, passare al mezzo di differenziazione costituito come segue: DMEM ad alto contenuto di glucosio (4,5 mg/mL), albumina sierica bovina allo 0,5%, fattore di crescita epidermico 10 ng/mL, 0,15 mg/mL di creatina, 5 ng/mL di insulina, 200 mM di glutammina, 600 ng/mL di penicillina G e streptomicina e 7 mM HEPES, pH 7,4). Può essere utilizzato anche un mezzo di differenziazione disponibile in commercio. Cambia il mezzo di differenziazione una volta alla settimana.
7. Dopo 7-10 giorni nel mezzo di differenziazione, sono visibili i miotubi multinucleati. Valutare le modifiche in [Ca²⁺] entro una settimana, come descritto di seguito.

4. [Ca²⁺]_i misure del rapporto determinate con Fura-2

1. Caricare miotubi cresciuti con copertura di vetro con Fura-2/AM (concentrazione finale di 5 μM) diluito in DMEM per 30 minuti a 37 °C. In breve, rimuovere il mezzo di differenziazione dalle cellule coltivate in vetro e aggiungere 2 ml di terreno di differenziazione fresco. Aggiungere 10 μL di Fura-2 AM da una soluzione madre di 1 mM e incubare 30 minuti in un incubatore di colture cellulari (5% CO₂, 37 °C).
2. Trasferire il coperchio di vetro nella camera di perfusione e risciacquare le cellule con la soluzione di Krebs Ringer contenente 2 mM di CaCl₂.
3. Eseguire misurazioni on-line [Ca²⁺] come descritto sopra nella sezione A cella singola EBV con l'uso di un obiettivo FLUAR ad immersione in acqua 20x (apertura numerica 0,17).

Risultati

[Ca²⁺]_i misurazioni in popolazioni di linfociti B immortalizzati EBV
I linfociti B primari esprimono l'isoforma RyR1 che funziona come canale di rilascio di Ca²⁺ durante i processi di segnalazione stimolati dal recettore dell'antigene delle cellule B¹⁷. L'immortalizzazione delle cellule B con EBV, una procedura abitualmente utilizzata dai genetisti per ottenere linee cellulari ...

Discussione

I protocolli descritti in questo articolo sono stati utilizzati con successo da diversi laboratori per studiare l'impatto delle mutazioni RYR1 sull'omeostasi del calcio. I passaggi critici degli approcci delineati in questo documento riguardano la sterilità, le capacità e le tecniche di coltivazione cellulare e la disponibilità di materiale biologico. In linea di principio, l'uso di linfociti B immortalizzati EBV è più semplice e consente di generare linee cellulari contenenti canali RyR1 mutanti. Le cellule possono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-chloro-m-cresol	Fluka	24940
Blood collection tubes	Sarstedt	172202
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
caffeine	Merk	102584
Cascade 125+ CCD camera	Photometrics
Cascade 128+ CCD	Photometrics
Creatine	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
Foetal calf serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	16050122
Insulin	ThermoFisher Scientific	A11382II
Ionomycin	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lanthanum	Fluka	61490
Microperfusion system	ALA-Scientific	DAD VM 12 valve manifold
Origin Software	OriginLab Corp	Software
Pennicillin/Streptomycin	Gibco Life Sciences	15140-122
Perfusion chamber POC-R	Pecon	000000-1116-079
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
Spectrofluorimeter	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Tissue culture dishes	Falcon	353046
Tissue culture flask	Falcon	353107
Tissue culture inserts	Falcon	353090
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss AG
Zeiss glass coverslips	Carl Zeiss AG	0727-016