אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

Summary

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

Abstract

יותר מ -700 גרסאות בגן RYR1 זוהו בחולים עם הפרעות עצביות-שריריות שונות כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה, מיופתיות ליבה ומיופתיה centronuclear. בגלל פנוטיפים מגוונים הקשורים מוטציות RYR1 זה בסיסי לאפיין את ההשפעות התפקודיות שלהם כדי לסווג וריאנטים נישאים על ידי חולים להתערבויות טיפוליות עתידיות ולזהות וריאנטים שאינם פתוגניים. מעבדות רבות התעניינו בפיתוח שיטות לאפיון תפקודי של מוטציות RYR1 המתבטאות בתאי המטופלים. לגישה זו יתרונות רבים, כולל: מוטציות מתבטאות באנדוגניות, RyR1 אינו מתבטא יתר על המידה, השימוש בתאי RyR1 הטרולוגיים המבטאים נמנע. עם זאת, מאז חולים עשויים להציג מוטציות בגנים שונים מלבד RYR1, חשוב להשוות תוצאות מחומר ביולוגי מאנשים מחסה אותה מוטציה, עם רקע גנטי שונה. כתב היד הנוכחי מתאר שיטות שפותחו כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של גרסאות RYR1 המובעות באנדוגניות ב: (א) וירוס אפשטיין בר הנציח לימפוציטים B אנושיים ו -(ב) תאי לווין הנגזרים ביופסיות שרירים ומובחנים לתוך מיוטיוב. שינויים בריכוז הסידן התאי המופעלים על ידי תוספת מפעילי RyR1 פרמקולוגיים מנוטרים לאחר מכן. סוג התא שנבחר נטען עם מחוון סידן פלואורסצנטי יחסטרי ושינויים תאיים [Ca²⁺] מנוטרים או ברמת התא הבודד על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר. המנוחה [Ca²⁺], עקומות תגובת מינון אגוניסטיות משווות לאחר מכן בין תאים משליטה בריאה וחולים מחסה וריאנטים RYR1 המוביל תובנה לתוך ההשפעה התפקודית של גרסה נתונה.

Introduction

עד כה זוהו יותר מ-700 גרסאות RYR1 באוכלוסייה האנושית וקשורות להפרעות נוירו-שריריות שונות, כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה (MHS), פעילות גופנית המושרה rhabdomyolysis, מחלת ליבה מרכזית (CCD), מחלת רב-מיני-קור (MmD), מיופתיה סנטרונוקלארית (CNM)^1,2,3 ; עם זאת, מחקרים לאפיון ההשפעות התפקודיות שלהם מפגרים ורק כ -10% מהמוטציות נבדקו באופן פונקציונלי. ניתן להשתמש בגישות ניסיוניות שונות כדי להעריך את ההשפעה של גרסה RyR1 נתון, כולל transfection של תאים הטרולוגיים כגון HEK293 ו COS-7 תאים עם קידוד plasmid עבור WT מוטציה RYR1 cDNA^4,5, טרנסדוקציה של פיברובלסטים עכבר דיפדי עם plasmids וקטורים קידוד עבור WT מוטציה RYR1 cDNA, ואחריו טרנסדוקציה עם myo-D ובידול לתוך myotubes⁶ דור של מודלים חייתיים מהונדסים הנושאים מוטציה RyR1s^7,8,9, אפיון תאים מחולים המבטאים את גרסת RYR1 אנדוגני^10,11,12. שיטות כאלה עזרו לקבוע כיצד מוטציות שונות משפיעות מבחינה פונקציונלית על ערוץ RyR1 Ca²⁺ .

כאן, שיטות שפותחו כדי להעריך את ההשפעות הפונקציונליות של מוטציות RYR1 מתוארים. פרמטרים שונים של הומאוסטזיס סידן תאי נחקרים בתאים אנושיים מבטאים אנדוגני את ערוץ הסידן RyR1, כולל מיוטיוב ווירוס אפסטין בר (EBV) לימפוציטים מונצחים B. תאים מתקבלים מחולים, מורחבים בתרבית ועמוסים במדדי סידן פלואורסצנטיים יחסטריים כגון Fura-2 או indo-1. פרמטרים אשר דווחו להיות שונה בגלל מוטציות RYR1 פתוגניים כולל מנוחה [Ca^{2 +}], הרגישות אגוניסטים רוקח שונים ואת הגודל של מאגרי Ca^{2 +} תאי נמדדים או ברמת התא הבודד, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, או באוכלוסיות תאים באמצעות פלואורימטר. לאחר מכן, התוצאות המתקבלות בתאים מנשאי מוטציה משווות את התוצאות של בני משפחה בשליטה בריאה. גישה זו הוכיחה כי: (i) מוטציות רבות הקשורות ל- MHS מובילות לעלייה במנוחה [Ca²⁺] ומעבר שמאלה בעקומת תגובת המינון להפעלה של דה-קוטביות הנגרמת על ידי KCl או להפעלת RyR1 פרמקולוגית עם 4-כלורו-m-קרסול^10,11,12,13; (ii) מוטציות הקשורות ל- CCD מובילות לירידה בשיא [Ca²⁺] שפורסמו על ידי הפעלה פרמקולוגית של RyR1 וירידה בגודל אם Ca^{2 +} תאיים חנויות^12,13,14,15; (iii) גרסאות מסוימות אינן משפיעות על Ca2 + הומאוסטזיס¹³. היתרונות של גישה ניסיונית זו הם: חלבון RyR1 אינו מבוטא יתר על המידה ורמות פיזיולוגיות קיימות, ניתן להנציח תאים (הן תאי שריר והן לימפוציטים B) המספקים קווי תאים המכילים מוטציות. חסרונות מסוימים מתייחסים לעובדה כי חולים עשויים לשאת מוטציות ביותר מחלבונים קידוד גן אחד המעורבים סידן הומאוסטזיס ו /או צימוד התכווצות עירור (ECC) וזה עלול לסבך מסקנות ניסיוניות. לדוגמה, שתי גרסאות JP-45 זוהו ב- MHS ואוכלוסיית הבקרה ונוכחותם הוכחו כמשפיעות על הרגישות של קולטן הדיהידרופרידין (DHPR) להפעלה¹⁶. חולים צריכים להיות זמינים, חומר ביולוגי צריך להיות שנאסף טרי ויש לקבל היתרים אתיים מוועדת האתיקה המקומית.

Protocol

הפרוטוקולים המתוארים להלן תואמים את הנחיות האתיקה של Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. הכנת אפשטיין בר מונצח B-לימפוציט קווים¹¹

1. לאחר הסכמה מדעת, לאסוף 30 מ"ל של דם שלם בצינורות סטריליים שטופלו EDTA מן proband נושא מוטציה RYR1 ומבני משפחה בריאים ללא מוטציה.
   הערה: שמור על כל הפתרונות סטריליים ועבוד במכסה המנוע של תרבית הרקמות.
2. לבודד תאים מונונוקלאריים מדם שלם על ידי צפיפות של מדיית צנטריפוגה הדרגתית (למשל, פיקול-היפק, .077 גרם/ ליטר).
   1. מניחים 30 מ"ל של דם סטרילי בצינור סטרילי חרוט 50 מ"ל.
   2. מניחים את הקצה של פיפטת פסטר המכילה את מדיית צנטריפוגת שיפוע הצפיפות בתחתית הצינור ושכבה 20 מ"ל סטרילית של תמיסת מדיה שיפועית בצפיפות לאט מתחת לדם.
   3. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב-900 x גרם ב-18°-20 מעלות צלזיוס, ללא הפסקה.
      הערה: שכבת התא המונונוקלארי מופיעה כטבעת מעוננת באינטרפאזה שבין שכבת המדיה של צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות לבין השכבה העליונה המכילה פלזמה מועשרת בטסיות דם.
3. עם פיפטה סטרילית להסיר בעדינות את השכבה הבין-פאזית המכילה תאים מונונוקלאריים (כ 3-5 מ"ל) ולהעביר את הפתרון לצינור חרוט סטרילי נקי 50 מ"ל.
4. הוסיפו 20 מ"ל של תמיסת מלח פוספט (PBS) לשטיפת תאים, צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-600 x גרם בטמפרטורת החדר והגדילו מחדש את הכדור ב-PBS. חזור על הפעולה במשך שלוש פעמים בסך הכל; פעולה זו מבטיחה שכל המדיה תוסר.
5. לאחר השטיפה האחרונה, תאים resuspend ב 1-2 מ"ל של מדיום תרבית רקמות (RPMI בינוני בתוספת 10% סרום עגל עוברי, 2 mM L-גלוטמין, ו 100 יחידות של פניצילין וסטרפטומיצין). מקם תאים מונונוקלאריים (כ 1 x 10⁶ תאים) בבקבוק תרבית רקמות T125 המכיל 20 מ"ל של מדיום תרבית רקמות.
6. להדביק תאים מונונוקלריים עם וירוס אפשטיין-בר.
   1. השתמש בנתחי-על מתרביות קווי תאים B95.8 (המכילים 10 יחידות טרנספורמציה של^10-2-103 יחידות טרנספורמציה/מ"ל המצוידות ב- -80 °C (70 °F) כמקור ל- EBV.
   2. Resuspend 1 x 10⁶ תאים מונונוקלאריים בשלב 1.5 ב 20 מ"ל של מדיום תרבית רקמות לחשוף אותם 2 מ"ל של supernatant מקו התא B95.8 בנוכחות cyclosporin A (0.2 מיקרוגרם / מ"ל ריכוז סופי) לזיהום.
7. מניחים את הבקבוקון באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס ומאפשרים לתאים לגדול. אחרי שבוע לשנות את המדיום התרבותי.
   הערה: ברגע שתאי B מתחילים להתרבות הם יוצרים גושים מוכרים וגדלים במהירות כך שניתן להרחיב ולהקפיא את התרביות.
8. לחלץ את ה- DNA הגנומי מן EBV מונצח B-לימפוציט קווים¹¹ כדי לאשר את נוכחות או היעדר המוטציה הנתונה.

2. מדידות תאיות Ca²⁺

הערה: שינויים בריכוז הסידן התאי של קווי תאי B-לימפוציטים שעברו טרנספורמציה של EBV ניתנים לניטור באוכלוסיות תאים, עם ספקטרופלואורומטר המצויד במפזר מגנטי ומחזיק cuvette להגדיר 37 °C (50 °F). לחלופין, ניתן לעקוב אחר שינויים של Ca²⁺ בתאים בודדים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בשני המקרים תאים מוסרים מבקבוק תרבית הרקמה, נשטפים פעמיים עם הפתרון של קרבס רינגר (140 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 20 mM HEPES, 1 mM NaHPO₄, 5.5 מ"ר גלוקוז, pH 7.4 המכיל 1 mM CaCl₂) ונספר .

1. לניסויים באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר^11,13,14
   1. תאים resuspend בריכוז סופי של 1 x 10⁷ תאים / מ"ל בתמיסה של קרבס רינגר ודגורה ב 37 °C במשך 30 דקות עם ריכוז סופי של 5 μM Fura-2/AM.
   2. תאי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 10 דקות ו resuspened אותם בתמיסה של קרבס רינגר בריכוז של 2 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   3. מדוד שינויים פלואורסצנטיים (יחס 340/380 ננומטר) באמצעות ספקטרופלואורומטר המצויד ב stirrer מגנטי להגדיר במהירות מקסימלית להגדיר 37 °C (37 °F).
   4. רגע לפני הניסוי ספין תאים ב 900 x g במשך 5 דקות ב microcentrifuge במהירות resuspend הכדור ב 1.5 מ"ל של הפתרון של קרבס רינגר עם 0.5 מ"מ EGTA אבל לא הוסיף Ca^{2 +}.
   5. מקם את התאים ב cuvette cuvette זכוכית 3 מ"ל ולרשום את יחס פלואורסצנטיות (340 ננומטר / 380 ננומטר עירור, פליטה 510 ננומטר).
   6. להשיג קו בסיס יציב (כ 30 שניות), להוסיף את הריכוז הנבחר של אגוניסט RyR1 (4-כלורו-m-cresol, או 4-cmc) ולתעד את סידן חולף.
      הערה: פתרון מלאי של 300 מ"מ של 4 ס"מ המיוצר ב- DMSO משמש כמחזר מתחיל. פתרון זה יכול להיעשות מראש, aliquoted ומאוחסן ב -20 °C (50 °F) במשך מספר חודשים.
   7. בצע ניסויים בריכוזים שונים של 4 cmc.
      הערה: כלול 75 מיקרומטר, 150 מיקרומטר, 300 מיקרומטר, 450 מיקרומטר, 600 מיקרומטר, 750 מיקרומטר עד 1 מ"מ כדי ליצור עקומת תגובת מינון של אגוניסט לעומת שינוי ב [ Ca^{2 +}]. ריכוזי 4-cmc השונים מתקבלים על ידי הוספת הנפח המתאים של 4-cmc מפתרון המלאי, ישירות לתוך cuvette המכיל את התאים הטעונים Fura-2. לדוגמה, לריכוז סופי של 300 μM 4-cmc, 1.5 μL של פתרון המלאי מתווספים cuvette המכיל 1.5 מ"ל של תאים בפתרון של קרבס רינגר. לריכוזים אגוניסטיים נמוכים יותר, פתרון המלאי של 300 מ"מ צריך להיות מדולל ל- 75 מ"מ עם DMSO ואת הנפח המתאים שנוסף ל- cuvette המכיל 1.5 מ"ל של תאים בתמיסה של קרבס רינגר.
   8. הוסף 400 nM thapsigargin לתאים כדי לחשב את הסכום הכולל של Ca^{2 +} נוכח בחנויות תאיות. תעד את השיא Ca²⁺.
   9. התווה את שיא הסידן המושרה על ידי ריכוז נתון של 4 cmc לעומת שיא הסידן המושרה על ידי thapsigargin, אשר נחשב 100% ולבנות עקומת תגובה מינון 4 cmc השוואת תאים מ proband וקרוב משפחה בריא
2. לניסויים בתאים בודדים¹³
   1. לדלל פולי-L-ליצין 1:10 סטרילי H₂O ולטפל מראש כיסויי הזכוכית במשך 30 דקות. אפשר לייבש אוויר מתחת למכסה המנוע סטרילי של תרבית הרקמות.
   2. להשעות מחדש EBV-לימפוציטים B-לימפוציטים לריכוז סופי של 1 x 10⁶ תאים / מ"ל בתמיסה של קרבס רינגר המכיל 1 mM CaCl₂ ולהוסיף ריכוז סופי של 5 מיקרומטר Fura-2/AM.
   3. מניחים 1 מ"ל של תאים על כיסויים שטופלו בפולי-L-ליסין ודגרה ב 37 °C בחממה תרבית תאים לח במשך 30 דקות כדי לאפשר לתאי EBV להיצמד כיסוי זכוכית במהלך הטעינה.
   4. מניחים את כיסוי תא הזילוף ומתחילים זלוף (בקצב של 2 מ"ל לדקה) עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 1 מ"מ Ca^{2 +}.
   5. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך (המצויד במטרה טבילת שמן פי 40 (צמצם מספרי 0.17), מסננים (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) כדי להקליט מדידות און-ליין, עם קובץ מצורף למצלמה מצמידה להתקן (CCD) הנשלט על-ידי תוכנה.
   6. השג תמונות במרווחי זמן של 1 שניות בזמן חשיפה קבוע (100 מילישניות עבור אורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר. השתמש בתוכנת הדמיה כדי לנתח שינויים בפלואורסצנטיות. מדוד את ערך הפיקסלים הממוצע עבור כל תא לאורכי גל של 340 ו- 380 ננומטר¹³.
   7. כדי להשיג גירוי התא, להשתמש ממריץ זלוף תא עם 12 שסתומים ולהוסיף ריכוזים שונים של 4-cmc. שסתום סומק מכיל הפתרון של קרבס רינגר ללא תוספת Ca^{2 +} בתוספת 100 μM La³⁺ כדי לפקח על שחרור סידן מחנויות תאיות בלבד.
   8. לבנות עקומת תגובת מינון של 4-cmc לעומת שינוי ב [Ca²⁺], כמתואר לעיל.

3. הכנת מיוטיוב אנושי מביופסיות^{שרירים 10,12,15}

הערה: שיטות שונות שימשו מעבדות שונות כדי להשיג myoblasts שמקורם בתא לווין myotubes. להלן תיאור השיטה המשמשת בבאזל.

1. לשטוף ביופסיה שריר עם PBS סטרילי כדי להסיר עודף דם לחתוך לרסיסים קטנים של כ 0.5-1 מ"מ.
2. הכן 6 מנות תרבית רקמות היטב עם להכניס. הוסף 1.5 מ"ל של בינוני צמיחת שריר אנושי לכל באר ו 0.5 מ"ל של מדיום צמיחת שריר אנושי לכל הוספה.
   הערה: מדיום הצמיחה מורכב כדלקמן: 500 מ"ל של המדיום של נשר שונה של Dulbecco עם גלוקוז גבוה, או DMEM (4.5 מ"ג / מ"ל), המכיל 10% סרום סוס, 5 ננוגרם / מ"ל אינסולין, 3 mM גלוטמין, 600 ng / mL פניצילין G וסטרפטומיצין, ו 7 mM HEPES, pH 7.4. ניתן להשתמש גם במדיום צמיחת שריר השלד הזמינה מסחרית.
3. מניחים 2-3 שברי שרירים קטנים בכל תוספת(איור 1A)ומכניסים מנות תרבות לאינקובטור תרבית התאים (5% CO₂, 37 °C (37 °F). לאחר כ-8-10 ימים ניתן לראות תאי לוויין צומחים מתוך הביופסיה של השרירים, המחוברים לתוספת(איור 1,B ו-C, חצים).
4. לשחרר מספר מספיק של תאים מן הביופסיה (לאחר כ 10-14 ימים), trypsinize כדלקמן:
   1. הסר את כל המדיום תרבית, לשטוף את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS, להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון טריפסין / EDTA (0.025% טריפסין ו 0.01% EDTA) ודגרה ב 37 °C (5 דקות.
   2. הוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה לתאים כדי לנטרל את ההשפעה של טריפסין ולהעביר את תאי הלוויין לתוך בקבוקון חדש של תרבית תא T25; להוסיף 3 מ"ל של בינוני צמיחה ומניחים את התאים באינקובטור תרבית תאים (5% CO₂, 37 °C ).
   3. שנה את מדיום הצמיחה למחרת כדי להסיר את EDTA ולאחר מכן לשנות את המדיום פעם בשבוע.
5. כאשר myoblasts הם כ 75% מפגש, trypsinize ולהעביר אותם על כיסוי זכוכית לטיפול למינין.
   הערה: כפרופורציה, תאים הגדלים בבקבוק T25 אחד יש להעביר על כיסוי זכוכית אחד בקוטר 43 מ"מ למינין. כיסוי הזכוכית צריך להיות ממוקם בתוך צלחת תרבית רקמות בקוטר 60 מ"מ המכיל 3 מ"ל של מדיום צמיחה.
6. לגדל תאים על מכסה הזכוכית במדיום צמיחה באינקובטור תרבית התא (5% CO₂, 37 °C) שינוי המדיום פעם בשבוע. ב 90% השפעה, לעבור בידול בינוני מורכב כדלקמן: DMEM גלוקוז גבוה (4.5 מ"ג / מ"ל), 0.5% אלבומין סרום בקר, 10 ng / mL גורם גדילה אפידרמיס, 0.15 מ"ג / מ"ל קריאטין, 5 ng / mL אינסולין, 200 mM גלוטמין, 600 ng / mL פניצילין G וסטרפטומיצין, ו 7 mM HEPES, pH 7.4). ניתן להשתמש גם במדיום בידול זמין מסחרית. שנה את מדיום הבידול פעם בשבוע.
7. לאחר 7-10 ימים בבידול בינוני, מיוטיובים מרובי נוקלים נראים. הערכה עבור שינויים ב- [Ca²⁺] בתוך שבוע אחד, כמתואר להלן.

4. [Ca²⁺] מדידות יחס_i נקבעות עם Fura-2

1. כיסויי זכוכית עומס למיוטיובים שגדלו עם Fura-2/AM (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר) מדולל ב- DMEM למשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F). בקצרה, להסיר את מדיום הבידול מן זכוכית מכסה תאים גדל ולהוסיף 2 מ"ל בינוני בידול טרי. הוסף 10 μL של Fura-2 AM מפתרון מלאי של 1 mM ודגרה 30 דקות בחממה תרבית תא (5% CO_2,37 °C (37 °C).
2. העבר כיסוי זכוכית לתא הזלוף ושטוף תאים עם הפתרון של קרבס רינגר המכיל 2 מ"מ CaCl₂.
3. בצע מדידות און-ליין [Ca²⁺] כמתואר לעיל בסעיף תא בודד EBV עם המטרה FLUAR טבילת מים 20x (צמצם מספרי 0.17).

תוצאות

[Ca²⁺]_i מדידות באוכלוסיות של לימפוציטים B מונצחים EBV
לימפוציטים B-לימפוציטים ראשוניים מבטאים את איזופורם RyR1 המתפקד כערוץ שחרור Ca^{2 +} במהלך קולטן אנטיגן של תאי B מגורה תהליכי איתות¹⁷. הנצחה של תאי B עם EBV, הליך המשמש באו?...

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה נוצלו בהצלחה על ידי מספר מעבדות כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות RYR1 על הומאוסטזיס סידן. הצעדים הקריטיים של הגישות המתוארות במאמר זה עוסקים בעקרות, מיומנויות וטכניקות פולחן תאים וזמינות של חומר ביולוגי. באופן עקרוני, השימוש בלימפוציטים B מונצחים EBV הוא פשוט יותר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-chloro-m-cresol	Fluka	24940
Blood collection tubes	Sarstedt	172202
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
caffeine	Merk	102584
Cascade 125+ CCD camera	Photometrics
Cascade 128+ CCD	Photometrics
Creatine	Sigma-Aldrich	C-3630
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965092
DMSO	Sigma	41639
EGTA	Fluka	3778
Epidermal Growth Factor (EGF)	Sigma-Aldrich	E9644
Ficoll Paque	Cytiva	17144002
Foetal calf serum	ThermoFisher Scientific	26140079
Fura-2/AM	Invitrogen Life Sciences	F1201
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630049
Horse serum	Thermo Fisher Scientific	16050122
Insulin	ThermoFisher Scientific	A11382II
Ionomycin	Sigma	I0634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Laminin	ThermoFisher Scientific	23017015
Lanthanum	Fluka	61490
Microperfusion system	ALA-Scientific	DAD VM 12 valve manifold
Origin Software	OriginLab Corp	Software
Pennicillin/Streptomycin	Gibco Life Sciences	15140-122
Perfusion chamber POC-R	Pecon	000000-1116-079
poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920
RPMI	ThermoFisher Scientific	21875091
Spectrofluorimeter	Perkin Elmer	LS50
Thapsigargin	Calbiochem	586005
Tissue culture dishes	Falcon	353046
Tissue culture flask	Falcon	353107
Tissue culture inserts	Falcon	353090
Trypsin/EDTA solution	ThermoFisher Scientific	25300054
Visiview	Visitron Systems GmbH	Software
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss AG
Zeiss glass coverslips	Carl Zeiss AG	0727-016