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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ici, les méthodes utilisées pour étudier l’effet fonctionnel des mutations RYR1 exprimées de manière endogène dans les lymphocytes B humains immortalisés par le virus d’Epstein Barr et les cellules satellites dérivées de la biopsie musculaire différenciées en myotubes sont décrites.

Résumé

Plus de 700 variantes du gène RYR1 ont été identifiées chez des patients atteints de différents troubles neuromusculaires, notamment une susceptibilité à l’hyperthermie maligne, des myopathies centrales et une myopathie centronucléaire. En raison des divers phénotypes liés aux mutations RYR1, il est fondamental de caractériser leurs effets fonctionnels pour classer les variantes portées par les patients pour de futures interventions thérapeutiques et identifier les variantes non pathogènes. De nombreux laboratoires se sont intéressés au développement de méthodes pour caractériser fonctionnellement les mutations RYR1 exprimées dans les cellules des patients. Cette approche présente de nombreux avantages, notamment: les mutations sont exprimées de manière endogène, RyR1 n’est pas surexprimé, l’utilisation de cellules hétérologues exprimant RyR1 est évitée. Cependant, étant donné que les patients peuvent présenter des mutations dans différents gènes en dehors de RYR1, il est important de comparer les résultats du matériel biologique d’individus hébergeant la même mutation, avec des antécédents génétiques différents. Le présent manuscrit décrit les méthodes développées pour étudier les effets fonctionnels des variantes de RYR1 exprimées de manière endogène dans: (a) le virus d’Epstein Barr immortalisé les lymphocytes B humains et (b) les cellules satellites dérivées de biopsies musculaires et différenciées en myotubes. Les changements dans la concentration intracellulaire de calcium déclenchés par l’ajout d’un activateur pharmacologique RyR1 sont ensuite surveillés. Le type de cellule sélectionné est chargé d’un indicateur de calcium fluorescent ratiométrique et les changements intracellulaires [Ca2+]sont surveillés soit au niveau de la cellule unique par microscopie à fluorescence, soit dans les populations cellulaires à l’aide d’un spectrofluoromètre. Les courbes dose-réponse agoniste au repos [Ca2+] sont ensuite comparées entre les cellules de témoins sains et les patients hébergeant des variantes de RYR1, ce qui permet de mieux comprendre l’effet fonctionnel d’une variante donnée.

Introduction

À ce jour, plus de 700 variantes de RYR1 ont été identifiées dans la population humaine et liées à divers troubles neuromusculaires, notamment la susceptibilité à l’hyperthermie maligne (MHS), la rhabdomyolyse induite par l’exercice, la maladie du noyau central (CCD), la maladie multi-minicore (MmD), la myopathie centronucléaire (CNM)1,2,3 ; néanmoins, les études visant à caractériser leurs effets fonctionnels sont à la traîne et seulement environ 10% des mutations ont été testées fonctionnellement. Différentes approches expérimentales peuvent être utilisées pour évaluer l’impact d’une variante donnée de RyR1, y compris la transfection de cellules hétérologues telles que les cellules HEK293 et COS-7 avec un codage plasmidique pour le WT et l’ADNc4mutant RYR1,5,la transduction de fibroblastes de souris dyspédiques avec des plasmides et des vecteurs codant pour le WT et l’ADNc RYR1 mutant, suivie d’une transduction avec myo-D et d’une différenciation en myotubes6 , génération de modèles animaux transgéniques porteurs du mutant RyR1s7,8,9, caractérisation de cellules de patients exprimant la variante RYR1 de manière endogène10,11,12. De telles méthodes ont permis d’établir l’impact fonctionnel de différentes mutations sur le canal RyR1 Ca2+.

Ici, les méthodes développées pour évaluer les effets fonctionnels des mutations RYR1 sont décrites. Divers paramètres de l’homéostasie calcique intracellulaire sont étudiés dans des cellules humaines exprimant de manière endogène le canal calcique RyR1, y compris les myotubes et les lymphocytes B immortalisés par le virus d’Epstein Barr (EBV). Les cellules sont obtenues à partir de patients, développées en culture et chargées d’indicateurs de calcium fluorescents ratiométriques tels que Fura-2 ou indo-1. Les paramètres qui ont été signalés comme étant modifiés en raison de mutations pathogènes de RYR1, y compris le repos [Ca2+],la sensibilité à différents agonistes pharmacologiques et la taille des réserves intracellulaires de Ca2+ sont mesurés soit au niveau de la cellule unique, en utilisant la microscopie à fluorescence, soit dans les populations cellulaires à l’aide d’un fluorimètre. Les résultats obtenus dans les cellules des porteurs de mutations sont ensuite comparés à ceux obtenus auprès de membres sains de la famille témoin. Cette approche a démontré que : (i) de nombreuses mutations liées à la MHS entraînent une augmentation du repos [Ca2+] et un déplacement vers la gauche de la courbe dose-réponse à la dépolarisation induite par KCl ou à l’activation pharmacologique de RyR1 avec le 4-chloro-m-crésol10,11,12,13; (ii) les mutations liées au CCD entraînent une diminution du pic [Ca2+]libéré par l’activation pharmacologique du RyR1 et une diminution de la taille si le Ca2+ intracellulaire stocke12,13,14,15; (iii) certaines variantes n’ont pas d’impact sur l’homéostasie Ca2+13. Les avantages de cette approche expérimentale sont: la protéine RyR1 n’est pas surexprimée et des niveaux physiologiques sont présents, les cellules peuvent être immortalisées (à la fois les cellules musculaires et les lymphocytes B) fournissant des lignées cellulaires contenant des mutations. Certains inconvénients sont liés au fait que les patients peuvent être porteurs de mutations dans plus d’un gène codant pour des protéines impliquées dans l’homéostasie du calcium et / ou le couplage de contraction d’excitation (ECC), ce qui peut compliquer les conclusions expérimentales. Par exemple, deux variantes de JP-45 ont été identifiées dans la population MHS et témoin et leur présence a eu un impact sur la sensibilité du récepteur de la dihydropyridine (DHPR) à l’activation16. Les patients doivent être disponibles, le matériel biologique doit être fraîchement collecté et les permis éthiques doivent être obtenus auprès des conseils éthiques locaux.

Protocole

Les protocoles décrits ci-dessous sont conformes aux directives éthiques de l’Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.

1. Préparation des lignées cellulaires de lymphocytes B immortalisées d’Epstein Barr11

  1. Après consentement éclairé, prélever 30 mL de sang total dans des tubes stériles traités à l’EDTA dans la bande porteuse d’une mutation RYR1 et chez des membres sains de la famille sans mutation.
    REMARQUE: Gardez toutes les solutions stériles et travaillez dans une hotte de culture tissulaire.
  2. Isoler les cellules mononucléaires du sang total par des milieux de centrifugation à gradient de densité (p. ex. Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
    1. Placer 30 mL de sang stérile dans un tube stérile conique de 50 mL.
    2. Placer l’extrémité d’une pipette Pasteur contenant le milieu de centrifugation à gradient de densité au fond du tube et superposer lentement sous le sang 20 mL de solution stérile de milieu de centrifugation à gradient de densité.
    3. Centrifuger pendant 30 min à 900 x g à 18°-20°C, sans pause.
      REMARQUE: La couche cellulaire mononucléaire apparaît comme un anneau trouble à l’interphase entre la couche de milieu de centrifugation du gradient de densité et la couche supérieure contenant du plasma enrichi en plaquettes.
  3. À l’aide d’une pipette stérile, retirez doucement la couche interphasée contenant des cellules mononucléaires (environ 3 à 5 mL) et transférez la solution dans un tube conique stérile propre de 50 mL.
  4. Ajouter 20 mL de solution saline tampon phosphate (PBS) pour rincer les cellules, centrifuger pendant 10 min à 600 x g à température ambiante et remettre la pastille en suspension dans du PBS. Répétez l’opération pour un total de trois fois; cela garantit que tous les médias sont supprimés.
  5. Après le dernier lavage, remettre les cellules en suspension dans 1 à 2 mL de milieu de culture tissulaire (milieu RPMI complété par 10% de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine et 100 unités de pénicilline et de streptomycine). Placer les cellules mononucléaires (environ 1 x 106 cellules) dans une fiole de culture tissulaire T125 contenant 20 mL de milieu de culture tissulaire.
  6. Infecter les cellules mononucléaires avec le virus d’Epstein-Barr.
    1. Utiliser des surnageants provenant de cultures de lignées cellulaires B95.8 (contenant10 2à10 3 unités transformatrices/mL stockées à -80 °C) comme source d’EBV.
    2. Remettre en suspension 1 x 106 cellules mononucléaires de l’étape 1,5 dans 20 mL de milieu de culture tissulaire et les exposer à 2 mL de surnageant de la lignée cellulaire B95,8 en présence de cyclosporine A (concentration finale de 0,2 μg/mL) pour l’infection.
  7. Placez la fiole dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et laissez les cellules se développer. Après une semaine, changez le milieu de culture.
    REMARQUE: Une fois que les cellules B commencent à proliférer, elles forment des amas reconnaissables et se développent rapidement afin que les cultures puissent être étendues et congelées.
  8. Extraire l’ADN génomique des lignées cellulaires B immortalisées par l’EBV11 pour confirmer la présence ou l’absence de la mutation donnée.

2. Mesures intracellulaires de Ca2+

REMARQUE: Les changements dans la concentration intracellulaire de calcium des lignées cellulaires de lymphocytes B transformées par EBV peuvent être surveillés dans les populations cellulaires, avec un spectrofluoromètre équipé d’un agitateur magnétique et d’un porte-cuvette réglés à 37 ° C. Alternativement, les changements de Ca2+ peuvent être surveillés dans des cellules individuelles par microscopie à fluorescence. Dans les deux cas, les cellules sont retirées de la fiole de culture tissulaire, lavées deux fois avec la solution de Krebs Ringer (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2,20 mM HEPES, 1 mM NaHPO4,5,5 mM de glucose, pH 7,4 contenant 1 mM caCl2)et comptées.

  1. Pour les expériences dans les populations cellulaires à l’aide d’un spectrofluoromètre11,13,14
    1. Remettre en suspension des cellules à une concentration finale de 1 x 107 cellules/mL dans la solution de Krebs Ringer et incuber à 37°C pendant 30 min avec une concentration finale de 5 μM de Fura-2/AM.
    2. Centrifuger les cellules à 900 x g pendant 10 min et les remettre en suspension dans la solution de Krebs Ringer à une concentration de 2 x 106 cellules/mL.
    3. Mesurer les changements de fluorescence (rapport 340/380 nm) à l’aide d’un spectrofluoromètre équipé d’un agitateur magnétique réglé à la vitesse maximale et réglé à 37 °C.
    4. Juste avant l’expérience, les cellules tournent à 900 x g pendant 5 min dans une microcentrifugeuse et remettent rapidement en suspension la pastille dans 1,5 mL de solution de Krebs Ringer avec 0,5 mM d’EGTA mais pas de Ca2+ajouté.
    5. Placez les cellules dans une cuvette spectrofluoromètre en verre de 3 mL et enregistrez le rapport de fluorescence (excitation de 340 nm/380 nm, émission de 510 nm).
    6. Obtenir une ligne de base stable (environ 30 secondes), ajouter la concentration sélectionnée d’agoniste RyR1 (4-chloro-m-crésol, ou 4-cmc) et enregistrer le transitoire de calcium.
      REMARQUE: Une solution mère de 300 mM de 4-cmc fabriquée en DMSO est utilisée comme réactif de départ. Cette solution peut être faite à l’avance, aliquote et conservée à -20 °C pendant plusieurs mois.
    7. Effectuer des expériences pour différentes concentrations de 4-cmc.
      REMARQUE: Inclure 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM à 1 mM pour générer une courbe dose-réponse de l’agoniste par rapport au changement de [Ca2+]. Les différentes concentrations de 4-cmc sont obtenues en ajoutant le volume approprié de 4-cmc de la solution mère, directement dans la cuvette contenant les cellules chargées de Fura-2. Par exemple, pour une concentration finale de 300 μM 4-cmc, 1,5 μL de la solution mère est ajouté à la cuvette contenant 1,5 mL de cellules dans la solution de Krebs Ringer. Pour des concentrations agonistes plus faibles, la solution mère de 300 mM doit être diluée à 75 mM avec du DMSO et le volume approprié ajouté à la cuvette contenant 1,5 mL de cellules dans la solution de Krebs Ringer.
    8. Ajouter 400 nM de thapsigargin aux cellules pour calculer la quantité totale de Ca2+ présente dans les réserves intracellulaires. Enregistrez le pic Ca2+.
    9. Tracer le pic de calcium induit par une concentration donnée de 4-cmc par rapport au pic de calcium induit par la thapsigargin, qui est considéré comme 100% et construire une courbe dose-réponse de 4-cmc comparant les cellules d’une proband et d’un parent sain
  2. Pour les expériences sur des cellules individuelles13
    1. Diluer la poly-L-lysine 1:10 dans H2O stérile et prétraiter les couvercles en verre pendant 30 min. Laisser sécher à l’air libre sous une hotte de culture tissulaire stérile.
    2. Remettez en suspension les lymphocytes B transformés par EBV à une concentration finale de 1 x 106 cellules/mL dans la solution de Krebs Ringer contenant 1 mM de CaCl2 et ajoutez une concentration finale de 5 μM de Fura-2/AM.
    3. Placer 1 mL de cellules sur les couvercles traités à la poly-L-lysine et incuber à 37 °C dans un incubateur de culture cellulaire humidifié pendant 30 minutes pour permettre aux cellules EBV de coller au couvercle en verre pendant le chargement.
    4. Placez le couvercle dans la chambre de perfusion et commencez la perfusion (à raison de 2 mL/min) avec la solution de Krebs Ringer contenant 1 mM de Ca2+.
    5. Utilisez un microscope fluorescent inversé (équipé d’un objectif d’immersion dans l’huile 40x (ouverture numérique de 0,17), des filtres (BP 340/380, FT 425, BP 500/530) pour enregistrer des mesures en ligne, avec un dispositif de couplage de charge (CCD) contrôlé par logiciel.
    6. Acquérir des images à des intervalles de 1 s à un temps d’exposition fixe (100 ms pour les longueurs d’onde d’excitation de 340 et 380 nm). Utilisez un logiciel d’imagerie pour analyser les changements de fluorescence. Mesurer la valeur moyenne des pixels pour chaque cellule à des longueurs d’onde d’excitation de 340 et 380 nm13.
    7. Pour obtenir une stimulation cellulaire, utilisez un stimulateur de perfusion cellulaire avec 12 valves et ajoutez différentes concentrations de 4-cmc. La valve de rinçage contient la solution de Krebs Ringer sans ajout de Ca2+ plus 100 μM La3+ pour surveiller la libération de calcium des réserves intracellulaires uniquement.
    8. Construire une courbe dose-réponse de 4-cmc par rapport au changement de [Ca2+], comme décrit ci-dessus.

3. Préparation de myotubes humains à partir de biopsies musculaires10,12,15

NOTE: Différentes méthodes ont été utilisées par différents laboratoires pour obtenir des myoblastes et des myotubes dérivés de cellules satellites. Vous trouverez ci-dessous la description de la méthode utilisée à Bâle.

  1. Rincer la biopsie musculaire avec du PBS stérile pour éliminer l’excès de sang et couper en petits fragments d’environ 0,5-1 mm.
  2. Préparez 6 plats de culture tissulaire bien avec insert. Ajouter 1,5 mL de milieu de croissance musculaire humaine à chaque puits et 0,5 mL de milieu de croissance musculaire humaine à chaque insert.
    REMARQUE: Le milieu de croissance est composé comme suit: 500 mL du milieu d’Eagle modifié de Dulbecco avec un taux élevé de glucose, ou DMEM (4,5 mg / mL), contenant 10% de sérum de cheval, 5 ng / mL d’insuline, 3 mM de glutamine, 600 ng / mL de pénicilline G et de streptomycine, et 7 mM HEPES, pH 7,4. Un milieu de croissance musculaire squelettique disponible dans le commerce peut également être utilisé.
  3. Placer 2-3 petits fragments musculaires dans chaque insert(Figure 1A)et placer des boîtes de culture dans l’incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 °C). Après environ 8 à 10 jours, on peut voir des cellules satellites se développer hors de la biopsie musculaire et entourant celle-ci, attachée à l’insert(Figure 1,B et C, flèches).
  4. Libérer un nombre suffisant de cellules de la biopsie (après environ 10-14 jours), trypsiniser comme suit:
    1. Retirer tout milieu de culture, rincer les cellules une fois avec 1 mL de PBS, ajouter 0,5 mL de solution de trypsine/EDTA (0,025 % de trypsine et 0,01 % d’EDTA) et incuber à 37 °C pendant 5 min.
    2. Ajouter 1 mL de milieu de croissance aux cellules pour neutraliser l’effet de la trypsine et transférer les cellules satellites dans une nouvelle fiole de culture cellulaire T25; ajouter 3 mL de milieu de croissance et placer les cellules dans un incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 °C).
    3. Changez le milieu de croissance le lendemain pour supprimer l’EDTA et changez ensuite le milieu une fois par semaine.
  5. Lorsque les myoblastes sont confluents à environ 75%, essayez-les et transférez-les sur des couvercles en verre traité à la laminine.
    REMARQUE: En proportion, les cellules qui poussent dans une fiole T25 doivent être transférées sur un couvercle en verre traité à la laminine de 43 mm de diamètre. Le couvercle en verre doit être placé dans une plaque de culture tissulaire de 60 mm de diamètre contenant 3 mL de milieu de croissance.
  6. Cultiver des cellules sur le revêtement en verre dans un milieu de croissance dans un incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 ° C) en changeant le milieu une fois par semaine. À 90 % de confluence, passer à un milieu de différenciation composé comme suit : DMEM à haute teneur en glucose (4,5 mg/mL), albumine sérique bovine à 0,5 %, facteur de croissance épidermique de 10 ng/mL, créatine à 0,15 mg/mL, insuline à 5 ng/mL, glutamine de 200 mM, pénicilline G et streptomycine de 600 ng/mL, et 7 mM d’HEPES, pH 7,4). Un support de différenciation disponible dans le commerce peut également être utilisé. Changez le support de différenciation une fois par semaine.
  7. Après 7-10 jours dans le milieu de différenciation, des myotubes multinucléés sont visibles. Évaluez les changements dans [Ca2+] dans un délai d’une semaine, comme décrit ci-dessous.

4. [Ca2+]i mesures de rapport déterminées avec Fura-2

  1. Chargez des myotubes cultivés avec du Fura-2/AM (concentration finale de 5 μM) dilués dans du DMEM pendant 30 min à 37 °C. En bref, retirez le milieu de différenciation des cellules cultivées en verre et ajoutez 2 mL de milieu de différenciation frais. Ajouter 10 μL de Fura-2 AM à partir d’une solution mère de 1 mM et incuber 30 min dans un incubateur de culture cellulaire (5% CO2,37 °C).
  2. Transférer le couvercle de verre dans la chambre de perfusion et rincer les cellules avec la solution de Krebs Ringer contenant 2 mM de CaCl2.
  3. Effectuer des mesures en ligne [Ca2+] comme décrit ci-dessus dans la section EBV à cellule unique avec l’utilisation d’un objectif FLUAR à immersion dans l’eau 20x (ouverture numérique de 0,17).

Résultats

[Ca2+]i mesures dans des populations de lymphocytes B immortalisés par le VEB
Les lymphocytes B primaires expriment l’isoforme RyR1 qui fonctionne comme un canal de libération de Ca2+ au cours des processus de signalisation stimulés par le récepteur de l’antigène des cellules B17. L’immortalisation des lymphocytes B avec EBV, une procédure couramment utilisée par l...

Discussion

Les protocoles décrits dans cet article ont été utilisés avec succès par plusieurs laboratoires pour étudier l’impact des mutations RYR1 sur l’homéostasie du calcium. Les étapes critiques des approches décrites dans le présent document portent sur la stérilité, les compétences et les techniques de culture cellulaire et la disponibilité du matériel biologique. En principe, l’utilisation des lymphocytes B immortalisés par l’EBV est plus simple et permet de générer des lignées cellulaires contenan...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les travaux décrits dans ce manuscrit ont été soutenus par des subventions du Fonds national suisse (FNS) et de la Fondation suisse du muscle.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
4-chloro-m-cresolFluka24940
Blood collection tubesSarstedt172202
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-AldrichA7906
caffeineMerk102584
Cascade 125+ CCD cameraPhotometrics
Cascade 128+ CCDPhotometrics
CreatineSigma-AldrichC-3630
DMEMThermoFisher Scientific11965092
DMSOSigma41639
EGTAFluka3778
Epidermal Growth Factor (EGF)Sigma-AldrichE9644
Ficoll PaqueCytiva17144002
Foetal calf serumThermoFisher Scientific26140079
Fura-2/AMInvitrogen Life SciencesF1201
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050061
HEPESThermoFisher Scientific15630049
Horse serumThermo Fisher Scientific16050122
InsulinThermoFisher ScientificA11382II
IonomycinSigmaI0634
KClSigma-AldrichP9333
LamininThermoFisher Scientific23017015
LanthanumFluka61490
Microperfusion systemALA-ScientificDAD VM 12 valve manifold
Origin SoftwareOriginLab CorpSoftware
Pennicillin/StreptomycinGibco Life Sciences15140-122
Perfusion chamber POC-RPecon000000-1116-079
poly-L-lysineSigma-AldrichP8920
RPMIThermoFisher Scientific21875091
SpectrofluorimeterPerkin ElmerLS50
ThapsigarginCalbiochem586005
Tissue culture dishesFalcon353046
Tissue culture flaskFalcon353107
Tissue culture insertsFalcon353090
Trypsin/EDTA solutionThermoFisher Scientific25300054
VisiviewVisitron Systems GmbHSoftware
Zeiss Axiovert S100 TV microscopeCarl Zeiss AG
Zeiss glass coverslipsCarl Zeiss AG0727-016

Références

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