Pruebas de toxicidad en organoides retinianos humanos para el descubrimiento farmacéutico

Resumen

Aquí presentamos un protocolo paso a paso para generar organoides retinianos humanos maduros y utilizarlos en un ensayo de toxicidad de fotorreceptores para identificar candidatos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).

Resumen

Los organoides proporcionan una plataforma prometedora para estudiar el mecanismo y los tratamientos de la enfermedad, directamente en el contexto del tejido humano con la versatilidad y el rendimiento del cultivo celular. Los organoides retinianos humanos maduros se utilizan para detectar posibles tratamientos farmacéuticos para la enfermedad degenerativa de la retina relacionada con la edad telangiectasia macular tipo 2 (MacTel).

Recientemente hemos demostrado que MacTel puede ser causado por niveles elevados de una especie lipídica atípica, los desoxiesfingolípidos (deoxySLs). Estos lípidos son tóxicos para la retina y pueden conducir a la pérdida de fotorreceptores que se produce en pacientes con MacTel. Para detectar la capacidad de los fármacos para prevenir la toxicidad de los fotorreceptores deoxySL, generamos organoides retinianos humanos a partir de una línea de células madre pluripotentes (iPSC) no inducida por MacTel y los maduramos hasta una edad postmitótica en la que desarrollan todas las células derivadas del linaje neuronal de la retina, incluidos los fotorreceptores funcionalmente maduros. Los organoides retinianos se trataron con un metabolito deoxySL y la apoptosis se midió dentro de la capa fotorreceptora mediante inmunohistoquímica. Utilizando este modelo de toxicidad, se examinaron compuestos farmacológicos que previenen la muerte de los fotorreceptores inducida por desoxiSL. Utilizando un enfoque de candidato dirigido, determinamos que el fenofibrato, un fármaco comúnmente prescrito para el tratamiento del colesterol alto y los triglicéridos, también puede prevenir la toxicidad del desoxiSL en las células de la retina.

La prueba de toxicidad identificó con éxito un medicamento aprobado por la FDA que puede prevenir la muerte de los fotorreceptores. Este es un hallazgo directamente procesable debido al modelo altamente relevante para la enfermedad probado. Esta plataforma se puede modificar fácilmente para probar cualquier número de factores estresantes metabólicos y posibles intervenciones farmacológicas para el futuro descubrimiento de tratamientos en enfermedades de la retina.

Introducción

El modelado de enfermedades humanas en cultivos celulares y modelos animales ha proporcionado herramientas invaluables para el descubrimiento, modificación y validación de terapias farmacológicas, lo que les permite avanzar del fármaco candidato a la terapia aprobada. Aunque una combinación de modelos in vitro y no humanos in vivo ha sido durante mucho tiempo un componente crítico de la línea de desarrollo de fármacos, con frecuencia no logran predecir el rendimiento clínico de los nuevos candidatos a fármacos¹. Existe una clara necesidad de desarrollar tecnologías que cierren la brecha entre los monocultivos celulares humanos simplistas y los ensayos clínicos. Los recientes avances tecnológicos en cultivos de tejidos tridimensionales autoorganizados, los organoides, han mejorado su fidelidad a los tejidos que modelan, convirtiéndolos en herramientas prometedoras en la línea de desarrollo preclínico^{de fármacos 2}.

Una ventaja importante del cultivo de células humanas sobre los modelos in vivo no humanos es la capacidad de replicar las complejidades específicas del metabolismo humano que pueden variar considerablemente incluso entre vertebrados de orden superior como humanos y ratones³. Sin embargo, esta especificidad puede verse eclipsada por una pérdida en la complejidad del tejido; Tal es el caso del tejido retiniano, donde múltiples tipos de células están intrincadamente entrelazadas y tienen una interacción metabólica simbiótica única entre subtipos celulares que no pueden replicarse en un monocultivo⁴. Los organoides humanos, que proporcionan un facsímil de tejidos humanos complejos con la accesibilidad y escalabilidad del cultivo celular, tienen el potencial de superar las deficiencias de estas plataformas de modelado de enfermedades.

Los organoides retinianos derivados de células madre han demostrado ser particularmente fieles en el modelado del complejo tejido de la retina neural humana⁵. Esto ha hecho del modelo organoide retiniano una tecnología prometedora para el estudio y tratamiento de la enfermedad retiniana ^6,7. Hasta la fecha, gran parte del modelado de la enfermedad en organoides retinianos se ha centrado en enfermedades retinianas monogénicas donde los organoides retinianos se derivan de líneas iPSC con variantes genéticas causantes de enfermedades⁷. Estas son generalmente mutaciones altamente penetrantes que se manifiestan como fenotipos de desarrollo. Se ha realizado menos trabajo de manera efectiva en enfermedades del envejecimiento donde las mutaciones genéticas y los factores estresantes ambientales afectan el tejido que se ha desarrollado normalmente. Las enfermedades neurodegenerativas del envejecimiento pueden tener una herencia genética compleja y contribuciones de factores estresantes ambientales que son inherentemente difíciles de modelar utilizando cultivos celulares a corto plazo. Sin embargo, en muchos casos, estas enfermedades complejas pueden unirse en factores estresantes celulares o metabólicos comunes que, cuando se prueban en un tejido humano completamente desarrollado, pueden proporcionar información poderosa sobre las enfermedades neurodegenerativas del envejecimiento⁸.

La enfermedad degenerativa macular de inicio tardío, la telangiectasia macular tipo II (MacTel), es un gran ejemplo de una enfermedad neurodegenerativa genéticamente compleja que se fusiona en un defecto metabólico común. MacTel es una enfermedad degenerativa retiniana poco común del envejecimiento que resulta en la pérdida de fotorreceptores y glía de Müller en la mácula, lo que lleva a una pérdida progresiva en la visión central 9,10,11,12,13. En MacTel, una herencia genética indeterminada, posiblemente multifactorial, impulsa una reducción común de la serina circulante en los pacientes, lo que resulta en un aumento de una especie lipídica neurotóxica llamada desoxiesfingolípidos (deoxySL)^14,15. Para probar que la acumulación de deoxySL es tóxica para la retina y validar posibles terapias farmacéuticas, desarrollamos este protocolo para evaluar la toxicidad de los fotorreceptores en organoides retinianos humanos¹⁴.

Aquí esbozamos un protocolo específico para diferenciar los organoides retinianos humanos, establecer un ensayo de toxicidad y rescate utilizando organoides y cuantificar los resultados. Proporcionamos un ejemplo exitoso en el que determinamos la toxicidad específica del tejido de un agente sospechoso de causar enfermedades, deoxySL, y validamos el uso de un medicamento genérico seguro, fenofibrato, para el tratamiento potencial de la toxicidad retiniana inducida por deoxySL. Trabajos previos han demostrado que el fenofibrato puede aumentar la degradación de deoxySL y disminuir el deoxySL circulante en pacientes, sin embargo, su eficacia en la reducción de la toxicidad retiniana inducida por deoxySL no ha sido probada^16,17. Aunque presentamos un ejemplo específico, este protocolo se puede utilizar para evaluar el efecto de cualquier número de factores estresantes metabólicos / ambientales y posibles fármacos terapéuticos en el tejido de la retina.

Protocolo

1. Descongelación, paso y expansión de iPSCs/ESCs

NOTA: Para todos los pasos de cultivo celular, utilice las mejores prácticas para mantener un cultivo celular estéril.

1. Cubra una placa de cultivo celular de 6 pocillos con medio de matriz de membrana basal.
   1. Para preparar 1x de este medio, siga las especificaciones del producto o diluya el medio de matriz fría de 75 μL con 9 ml de DMEM/F12. Agregue 1.5 ml de 1x medio recién preparado por pocillo en un plato de 6 pocillos. Incubar a 37 °C durante 30 min.
   2. Aspirar el medio de la matriz de la membrana basal y enjuagar cada pocillo con 3 ml de DMEM/F12. Añadir 2 ml de DMEM/F12 e incubar a 37 °C hasta su uso. Use el plato el día que esté preparado.
2. Preparar una solución madre de 10 mM de inhibidor de roca (diclorhidrato Y-27632) en PBS y almacenar a -20 °C hasta su uso.
3. Descongele un vial de iPSCs/ESCs en medio DMEM/F12 y centrifugar a 400 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio mTeSR. Placa 1 vial de células en un pocillo recubierto de 6 pocillos en medios mTeSR con 10 μM de inhibidor de roca (diclorhidrato Y-27632) e incubar durante la noche en la incubadora. Al día siguiente, aspire fuera de los medios y vuelva a agregar solo mTeSR.
   NOTA: Cambie los medios todos los días hasta que pasen.
4. Preparar 0,5 mM de EDTA en PBS diluyendo 500 μL de 0,5 M EDTA en 500 ml de PBS.
5. Células de paso cuando alcanzan el 80-90% de confluencia. Dividir las células 1:3 o 1:6 por pocillo, dependiendo de la tasa de crecimiento de las células.
   1. Para eliminar las células adheridas de la placa, aspirar los medios e incubar con 0,5 mM de EDTA en PBS durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire la solución de EDTA y levante las células expulsando con fuerza 1 ml de medio mTeSR a las células con una pipeta p1000.
   2. Continúe aspirando y expulsando con fuerza el medio y las células mTeSR, hasta 5x, para eliminar las células restantes adheridas. Células en placa sobre una placa fresca de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal, con medio mTeSR. Continúe reemplazando los medios diariamente hasta que las placas vuelvan a alcanzar el 80-100% de confluencia.
6. Una vez que las células se hayan expandido a una placa completa de 6 pocillos y hayan alcanzado una confluencia del 80-100%, reserve un pozo para expandir la línea celular para diferenciaciones posteriores o para congelar para la criopreservación. Use los cinco pozos restantes para comenzar el proceso de diferenciación haciendo cuerpos embrioides.

2. Fabricación de cuerpos embrioides (EB)

NOTA: Las recetas de medios de formación y diferenciación de EB se derivan de los protocolos de Cowan et ^al.5, Ohlemacher et al.18 y Zhong et ^al.19.

1. Prepare 1x solución Dispase y medios de inducción neural (NIM) como se describe a continuación.
   1. Prepare 10 mg/ml de solución madre 5x de Dispase disolviendo el polvo en DMEM/F12. Filtro estéril con filtro de 0,22 μm. Conservar 1 ml de alícuotas a -20 °C hasta su uso.
   2. Usando la solución 5x Dispasa, prepare 1 mL/pocillo de 2 mg/mL Dispasa en DMEM/F12. Calentar la solución a 37 °C durante 30 min.
   3. Prepare NIM suplementando DMEM/F12 con suplemento de N2 al 1%, NEAA MEM al 1% y heparina de 2 mg/ml a 180 U/mg. NIM puede almacenarse a 4 °C hasta por un mes.
2. Prepare y caliente 16 ml de mezcla 3:1 de solución mTeSR:NIM (12mL:4mL) a temperatura ambiente.
3. Retire las células diferenciadas y agregue la solución tibia de Dispasa.
   1. Eliminar las células diferenciadoras del cultivo celular iPSCs/ESCs. Bajo un endoscopio de disección, raspe las colonias blancas opacas con una punta de pipeta p10. Aspirar el medio mTeSR de los pocillos de cultivo. Esto eliminará los grupos diferenciados que acaban de rasparse.
   2. Añadir inmediatamente la solución de Dispasa precalentada e incubar a 37 °C hasta que la mayoría de los bordes de las colonias celulares comiencen a curvarse bajo un microscopio. Esto tomará 4-8 min.
      NOTA: El tiempo de incubación de las células en Dispase tendrá que ser determinado para cada laboratorio. La duración puede diferir entre las líneas celulares y se requiere una incubación más larga para las células que han sido plateadas durante 3 días o más. Las iPSC/ESCs de crecimiento lento que tardan más de 3 días en alcanzar la confluencia comenzarán a adherirse con mayor fuerza a la placa, lo que dificultará el levantamiento de las células. Para las células de crecimiento lento, intente pasar las células a 1: 2 para la expansión en una placa completa de 6 pocillos para reducir el tiempo desde la placa hasta la confluencia.
4. Aspire la solución y agregue suavemente al menos 2 ml de medio DMEM/F12 por pocillo. Agregue DMEM / F12 medio lentamente al lado del pozo teniendo cuidado de no desalojar las células.
   1. Aspire el medio DMEM / F12 y luego agregue con fuerza 1 ml fresco de DMEM / F12 directamente a las células para levantar las colonias celulares de la placa. Con una pipeta p1000 aspire repetidamente y expulse con fuerza DMEM/F12 en el pozo, hasta 5x, para desalojar tantas colonias celulares como sea posible.
      NOTA: Las iPSC/ESC diferenciadoras/diferenciadas se adhieren a la placa más que las iPSC/ESCs indiferenciadas. Las células que no se desprenden con el pipeteo repetido es mejor dejarlas atrás. El pipeteo excesivo mata las células y reduce la eficiencia de la producción de EB. Los grupos celulares tendrán entre 100 y 400 células por grupo.
5. Transfiera las colonias flotantes a un tubo cónico de 15 ml y enjuague los pozos con un medio DMEM/F12 adicional de 1 ml por pocillo para recolectar cualquier colonia flotante restante.
6. Permita que las colonias flotantes se asienten por gravedad durante no más de 5 minutos. Una vez asentado, retire todos menos 1-2 ml de sobrenadante. Tenga cuidado de no agitar el pellet blando en la parte inferior.
7. Resuspender el pellet en medio precalentado 3:1 mTeSR:NIM y transferirlo a un matraz T75 de fijación ultrabaja. Incubar durante la noche para permitir que se formen EB. Esto se considerará Día 0 de diferenciación.
8. Cambiar gradualmente los medios a NIM para comenzar la diferenciación de EB en progenitores neuronales.
   1. Al día siguiente, retire el medio y reemplácelo con 10 ml de medio 1:1 mTeSR:NIM. Para eliminar los medios del cultivo de EB que flota libremente, incline el matraz hacia arriba de modo que los EB se acumulen en la esquina inferior del matraz. Aspire el sobrenadante, asegurándose de no aspirar ninguno de los EB en el pellet en la parte inferior.
   2. Al día siguiente, sustituya el medio por 10 ml de medio 1:3 mTeSR:NIM.
   3. Al día siguiente, reemplace los medios con un medio NIM completo. Continúe cambiando de medio cada 2 días con medio NIM hasta 7 días después del tratamiento con Dispase.

3. Recubrimiento de EBs e iniciación de la diferenciación retiniana neural

1. Una semana después del tratamiento con Dispase, la placa de EBs flotantes libres en una placa de 6 pocillos recubierta con un medio de matriz de membrana basal reducida por factor de crecimiento. Para recubrir la placa, consulte el paso 1.1.
   1. Aspirar los medios gastados de los EB y reemplazarlos con 12 ml de NIM.
   2. Asegure una distribución uniforme de EB en cada pocillo agitando los medios que contienen EB para resuspender los EB, luego retire rápidamente 1/6 del medio (2 ml) y dispense en un pozo. Repita para los pozos restantes.
   3. Antes de incubar, agite suavemente el plato, hacia adelante y hacia atrás y luego de lado a lado, para distribuir uniformemente los EB. Si los EB se agrupan en el medio, no se diferenciarán adecuadamente.
      NOTA: La densidad del recubrimiento es crítica para la diferenciación. Asegúrese de emplatar más de 30 EB por pozo. Si la producción de EBs no fue eficiente, distribuya los EBs en menos pozos.
2. Cambie los medios diariamente con NIM medium. Mantenga el nivel de medios en los pozos en ~ 3 ml. Al cambiar los medios, retire todos menos 1 ml de medios para no secar los EB plateados, y agregue 2 ml de medios suavemente al costado del pocillo para no levantar las células de la placa.
3. Nueve días después del recubrimiento de los EB, comience a cambiar los medios de NIM a Retinal Differentiation Media (RDM) en el transcurso de dos días.
   1. Prepare RDM mezclando lo siguiente: 48% DMEM / F12 (1: 1) y 48% DMEM suplementado con 2% B27 suplemento sin vitamina A, 1% MEM NEAA y 1% Pen-Strep. Filtro esterilizar utilizando filtro de 0,20 μm. RDM se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de un mes.
   2. El primer día, cambie los medios a una combinación 1:1 de NIM:RDM. El segundo día, cambie los medios a RDM. Todos los días posteriores, alimente las células RDM.
      NOTA: Durante las próximas semanas, los EB plateados formarán progenitores retinianos neurales que comenzarán a generar RPE visiblemente pigmentado.

4. Hacer organoides flotantes y mantener cultivos de organoides flotantes

1. Fragmentar EBs chapados a los 28 días después del tratamiento inicial con Dispase (21 días después del recubrimiento EB) usando un bisturí estéril para cortar una rejilla de 1-2^mm2 en EBs chapados. Esto separará las colonias progenitoras de la retina en pequeños trozos para que más adelante en el desarrollo no se vuelvan demasiado grandes y necrosadas por un intercambio insuficiente de nutrientes en su centro.
2. Separar EBs chapados.
   1. Para hacerlo, primero agregue 2 ml adicionales de RDM a cada pozo. Luego aspire ~ 1000 μL de medios de los pocillos usando una pipeta p1000. Ahora expulse con fuerza el medio directamente sobre los EB chapados con la punta completamente sumergida.
   2. Repita esto hasta que todas las celdas se hayan levantado de la placa. Mantenga la punta sumergida durante la expulsión del medio y no empuje el émbolo de la pipeta más allá de la primera parada para evitar burbujas.
3. Resuspender los trozos de EB desprendidos nacientemente en un erlenmeyer de plástico estéril de 125 ml y llenar el matraz con ~40 ml de medio RDM. Colocar el matraz en un agitador orbital colocado en una incubadora estándar. Ajuste la velocidad del agitador a 130-140 RPM (ajuste de velocidad 3).
   NOTA: El cultivo de organoides en una coctelera evita que se peguen entre sí mientras se cultivan a una mayor concentración de organoides. Los biorreactores también logran los mismos fines, pero un agitador es menos costoso.
4. Alimente los organoides con un cambio parcial de medios, reemplazando aproximadamente 12 ml de RDM 2-3 veces por semana, dependiendo de qué tan amarillo se ponga el medio. Los primeros organoides no requerirán mucha alimentación, pero a medida que crecen, requerirán cambios de medios más frecuentes con más medios.
5. Pode los organoides cada dos semanas para eliminar los organoides no retinianos, demasiado grandes y moribundos. Esto evita el desperdicio de medios y mejora la salud de los organoides retinianos restantes.
   1. Transfiera las células de su matraz a una placa de 6 pocillos o a una placa de 10 cm con una pipeta de 5 ml. Mantenga organoides que muestren neuroepitelio estratificado (Figura 1A, asterisco). Estos organoides son transparentes y blancos.
   2. Clasificar y eliminar los organoides retinianos mal formados o demasiado grandes, y los organoides no retinianos con una pipeta de 5 ml. Estos generalmente serán opacos y amarillentos (Figura 1A). También elimine cualquier cosa que no parezca un neuroepitelio estratificado. Las primeras podas requerirán mucha mano de obra, pero serán mucho más fáciles cada vez que los organoides se vuelvan más grandes y homogéneos (Figura 1B).

5. Mantener organoides maduros y diferenciarlos a un tejido retiniano postmitótico

1. En el día 56 (semana 8) después del tratamiento inicial con Dispase para la formación de EB (28 días después del cultivo de EB desalojados en un matraz), cambie los medios organoides a RDM+. Esto proporcionará nutrientes adicionales a los organoides completamente maduros como el tejido retiniano.
   1. Preparar 100 mM de taurina en PBS. Conservar las alícuotas a -20 °C hasta su uso.
   2. Prepare RDM + complementando RDM con 10% de FBS, 100 μM de taurina y 2 mM de suplemento de glutamina comercial. Filtro esterilizar utilizando filtro de 0,20 μm.
   3. Continúe cambiando los medios RDM+ 2-3 veces a la semana.
2. En la semana 17-18 (tratamiento post-Dispasa), transfiera organoides del erlenmeyer a una placa de 6 pocillos de fijación ultrabaja utilizando una pipeta de 5 ml. Durante la primera semana, continúe podando y separando los organoides entre sí diariamente hasta que los organoides ya no se peguen entre sí. La densidad óptima es de 10-15 organoides por pocillo. Cambie los medios 2-3 veces a la semana.
   NOTA: Reduzca el número de organoides por pocillo si los organoides se adhieren con frecuencia entre sí o si el medio se está volviendo muy amarillo entre los cambios de medios.
3. Espere que los organoides se vuelvan completamente post-mitóticos en la semana 18⁵ cuando las células neurales de la retina estén presentes en todo momento. Para la semana 24, verifique la formación de segmentos externos rudimentarios en el exterior del organoide. Para la semana 26-28 asegúrese de que los segmentos externos sean gruesos en el exterior de los organoides (Figura 1C). Realizar ensayos de toxicidad después de la semana 26 cuando los organoides hayan definido segmentos externos que signifiquen un estado de diferenciación maduro.
   NOTA: Utilice sólo organoides retinianos bien diferenciados para el ensayo de toxicidad. La realización de ensayos de toxicidad en organoides con segmentos externos bien definidos permitirá su identificación.

6. Desoxisfinanina (deoxySA) y tratamiento farmacológico

NOTA: Aquí se presenta un tratamiento único de fenofibrato para rescatar la toxicidad de deoxySA durante el período de 4 días (Figura 2). Sin embargo, la concentración de deoxySA añadida a los organoides, la duración del tratamiento con deoxySA en organoides y el tipo de fármaco utilizado para rescatar la toxicidad¹⁴ pueden modificarse según las necesidades experimentales para evaluar la toxicidad y el rescate de la toxicidad.

1. Preparar 1 mM de solución madre de deoxySA en etanol. Conservar a -20 °C durante 1 mes. Alternativamente, se puede preparar una solución madre de deoxySA en DMSO.
2. Realizar una dilución seriada de deoxySA para determinar una concentración tóxica apropiada de deoxySA para el rescate de fármacos.
   NOTA: Primero determine una concentración de deoxySA que resultará en suficiente muerte celular para medir un efecto de rescate. Si la concentración es demasiado alta, la respuesta tóxica resultará en la desintegración del organoide y no se observará ningún rescate. Si la respuesta tóxica es demasiado baja, será difícil observar un efecto de rescate significativo. La respuesta tóxica de deoxySA puede variar de un laboratorio a otro y de un lote a otro de deoxySA.
   1. Diluir 1 mM de solución madre de desoxiSA a concentraciones de 0,5 μM, 1 μM y 2 μM en 3 ml de RDM+, cada una. Añadir 3 μL de etanol a RDM+ para preparar un tratamiento de control.
   2. Bajo un microscopio de disección, use una sonda estéril para seleccionar 4 grupos de organoides con un mínimo de 5 organoides por grupo. Divida los grupos en pocillos separados de una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja. Seleccione organoides que tengan aproximadamente el mismo tamaño y forma.
   3. Aspire la mayor cantidad posible de RDM+ de los organoides. A cada pocillo de organoides, añadir una concentración de deoxySA en RDM+. Agregue el control del vehículo al cuarto pozo de organoides.
   4. Después de dos días de cultivo en deoxySA o vehículo, reemplace el medio con diluciones de deoxySA correspondientes recién preparadas en RDM +.
   5. En el cuarto día de tratamiento, continúe con el paso 7 para procesar y analizar los organoides para la muerte celular. Una vez que se haya seleccionado una concentración de deoxySA, continúe con el paso 6.3 para tratar con fenofibrato.
      NOTA: La muerte celular diana en el grupo de tratamiento con deoxySA seleccionado es de 5 a 20 células TUNEL positivas por 10.000 μm². Los organoides no deben desintegrarse por el toque de una sonda durante el transcurso del tratamiento.
3. Tratar los organoides con la dosis tóxica seleccionada de deoxySA y fenofibrato.
   1. Preparar una solución madre de fenofibrato de 40 mM en DMSO. Conservar a -20 °C durante un máximo de 1 año.
   2. Preparar los medios de tratamiento farmacológicos: En 3 ml de RDM+, diluir 1 mM de solución madre de desoxiSA a 1 μM de desoxiSA y diluir 40 mM de solución madre de fenofibrato a 20 μM.
   3. Prepare los medios de tratamiento con desoxiSA: En 3 ml de RDM+, diluya 1 mM de solución madre de desoxiSA a 1 μM de desoxiSA y agregue 1,5 μL de DMSO.
   4. Prepare el medio de control: En 3 ml RDM+, agregue 3 μL de etanol y 1.5 μL de DMSO.
   5. Bajo un microscopio de disección utilizando una sonda estéril, seleccione tres grupos de organoides con un mínimo de cinco organoides por grupo. Divida los grupos en pocillos separados de una placa de 6 pocillos de fijación ultra baja.
   6. Añadir los tratamientos preparados (deoxySA, deoxySA + fenofibrato, o control) a los organoides. Después de dos días, cambie los medios en los pocillos con RDM + recién preparado complementado con las correspondientes soluciones de desoxiSA / fenofibrato / control.
   7. En el cuarto día de tratamiento proceder al paso 7 para procesar y ensayar organoides para la muerte celular (Figura 2).

7. Incrustación y criosección de organoides

1. Prepare PFA fresca al 4% agregando 1 ml de ampolla de PFA al 16% a 3 ml de PBS.
2. Retire los medios RDM + de los organoides y enjuague una vez con PBS. Elimine la mayor cantidad posible de PBS de los organoides. Agregue 2 ml de PFA al 4% recién preparado (en PBS) a los organoides e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.
3. Después de 15 minutos de incubación, enjuague los organoides dos veces con 2 ml de PBS, luego lave en PBS durante 10 minutos.
   NOTA: Realice la fijación en una campana extractora de humos químicos y deseche la solución de PFA y dos enjuagues posteriores de PBS en un contenedor de desechos de PFA debidamente etiquetado almacenado en la campana extractora.
4. Aspire todo el PBS, luego agregue un 20% de sacarosa en PBS a los organoides fijos. Asegúrese de que los organoides se mezclen en la solución de sacarosa y no permanezcan en una burbuja de PBS en la parte superior. Mantenga los organoides en la solución de sacarosa hasta que se hundan hasta el fondo de la solución de sacarosa, es decir, ~ 1 h a temperatura ambiente. Los organoides fijos pueden almacenarse en solución de sacarosa durante la noche a 4 °C.
5. Incrustar los organoides en solución OCT en un molde de criosección. Se pueden incrustar múltiples organoides por condición en un molde. Oriente los organoides asegurándose de que sus mejores regiones retinianas se seccionarán transversalmente en el criostato, y el centro de los organoides están todos aproximadamente en el mismo plano. Congelar los organoides incrustados a -20 °C. Los organoides incrustados se pueden almacenar a -80 °C durante años.
   NOTA: Los organoides son difíciles de ver en OCT congelados; oriente los grupos de EPR hacia el lado del molde que estará frente a la cuchilla para facilitar la identificación de organoides.
6. Criosección de organoides en secciones de 10-14 μm de espesor y adherir secciones a portaobjetos tratados con lisina poli-L. Durante la criosección, revise repetidamente los portaobjetos bajo un microscopio para identificar secciones que contengan el centro de los organoides. Solo recoja las rebanadas intermedias de los organoides donde todas las capas estén representadas uniformemente (Figura 2A-C, Figura 3). Una vez seccionadas, las diapositivas se pueden almacenar en una caja deslizante a -80 °C durante años.
   NOTA: Los cortes tomados en los extremos del organoide sobremuestrearán los fotorreceptores más externos y no son apropiados para la cuantificación. Los organoides de tamaño promedio proporcionarán 10-15 cortes del centro del organoide que representa una sección transversal de las capas retinianas estratificadas.

8. Tinción TUNEL para células apoptóticas

1. Descongele los portaobjetos congelados durante 30 min a 37 °C. La colocación inmediata de portaobjetos a 37 °C evita la condensación. Las muestras de tejido empapadas en agua pura pueden distorsionar el tejido. Una incubación a 37 °C también mejora la adhesión del tejido al portaobjetos de vidrio.
2. Cree un borde continuo en el portaobjetos de vidrio alrededor de las secciones de tejido con un bolígrafo hidrófobo. Esto proporcionará un borde y garantizará una fijación adecuada e incubaciones de anticuerpos con un pequeño volumen de soluciones. Agregue aproximadamente 100-200 μL (el volumen llenará la región con bordes hidrofóbicos sin derramarse) de PFA al 4% recién preparado durante 20 min. Realice la fijación en una campana extractora de humos químicos y deseche la solución de PFA en un contenedor de residuos de PFA debidamente etiquetado almacenado en la campana extractora.
3. Enjuague las diapositivas una vez en PBS y luego lávelas en PBS durante 25 minutos a temperatura ambiente.
4. Preparar la mezcla TUNEL. Descongele los viales violetas y azules del kit de detección de muerte celular in situ. Extraer 100 μL de solución violeta del vial (se puede utilizar para un control negativo) y combinar los 450 μL restantes de solución del vial violeta con 50 μL de solución del vial azul. Mezclar bien y mantener en la oscuridad. Cada juego de viales (500 μL en total) puede manchar 5-10 portaobjetos.
5. Permeabilizar las rodajas de tejido.
   1. Preparar solución de permeabilización: PBS con 0.1% TritonX-100 y 0.1% de citrato de sodio
   2. Elimine PBS de las diapositivas de muestra y luego agregue la solución de permeabilización a las muestras. Incubar durante 2 min en bloque de hielo o a 4 °C. Después de eso, enjuague una vez en PBS y luego lave en PBS durante 10 minutos.
6. Retire PBS y seque la mayor cantidad de solución posible usando la esquina de un pañuelo doblado. Añadir 50-100 μL de mezcla TUNEL preparada a las muestras, dependiendo del tamaño del área dibujada por la pluma hidrófoba. Cubrir con tapa de vidrio e incubar a 37 °C durante 1 h en la oscuridad.
   NOTA: Todas las incubaciones y lavados para los siguientes pasos deben realizarse en la oscuridad para evitar el blanqueo de los fluoróforos. Use una caja oscura o cubra las diapositivas con papel de aluminio para bloquear la luz.
7. Etiquete los fotorreceptores. Enjuague una vez con PBS y luego lave durante 20 minutos en PBS. Retire PBS y luego agregue el anticuerpo primario Recoverin (conejo anti-Recoverin) diluido 1:500 en PBS con 0.1% de Tween y 5% de suero de burro. Incubar a 4 °C durante la noche.
8. Después de eliminar el anticuerpo primario, enjuague una vez en PBS y luego lave en PBS durante 20 minutos. Añadir anticuerpo secundario, anti-conejo de burro con un fluoróforo naranja o rojo, diluido 1:1.000 en PBS con 0,1% de Tween y 5% de suero de burro e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Enjuague una vez con PBS y luego lave durante 20 minutos en PBS. Agregue DAPI a 1:1000 en PBS, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.
9. Enjuague una vez con PBS y luego lave durante 20 minutos en PBS. Retire PBS y agregue el medio de montaje. Agregue el cubreobjetos, selle con esmalte de uñas y deje secar en la oscuridad. Los portaobjetos se pueden almacenar a 4 °C en un recipiente oscuro durante un máximo de 1 semana.
   NOTA: Para obtener la mejor calidad de imagen, tome imágenes al día siguiente.

9. Obtención de imágenes de cortes de organoides y cuantificación de la muerte.

NOTA: Las imágenes requieren un microscopio confocal con capacidades para distinguir entre tres canales fluoróforos. Este experimento utiliza canales verde (Alexa Fluor 488), naranja (Alexa Fluor 555) y UV (DAPI). Se puede utilizar cualquier combinación de fluoróforos para garantizar que las emisiones no se filtren a los otros canales.

1. Localice secciones de la retina para obtener imágenes y cuantificación. Bajo un bajo aumento del microscopio (5x o 10x) use la tinción Recoverin, que marca el citoplasma de los fotorreceptores, y la tinción DAPI, que etiqueta los núcleos de todas las células, para localizar una región del organoide cortado que está intacta, bien formada y en un plano que muestrea una sección transversal representativa del organoide (Figura 2 y Figura 3 ). Encuentre una sección que tenga una capa nuclear externa distinta de fotorreceptores que tenga al menos unas pocas células de espesor, y una capa separada y distinta de núcleos que no tengan tinción de Recoverin (Figura 2 y Figura 3).
2. Enmarca la imagen. Aumente el aumento del microscopio a un objetivo de 20x y enmarque la diapositiva para llenar la imagen con la mayor cantidad posible de la capa fotorreceptora (Figura 3).
3. Establezca el plano Z. Si utiliza un microscopio que toma imágenes de pilas Z, establezca los límites superior e inferior del rango Z para obtener imágenes de toda la profundidad del corte. Utilice el mismo grosor de pila Z para todas las imágenes en un conjunto experimental para que se ensaye la misma cantidad de tejido en todas las muestras. Si no utiliza un microscopio que toma imágenes de pilas Z, enfoque la imagen en el centro del sector.
4. Imagen de los tres canales de fluoróforos en una adquisición de pila Z. Los tres canales son necesarios para identificar positivamente una célula moribunda. Imagen de un área por organoide.
5. Guarde la imagen establecida en un formato de archivo que conserve la proporción de área por píxel.

10. Cuantificación de células moribundas

1. Abra pilas de imágenes en el software FIJI (Imagen J). En la ventana Opciones de importación de bioformatos , asegúrese de que no haya ninguna casilla en la sección "dividir en ventanas separadas". El desplazamiento entre los canales de imagen alineados es fundamental para identificar adecuadamente las celdas.
2. Aplana el conjunto de imágenes de la pila Z haciendo clic en Imagen > Pilas y luego selecciona 'Proyecto Z' en el menú desplegable. Esto creará una nueva imagen para la cuantificación. Si los organoides no fueron fotografiados en la serie Z, omita este paso.
3. Seleccione el canal de imagen que muestra la tinción de Recoverin (rojo, en este ejemplo). Haga clic en la herramienta de selección de polígonos en la barra de herramientas y delinee una región continua de fotorreceptores en la imagen (Figura 3A). Haga clic en Analizar > establecer medidas. En la ventana emergente Establecer medidas , seleccione la casilla junto a Área, haga clic en Analizar y seleccione Medir para medir el área (o presione "m" como acceso directo) de fotorreceptores para contar las células moribundas. La medición del área aparecerá en una ventana emergente de mediciones.
4. Contar los núcleos TUNEL-positivos en la región fotorreceptora previamente seleccionada (Figura 3B,C). Haga clic con el botón derecho en la herramienta de puntos en la barra de herramientas y seleccione herramienta multipunto. Solo en el canal TUNEL, haga clic en tinción positiva TUNEL que se superpone con núcleos DAPI positivos y tinción Recoverin. Alterna entre los canales para validar las células positivas.
5. Dividir el número de células TUNEL positivas por el área para obtener un valor normalizado para la muerte celular en fotorreceptores por organoide (Figura 2D,E).

Resultados

Los organoides retinianos se generaron a partir de una línea iPSC de control no MacTel. Después de que los organoides alcanzaron las 26 semanas en cultivo, fueron seleccionados y divididos en grupos experimentales. Los organoides fueron tratados con concentraciones variables de deoxySA para determinar si deoxySA es tóxico para los fotorreceptores. Se probaron cuatro concentraciones de deoxySA, de 0 a 1 μM (Figura 2) y se trataron organoides durante 8 días, con cambios en los medios cada...

Discusión

Variaciones del protocolo de diferenciación
Desde la invención de las copas ópticas autoformadas por el grupo²⁰ de Yoshiki Sasai, muchos laboratorios han desarrollado protocolos para generar organoides retinianos que pueden variar en casi todos los pasos 5,18,19,21. Una lista exhaustiva de protocolos se puede encontrar en Capowski et

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503