Criblages de toxicité dans les organoïdes rétiniens humains pour la découverte pharmaceutique

Résumé

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour générer des organoïdes rétiniens humains matures et les utiliser dans un test de toxicité des photorécepteurs afin d’identifier des candidats pharmaceutiques pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge, la télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).

Résumé

Les organoïdes fournissent une plate-forme prometteuse pour étudier le mécanisme et les traitements de la maladie, directement dans le contexte des tissus humains avec la polyvalence et le débit de la culture cellulaire. Les organoïdes rétiniens humains matures sont utilisés pour dépister les traitements pharmaceutiques potentiels pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).

Nous avons récemment montré que MacTel peut être causé par des niveaux élevés d’une espèce lipidique atypique, les désoxysphingolipides (deoxySLs). Ces lipides sont toxiques pour la rétine et peuvent entraîner la perte de photorécepteurs qui se produit chez les patients MacTel. Pour dépister la capacité des médicaments à prévenir la toxicité des photorécepteurs du désoxySL, nous avons généré des organoïdes rétiniens humains à partir d’une lignée de cellules souches pluripotentes non induites par MacTel (CSPi) et les avons mûris jusqu’à un âge post-mitotique où ils développent toutes les cellules dérivées de la lignée neuronale de la rétine, y compris les photorécepteurs fonctionnellement matures. Les organoïdes rétiniens ont été traités avec un métabolite deoxySL et l’apoptose a été mesurée dans la couche photoréceptrice par immunohistochimie. À l’aide de ce modèle de toxicité, des composés pharmacologiques qui empêchent la mort des photorécepteurs induite par le désoxySL ont été examinés. À l’aide d’une approche candidate ciblée, nous avons déterminé que le fénofibrate, un médicament couramment prescrit pour le traitement de l’hypercholestérolémie et des triglycérides, peut également prévenir la toxicité du désoxySL dans les cellules de la rétine.

L’écran de toxicité a permis d’identifier avec succès un médicament approuvé par la FDA qui peut prévenir la mort des photorécepteurs. Il s’agit d’une découverte directement exploitable en raison du modèle hautement pertinent pour la maladie testé. Cette plateforme peut être facilement modifiée pour tester un certain nombre de facteurs de stress métaboliques et d’interventions pharmacologiques potentielles pour la découverte de futurs traitements dans les maladies de la rétine.

Introduction

La modélisation des maladies humaines dans des cultures cellulaires et des modèles animaux a fourni des outils inestimables pour la découverte, la modification et la validation de thérapies pharmacologiques, leur permettant de passer d’un médicament candidat à un traitement approuvé. Bien qu’une combinaison de modèles in vitro et non humains in vivo soit depuis longtemps un élément essentiel du pipeline de développement de médicaments, ils échouent souvent à prédire les performances cliniques des nouveaux candidats^{médicaments 1}. Il existe un besoin évident de développer des technologies qui comblent le fossé entre les monocultures cellulaires humaines simplistes et les essais cliniques. Les progrès technologiques récents dans les cultures tissulaires tridimensionnelles auto-organisées, les organoïdes, ont amélioré leur fidélité aux tissus qu’ils modélisent, ce qui en fait des outils prometteurs dans le pipeline de développement de médicaments précliniques².

Un avantage majeur de la culture cellulaire humaine par rapport aux modèles in vivo non humains est la capacité de reproduire les subtilités spécifiques du métabolisme humain qui peuvent varier considérablement même entre des vertébrés d’ordre supérieur tels que les humains et les souris³. Cependant, cette spécificité peut être éclipsée par une perte de complexité tissulaire; C’est le cas du tissu rétinien où plusieurs types de cellules sont étroitement entrelacés et ont une interaction métabolique symbiotique unique entre les sous-types cellulaires qui ne peuvent pas être reproduits dans une monoculture⁴. Les organoïdes humains, qui fournissent un fac-similé de tissus humains complexes avec l’accessibilité et l’évolutivité de la culture cellulaire, ont le potentiel de surmonter les lacunes de ces plateformes de modélisation des maladies.

Les organoïdes rétiniens dérivés de cellules souches se sont révélés particulièrement fidèles dans la modélisation du tissu complexe de la rétine neurale humaine⁵. Cela a fait du modèle organoïde rétinien une technologie prometteuse pour l’étude et le traitement des maladies rétiniennes ^6,7. À ce jour, une grande partie de la modélisation de la maladie dans les organoïdes rétiniens s’est concentrée sur les maladies rétiniennes monogéniques où les organoïdes rétiniens sont dérivés de lignées iPSC avec des variantes génétiques causant la maladie⁷. Ce sont généralement des mutations très pénétrantes qui se manifestent par des phénotypes développementaux. Moins de travail a été fait efficacement sur les maladies du vieillissement où les mutations génétiques et les facteurs de stress environnementaux ont un impact sur les tissus qui se sont développés normalement. Les maladies neurodégénératives du vieillissement peuvent avoir un héritage génétique complexe et des contributions de facteurs de stress environnementaux qui sont intrinsèquement difficiles à modéliser à l’aide de cultures cellulaires à court terme. Cependant, dans de nombreux cas, ces maladies complexes peuvent fusionner sur des facteurs de stress cellulaires ou métaboliques communs qui, lorsqu’ils sont testés sur un tissu humain pleinement développé, peuvent fournir des informations puissantes sur les maladies neurodégénératives du vieillissement⁸.

La maladie dégénérative maculaire tardive, la télangiectasie maculaire de type II (MacTel), est un excellent exemple d’une maladie neurodégénérative génétiquement complexe qui fusionne sur un défaut métabolique commun. MacTel est une maladie dégénérative rétinienne rare du vieillissement qui entraîne une perte de photorécepteur et de glie de Müller dans la macula, entraînant une perte progressive de la vision centrale 9,10,11,12,13. Chez MacTel, un héritage génétique indéterminé, peut-être multifactoriel, entraîne une réduction commune de la sérine circulante chez les patients, ce qui entraîne une augmentation d’une espèce lipidique neurotoxique appelée désoxysphingolipides (deoxySL)^14,15. Pour prouver que l’accumulation de deoxySL est toxique pour la rétine et pour valider les thérapies pharmaceutiques potentielles, nous avons développé ce protocole pour tester la toxicité des photorécepteurs dans les organoïdes rétiniens humains¹⁴.

Nous décrivons ici un protocole spécifique pour différencier les organoïdes rétiniens humains, établir un test de toxicité et de sauvetage à l’aide d’organoïdes et quantifier les résultats. Nous fournissons un exemple réussi où nous déterminons la toxicité spécifique aux tissus d’un agent pathogène soupçonné, le désoxySL, et validons l’utilisation d’un médicament générique sûr, le fénofibrate, pour le traitement potentiel de la toxicité rétinienne induite par le désoxySL. Des travaux antérieurs ont montré que le fénofibrate peut augmenter la dégradation du désoxySL et réduire le désoxySL circulant chez les patients, cependant, son efficacité dans la réduction de la toxicité rétinienne induite par le désoxySL n’a pas été testée^16,17. Bien que nous présentions un exemple spécifique, ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’effet d’un certain nombre de facteurs de stress métaboliques / environnementaux et de médicaments thérapeutiques potentiels sur le tissu rétinien.

Protocole

1. Décongélation, passage et expansion des CSPi/CSE

REMARQUE : Pour toutes les étapes de culture cellulaire, utilisez les meilleures pratiques pour maintenir une culture cellulaire stérile.

1. Enduire une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec un milieu matriciel membranaire basal.
   1. Pour préparer 1x de ce milieu, suivre les spécifications du produit ou diluer 75 μL de milieu matriciel froid avec 9 mL de DMEM/F12. Ajouter 1,5 mL de 1x milieu fraîchement préparé par puits dans une assiette de 6 puits. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
   2. Aspirer le milieu de la matrice membranaire basale et rincer chaque puits avec 3 mL de DMEM/F12. Ajouter 2 mL de DMEM/F12 et incuber à 37 °C jusqu’à utilisation. Utilisez l’assiette le jour où elle est préparée.
2. Préparer une solution mère de 10 mM d’inhibiteur de roche (chlorhydrate Y-27632) dans du PBS et conserver à -20 °C jusqu’à utilisation.
3. Décongeler un flacon de CSPi/CSE dans un milieu DMEM/F12 et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans un milieu mTeSR. Plaque 1 flacon de cellules sur un puits recouvert de 6 puits dans un milieu mTeSR avec 10 μM d’inhibiteur de roche (chlorhydrate Y-27632) et incuber pendant une nuit dans l’incubateur. Le lendemain, aspirez les médias et rajoutez juste mTeSR.
   REMARQUE: Changez de support tous les jours jusqu’à passage.
4. Préparer 0,5 mM d’EDTA dans du PBS en diluant 500 μL d’EDTA 0,5 M dans 500 mL de PBS.
5. Cellules de passage lorsqu’elles atteignent 80-90% de confluence. Divisez les cellules 1:3 ou 1:6 par puits, selon le taux de croissance des cellules.
   1. Pour retirer les cellules collées de la plaque, aspirer le milieu et incuber avec 0,5 mM d’EDTA dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Après l’incubation, retirer la solution d’EDTA et soulever les cellules en éjectant avec force 1 mL de milieu mTeSR sur les cellules à l’aide d’une pipette p1000.
   2. Continuez à aspirer et à éjecter avec force le milieu et les cellules mTeSR, jusqu’à 5x, pour éliminer les cellules restantes adhérentes. Cellules de plaque sur une plaque à 6 puits revêtue d’une nouvelle membrane de base, avec un milieu mTeSR. Continuez à remplacer le média tous les jours jusqu’à ce que les plaques atteignent à nouveau 80-100% de confluence.
6. Une fois que les cellules se sont étendues à une plaque complète de 6 puits et ont atteint 80-100% de confluence, mettre de côté un puits pour élargir la lignée cellulaire pour les différenciations ultérieures ou pour congeler pour la cryoconservation. Utilisez les cinq puits restants pour commencer le processus de différenciation en fabriquant des corps embryoïdes.

2. Fabrication de corps embryoïdes (EB)

NOTE: Les recettes des milieux de formation et de différenciation EB sont dérivées des protocoles de Cowan et ^al.5, Ohlemacher et al.18 et Zhong et ^al.19.

1. Préparez 1x solution de Dispase et Neural Induction Media (NIM) comme décrit ci-dessous.
   1. Préparer 10 mg/mL de 5x solution mère de Dispase en dissolvant la poudre dans DMEM/F12. Filtre stérile utilisant un filtre de 0,22 μm. Conserver 1 mL d’aliquotes à -20 °C jusqu’à utilisation.
   2. À l’aide de la solution 5x Dispase, préparer 1 mL/puits de Dispase à 2 mg/mL dans DMEM/F12. Réchauffer la solution à 37 °C pendant 30 min.
   3. Préparez la NIM en complétant le DMEM/F12 avec un supplément de N2 à 1 %, du NEAA MEM à 1 % et de l’héparine à 2 mg/mL à 180 U/mg. Le NIM peut être conservé à 4 °C jusqu’à un mois.
2. Préparer et réchauffer 16 mL de mélange 3:1 de solution mTeSR:NIM (12 mL:4 mL) à température ambiante.
3. Retirer les cellules différenciées et ajouter la solution chaude de Dispase.
   1. Retirer les cellules différenciantes de la culture cellulaire des CSPi/CSE. Sous une lunette de dissection, gratter les colonies blanches opaques à l’aide d’une pointe de pipette p10. Aspirer le milieu mTeSR des puits de culture. Cela permettra d’éliminer les amas différenciés qui viennent d’être grattés.
   2. Ajouter immédiatement la solution de Dispase préchauffée et incuber à 37 °C jusqu’à ce que la plupart des bords des colonies cellulaires commencent à se recroqueviller au microscope. Cela prendra 4-8 min.
      REMARQUE: Le temps d’incubation des cellules dans Dispase devra être déterminé pour chaque laboratoire. La durée peut varier d’une lignée cellulaire à l’autre et une incubation plus longue est nécessaire pour les cellules qui ont été plaquées pendant 3 jours ou plus. Les CSPi/CSE à croissance lente qui mettent plus de 3 jours à atteindre la confluence commenceront à adhérer avec une plus grande force à la plaque, ce qui rendra difficile le soulèvement des cellules. Pour les cellules à croissance lente, essayez de passer les cellules à 1:2 pour les développer dans une plaque complète à 6 puits afin de réduire le temps entre le placage et la confluence.
4. Aspirer la solution et rajouter doucement au moins 2 mL de milieu DMEM/F12 par puits. Ajouter lentement le milieu DMEM/F12 sur le côté du puits en prenant soin de ne pas déloger les cellules.
   1. Aspirer le milieu DMEM/F12 puis ajouter avec force 1 mL de DMEM/F12 frais directement sur les cellules pour soulever les colonies cellulaires de la plaque. Avec une pipette p1000, aspirez à plusieurs reprises et éjectez avec force DMEM/F12 dans le puits, jusqu’à 5x, pour déloger autant de colonies cellulaires que possible.
      NOTE: Les iPSC/ESC différenciants/différenciés adhèrent davantage à la plaque que les iPSC/ESC indifférenciés. Il est préférable de laisser les cellules qui ne se détachent pas avec un pipetage répété. Un pipetage excessif tue les cellules et réduit l’efficacité de la production d’EB. Les amas de cellules auront entre 100 et 400 cellules par ampleur.
5. Transférer les colonies flottantes dans un tube conique de 15 mL et rincer les puits avec un milieu DMEM/F12 supplémentaire de 1 mL par puits pour recueillir les colonies flottantes restantes.
6. Laissez les colonies flottantes s’installer par gravité pendant 5 minutes au maximum. Une fois installé, retirer tout le surnageant sauf 1-2 mL. Veillez à ne pas agiter la pastille molle au fond.
7. Resuspendre la pastille dans un milieu 3:1 mTeSR:NIM préchauffé et transférer dans une fiole T75 à fixation ultra-basse. Incuber pendant la nuit pour permettre aux EB de se former. Cela sera considéré comme le Jour 0 de la différenciation.
8. Changez progressivement de milieu en NIM pour commencer la différenciation des EB en progéniteurs neuronaux.
   1. Le lendemain, retirez le support et remplacez-le par 10 ml de milieu 1:1 mTeSR:NIM. Pour retirer les milieux de la culture EB flottante, basculer le flacon vers le haut afin que les EB s’accumulent dans le coin inférieur du flacon. Aspirez le surnageant, en vous assurant de ne pas aspirer les EB dans la pastille au fond.
   2. Le lendemain, remplacez le support par 10 ml de milieu 1:3 mTeSR:NIM.
   3. Le lendemain, remplacez le support par un support NIM complet. Continuer à changer de milieu tous les 2 jours avec le milieu NIM jusqu’à 7 jours après le traitement par Dispase.

3. Placage des EB et initiation de la différenciation rétinienne neuronale

1. Une semaine après le traitement à la dispase, plaquer des EB flottant librement sur une plaque à 6 puits recouverte d’un milieu matriciel membranaire basal à facteur de croissance réduit. Pour enduire la plaque, reportez-vous à l’étape 1.1.
   1. Aspirer les milieux usagés des EB et les remplacer par 12 mL de NIM.
   2. Assurer une répartition uniforme des EB dans chaque puits en agitant le média contenant des EB pour remettre en suspension les EB, puis retirer rapidement 1/6e du support (2 mL) et distribuer dans un puits. Répétez l’opération pour les puits restants.
   3. Avant d’incuber, secouez doucement l’assiette, d’avant en arrière puis d’un côté à l’autre, pour répartir uniformément les EB. Si les EB s’agglutinent au milieu, ils ne se différencieront pas correctement.
      REMARQUE : La densité de placage est essentielle à la différenciation. Assurez-vous de plaquer plus de 30 EB par puits. Si la production de VE n’était pas efficace, distribuez les EB dans moins de puits.
2. Changez les médias quotidiennement avec le support NIM. Maintenir le niveau de milieu dans les puits à ~3 mL. Lorsque vous changez de média, retirez tout le milieu sauf 1 ml pour ne pas assécher les EB plaqués et ajoutez doucement 2 ml de média sur le côté du puits pour ne pas soulever les cellules de la plaque.
3. Neuf jours après le placage des EB, commencez à changer le média de NIM à Retinal Differentiation Media (RDM) au cours de deux jours.
   1. Préparer le RDM en mélangeant les éléments suivants : 48% de DMEM/F12 (1:1) et 48% de DMEM complétés par 2% de supplément de B27 sans vitamine A, 1% MEM NEAA et 1% Pen-Strep. Filtrer stériliser à l’aide d’un filtre de 0,20 μm. RDM peut être conservé à 4 °C jusqu’à un mois.
   2. Le premier jour, basculez le média vers un mélange 1:1 de NIM:RDM. Le deuxième jour, changez le média en RDM. Tous les jours suivants, nourrir les cellules RDM.
      REMARQUE: Au cours des prochaines semaines, les EB plaqués formeront des progéniteurs rétiniens neuronaux qui commenceront à générer des EPR visiblement pigmentés.

4. Fabrication d’organoïdes flottants et maintien de cultures organoïdes flottantes

1. Fragmenter les EB plaqués 28 jours après le traitement initial à la Dispase (21 jours après le placage EB) à l’aide d’un scalpel stérile pour couper une grille de 1-2 mm² en EB plaqués. Cela séparera les colonies progénitrices rétiniennes en petits morceaux afin que plus tard dans le développement, ils ne deviennent pas trop gros et ne se nécrosent pas à cause d’un échange insuffisant de nutriments en leur centre.
2. Détacher les EB plaqués.
   1. Pour ce faire, ajoutez d’abord 2 mL supplémentaires de RDM à chaque puits. Aspirez ensuite ~1000 μL de fluide des puits à l’aide d’une pipette p1000. Maintenant, éjectez avec force le média directement sur les EB plaqués avec la pointe complètement immergée.
   2. Répétez cette opération jusqu’à ce que toutes les cellules aient été retirées de la plaque. Gardez l’embout immergé pendant l’éjection du média et ne poussez pas le piston de la pipette au-delà de la première butée pour éviter les bulles.
3. Resuspendre les morceaux d’EB détachés naissants dans une fiole d’erlenmeyer en plastique stérile de 125 ml et remplir la fiole avec ~40 ml de milieu RDM. Placer la fiole sur un agitateur orbital placé dans un incubateur standard. Réglez la vitesse de l’agitateur à 130-140 tr / min (réglage de vitesse 3).
   NOTE: La culture d’organoïdes sur un shaker les empêche de coller ensemble tout en cultivant à une concentration plus élevée d’organoïdes. Les bioréacteurs atteignent également les mêmes fins, mais un agitateur est moins coûteux.
4. Nourrir les organoïdes avec un changement partiel du milieu, en remplaçant environ 12 mL de RDM 2 à 3 fois par semaine, selon le jaunissement du média. Les premiers organoïdes n’auront pas besoin de beaucoup d’alimentation, mais à mesure qu’ils grandissent, ils nécessiteront des changements de milieux plus fréquents avec plus de milieux.
5. Taillez les organoïdes toutes les deux semaines pour éliminer les organoïdes non rétiniens, envahis par la végétation et mourants. Cela empêche le gaspillage des milieux et améliore la santé des organoïdes rétiniens restants.
   1. Transvaser les cellules de leur fiole sur une plaque à 6 puits ou une capsule de 10 cm à l’aide d’une pipette de 5 mL. Conservez les organoïdes qui présentent un neuroépithélium stratifié (Figure 1A, astérisque). Ces organoïdes sont transparents et blancs.
   2. Trier et enlever les organoïdes rétiniens mal formés ou envahis par la végétation et les organoïdes non rétiniens à l’aide d’une pipette de 5 mL. Ceux-ci seront généralement opaques et jaunâtres (Figure 1A). Enlevez également tout ce qui ne ressemble pas à un neuroépithélium stratifié. Les premières tailles exigeront beaucoup de main-d’œuvre, mais deviendront beaucoup plus faciles chaque fois par la suite à mesure que les organoïdes deviendront plus grands et plus homogènes (Figure 1B).

5. Maintenir les organoïdes matures et les différencier en tissu rétinien post-mitotique

1. Au jour 56 (semaine 8) suivant le traitement initial par Dispase pour la formation d’EB (28 jours après la culture des EB délogés dans une fiole), changer le milieu organoïde en RDM+. Cela fournira des nutriments supplémentaires aux organoïdes complètement matures comme le tissu rétinien.
   1. Préparer 100 mM de taurine dans du PBS. Conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’à utilisation.
   2. Préparez RDM+ en complétant RDM avec 10% FBS, 100 μM de taurine et 2 mM de glutamine commerciale. Filtrer stériliser à l’aide d’un filtre de 0,20 μm.
   3. Continuez à changer de support RDM+ 2 à 3 fois par semaine.
2. À la semaine 17-18 (traitement post-Dispase), transférer les organoïdes de l’erlenmeyer dans une plaque à 6 puits à très faible fixation à l’aide d’une pipette de 5 mL. Pendant la première semaine, continuez à tailler et à séparer les organoïdes les uns des autres tous les jours jusqu’à ce que les organoïdes ne collent plus ensemble. La densité optimale est de 10 à 15 organoïdes par puits. Changez de média 2 à 3 fois par semaine.
   REMARQUE: Réduisez le nombre d’organoïdes par puits si les organoïdes adhèrent fréquemment les uns aux autres ou si le média devient très jaune entre les changements de média.
3. Attendez-vous à ce que les organoïdes deviennent complètement post-mitotiques à la semaine 18⁵ lorsque les cellules rétiniennes neurales sont présentes partout. À la semaine 24, vérifier la formation de segments externes rudimentaires à l’extérieur de l’organoïde. D’ici la semaine 26-28, s’assurer que les segments externes sont épais à l’extérieur des organoïdes (figure 1C). Effectuer des essais de toxicité après la semaine 26 lorsque les organoïdes ont défini des segments externes signifiant un état de différenciation mature.
   NOTE: Utilisez uniquement des organoïdes rétiniens bien différenciés pour le dosage de toxicité. La réalisation d’essais de toxicité sur des organoïdes avec des segments externes bien définis permettra leur identification.

6. Désoxysphinganine (deoxySA) et traitement médicamenteux

REMARQUE : Un traitement unique au fénofibrate pour soulager la toxicité de la désoxySA sur une période de 4 jours est présenté ici (figure 2). La concentration de désoxySA ajoutée aux organoïdes, la durée du traitement par la désoxySA sur les organoïdes et le type de médicament utilisé pour sauver la toxicité¹⁴ peuvent toutefois être modifiés en fonction des besoins expérimentaux pour tester la toxicité et la toxicité.

1. Préparer une solution mère de 1 mM de désoxySA dans de l’éthanol. Conserver à -20 °C pendant 1 mois. Alternativement, une solution mère de désoxySA peut être préparée dans du DMSO.
2. Effectuer une dilution en série de la désoxySA afin de déterminer une concentration toxique appropriée de désoxySA pour le sauvetage de drogues.
   NOTE: Déterminez d’abord une concentration de désoxySA qui entraînera une mort cellulaire suffisante pour mesurer un effet de sauvetage. Si la concentration est trop élevée, la réponse toxique entraînera la désintégration de l’organoïde et aucun sauvetage ne sera observé. Si la réponse toxique est trop faible, il sera difficile d’observer un effet de sauvetage significatif. La réponse toxique de la désoxySA peut varier d’un laboratoire à l’autre et d’un lot à l’autre de désoxySA.
   1. Diluer 1 mM de solution mère de désoxySA à des concentrations de 0,5 μM, 1 μM et 2 μM dans 3 mL de RDM+, chacun. Ajouter 3 μL d’éthanol à RDM+ pour préparer un traitement témoin.
   2. Au microscope à dissection, utilisez une sonde stérile pour sélectionner 4 groupes d’organoïdes avec un minimum de 5 organoïdes par groupe. Divisez les groupes en puits séparés d’une plaque de 6 puits à attachement ultra-bas. Choisissez des organoïdes qui ont approximativement la même taille et la même forme.
   3. Aspirez autant de RDM+ des organoïdes que possible. À chaque puits d’organoïdes, ajouter une concentration de désoxySA dans RDM+. Ajouter le contrôle du véhicule au quatrième puits d’organoïdes.
   4. Après deux jours de culture dans la désoxySA ou le véhicule, remplacer le milieu par des dilutions de désoxySA correspondantes fraîchement préparées dans RDM+.
   5. Le quatrième jour de traitement, passez à l’étape 7 pour traiter et tester les organoïdes pour la mort cellulaire. Une fois qu’une concentration de désoxySA a été sélectionnée, passer à l’étape 6.3 pour traiter avec le fénofibrate.
      REMARQUE: La mort cellulaire cible dans le groupe de traitement par deoxySA sélectionné est de 5 à 20 cellules TUNEL positives pour 10 000 μm². Les organoïdes ne doivent pas se désintégrer au toucher d’une sonde au cours du traitement.
3. Traiter les organoïdes avec la dose toxique sélectionnée de désoxySA et de fénofibrate.
   1. Préparer une solution mère de 40 mM de fénofibrate dans du DMSO. Conserver à -20 °C jusqu’à 1 an.
   2. Préparer le milieu de traitement médicamenteux : Dans 3 mL de RDM+, diluer 1 mM de solution mère de désoxySA à 1 μM de désoxySA et diluer 40 mM de solution mère de fénofibrate à 20 μM.
   3. Préparer le milieu de traitement de la désoxySA : Dans 3 mL de RDM+, diluer 1 mM de solution mère de désoxySA à 1 μM de désoxySA et ajouter 1,5 μL de DMSO.
   4. Préparer le milieu de contrôle : Dans 3 mL RDM+, ajouter 3 μL d’éthanol et 1,5 μL de DMSO.
   5. Sous un microscope à dissection utilisant une sonde stérile, sélectionnez trois groupes d’organoïdes avec un minimum de cinq organoïdes par groupe. Divisez les groupes en puits séparés d’une plaque de 6 puits à attachement ultra-bas.
   6. Ajouter les traitements préparés (deoxySA, deoxySA + fénofibrate ou témoin) aux organoïdes. Après deux jours, changez le milieu dans les puits avec RDM+ fraîchement préparé complété par des solutions de désoxySA / fénofibrate / contrôle correspondantes.
   7. Le quatrième jour de traitement, passez à l’étape 7 pour traiter et tester les organoïdes pour la mort cellulaire (Figure 2).

7. Encastrement et cryosectionnement des organoïdes

1. Préparer du PFA frais à 4 % en ajoutant 1 mL d’ampoule de PFA à 16 % à 3 mL de PBS.
2. Retirez le média RDM+ des organoïdes et rincez une fois avec du PBS. Retirez autant de PBS que possible des organoïdes. Ajouter 2 mL de PFA à 4 % fraîchement préparé (dans du PBS) aux organoïdes et incuber pendant 15 minutes à température ambiante.
3. Après 15 minutes d’incubation, rincer les organoïdes deux fois avec 2 ml de PBS, puis laver au PBS pendant 10 min.
   REMARQUE : Effectuer la fixation dans une hotte chimique et jeter la solution de PFA et deux rinçages PBS subséquents dans un conteneur à déchets de PFA étiqueté de manière appropriée stocké dans la hotte.
4. Aspirer tout le PBS, puis ajouter 20% de saccharose dans PBS aux organoïdes fixes. Assurez-vous que les organoïdes sont mélangés à la solution de saccharose et ne restent pas dans une bulle de PBS sur le dessus. Conserver les organoïdes dans la solution de saccharose jusqu’à ce qu’ils coulent au fond de la solution de saccharose, c’est-à-dire ~1 h à température ambiante. Les organoïdes fixes peuvent être conservés dans une solution de saccharose pendant une nuit à 4 °C.
5. Incorporer les organoïdes dans une solution OCT dans un moule de cryosection. Plusieurs organoïdes par condition peuvent être intégrés dans un moule. Orientez les organoïdes en veillant à ce que leurs meilleures régions rétiniennes soient sectionnées sur le cryostat, et le milieu des organoïdes sont tous à peu près dans le même plan. Congeler les organoïdes incorporés à -20 °C. Les organoïdes intégrés peuvent être conservés à -80 °C pendant des années.
   REMARQUE : Les organoïdes sont difficiles à voir dans les TCO congelés; orienter les grappes d’EPR vers le côté du moule qui fera face à la lame pour faciliter l’identification des organoïdes.
6. Les organoïdes de cryosection sont divisés en sections de 10 à 14 μm d’épaisseur et adhèrent aux lames traitées à la poly-L lysine. Pendant la cryosection, vérifiez à plusieurs reprises les lames au microscope pour identifier les sections qui contiennent le milieu des organoïdes. Ne recueillez que les tranches du milieu des organoïdes où toutes les couches sont uniformément représentées (Figure 2A-C, Figure 3). Une fois sectionnées, les lames peuvent être stockées dans une boîte à diapositives à -80 °C pendant des années.
   NOTE: Les tranches prélevées aux extrémités de l’organoïde suréchantillonneront les photorécepteurs les plus externes et ne conviennent pas à la quantification. Les organoïdes de taille moyenne fourniront 10 à 15 tranches du milieu de l’organoïde qui représente une coupe transversale des couches rétiniennes stratifiées.

8. Coloration TUNEL pour cellules apoptotiques

1. Décongeler les lames gelées pendant 30 min à 37 °C. Placer immédiatement les lames à 37 °C empêche la condensation. Les échantillons de tissus trempés dans de l’eau pure peuvent déformer le tissu. Une incubation à 37 °C améliore également l’adhérence du tissu à la lame de verre.
2. Créez une bordure continue sur la lame de verre autour des sections de tissu à l’aide d’un stylo hydrophobe. Cela fournira une bordure et assurera une fixation adéquate et des incubations d’anticorps avec un petit volume de solutions. Ajouter environ 100 à 200 μL (le volume remplira la région bordée d’hydrophobes sans débordement) de PFA à 4 % fraîchement préparé pendant 20 minutes. Effectuer la fixation dans une hotte chimique et jeter la solution de PFA dans un conteneur à déchets de PFA correctement étiqueté stocké dans la hotte.
3. Rincer les lames une fois dans PBS puis laver dans PBS pendant 25 min à température ambiante.
4. Préparer le mélange TUNEL. Décongeler les flacons violets et bleus du kit de détection de la mort cellulaire in situ. Retirer 100 μL de solution violette pour flacon (peut être utilisé pour un témoin négatif) et combiner les 450 μL restants de solution du flacon violet avec 50 μL de solution du flacon bleu. Bien mélanger et garder dans l’obscurité. Chaque ensemble de flacons (500 μL au total) peut tacher 5 à 10 lames.
5. Perméabiliser les tranches de tissu.
   1. Préparer la solution de perméabilisation: PBS avec 0,1% de TritonX-100 et 0,1% de citrate de sodium
   2. Retirez le PBS des lames d’échantillons, puis ajoutez la solution de perméabilisation aux échantillons. Incuber pendant 2 min sur bloc de glace ou à 4 °C. Ensuite, rincez une fois dans PBS puis lavez dans PBS pendant 10 min.
6. Retirer le PBS et sécher autant de solution que possible en utilisant le coin d’un tissu plié. Ajouter 50 à 100 μL de mélange TUNEL préparé aux échantillons, selon la taille de la zone dessinée par le stylo hydrophobe. Couvrir avec le couvercle en verre et incuber à 37 °C pendant 1 h dans l’obscurité.
   REMARQUE: Toutes les incubations et tous les lavages pour les étapes suivantes doivent être effectués dans l’obscurité pour éviter le blanchiment des fluorophores. Utilisez une boîte sombre ou couvrez les lames avec du papier d’aluminium pour bloquer la lumière.
7. Étiquetez les photorécepteurs. Rincer une fois avec du PBS puis laver pendant 20 min dans du PBS. Retirer le PBS puis ajouter l’anticorps primaire Recoverin (anti-Recoverin de lapin) dilué 1:500 dans du PBS avec 0,1% de Tween et 5% de sérum d’âne. Incuber à 4 °C pendant une nuit.
8. Après avoir retiré l’anticorps primaire, rincer une fois dans PBS puis laver dans PBS pendant 20 min. Ajouter l’anticorps secondaire, anti-lapin d’âne avec un fluorophore orange ou rouge, dilué 1:1 000 dans du PBS avec 0,1% de préadolescent et 5% de sérum d’ânesse et incuber à température ambiante pendant 2 h. Rincer une fois avec du PBS puis laver pendant 20 min dans du PBS. Ajouter DAPI à 1:1000 dans PBS, incuber à température ambiante pendant 10 min.
9. Rincer une fois avec du PBS puis laver pendant 20 min dans du PBS. Retirez le PBS et ajoutez le support de montage. Ajouter le couvercle, sceller avec du vernis à ongles et laisser sécher dans l’obscurité. Les lames peuvent être conservées à 4 °C dans un récipient sombre jusqu’à 1 semaine.
   REMARQUE: Pour une meilleure qualité d’image, prenez des images le lendemain.

9. Imagerie de tranches organoïdes et quantification de la mort.

REMARQUE: L’imagerie nécessite un microscope confocal capable de distinguer trois canaux fluorophores. Cette expérience utilise des canaux verts (Alexa Fluor 488), orange (Alexa Fluor 555) et UV (DAPI). Toute combinaison de fluorophores peut être utilisée pour s’assurer que les émissions ne saignent pas dans les autres canaux.

1. Localiser les coupes rétiniennes pour l’imagerie et la quantification. Sous un faible grossissement du microscope (5x ou 10x), utilisez la coloration Recoverin, qui marque le cytoplasme des photorécepteurs, et la coloration DAPI, qui marque les noyaux de toutes les cellules, pour localiser une région de l’organoïde tranché qui est intacte, bien formée et dans un plan qui échantillonne une coupe efficace représentative de l’organoïde (Figure 2 et Figure 3 ). Trouvez une section qui a une couche nucléaire externe distincte de photorécepteurs d’au moins quelques cellules d’épaisseur, et une couche séparée et distincte de noyaux qui n’ont pas de coloration Recoverin (Figure 2 et Figure 3).
2. Encadrez l’image. Augmentez le grossissement du microscope à un objectif de 20x et encadrez la lame pour remplir l’image avec autant de couche photoréceptrice que possible (Figure 3).
3. Réglez le plan Z. Si vous utilisez un microscope qui image, les piles Z définissent les limites supérieure et inférieure de la plage Z pour imager toute la profondeur de la tranche. Utilisez la même épaisseur Z-stack pour toutes les images d’un ensemble expérimental afin que la même quantité de tissu soit analysée dans tous les échantillons. Si vous n’utilisez pas un microscope qui image, concentrez l’image au milieu de la tranche.
4. Imagez les trois canaux de fluorophores dans une acquisition Z-stack. Les trois canaux sont nécessaires pour identifier positivement une cellule mourante. Image d’une zone par organoïde.
5. Enregistrez l’ensemble d’images dans un format de fichier qui préserve le rapport de surface par pixel.

10. Quantifier les cellules mourantes

1. Ouvrez les piles d’images dans le logiciel FIJI (Image J). Dans la fenêtre Options d’importation des formats bioformatés, assurez-vous qu’aucune case de la section « Diviser en fenêtres distinctes » n’est sélectionnée. Le défilement entre les canaux d’image alignés est essentiel pour identifier correctement les cellules.
2. Aplatissez l’ensemble d’images Z-stack en cliquant sur Image > Stacks , puis sélectionnez « Projet Z » dans le menu déroulant. Cela créera une nouvelle image pour la quantification. Si les organoïdes n’ont pas été imagés dans la série Z, ignorez cette étape.
3. Sélectionnez le canal d’image qui affiche la coloration Recoverin (rouge, dans cet exemple). Cliquez sur l’outil de sélection de polygones dans la barre d’outils et délimitez une région continue de photorécepteurs dans l’image (Figure 3A). Cliquez sur Analyser > définir les mesures. Dans la fenêtre contextuelle Définir les mesures , cochez la case à côté de Zone, cliquez sur Analyser et sélectionnez Mesure pour mesurer la zone (ou appuyez sur « m » comme raccourci) des photorécepteurs pour compter les cellules mourantes. La mesure de surface apparaîtra dans une fenêtre contextuelle de mesures.
4. Compter les noyaux TUNEL-positifs dans la région photoréceptrice précédemment sélectionnée (Figure 3B,C). Cliquez avec le bouton droit sur l’outil Point dans la barre d’outils et sélectionnez Outil multipoint. Dans le canal TUNEL uniquement, cliquez sur coloration positive TUNEL qui chevauche un noyau positif DAPI et coloration Recoverin. Basculez entre les canaux pour valider les cellules positives.
5. Diviser le nombre de cellules TUNEL positives par la zone pour obtenir une valeur normalisée de la mort cellulaire dans les photorécepteurs par organoïde (Figure 2D,E).

Résultats

Les organoïdes rétiniens ont été générés à partir d’une lignée iPSC non témoin MacTel. Après que les organoïdes aient atteint 26 semaines en culture, ils ont été sélectionnés et divisés en groupes expérimentaux. Les organoïdes ont été traités avec des concentrations variables de désoxySA pour déterminer si le désoxySA est toxique pour les photorécepteurs. Quatre concentrations de désoxySA ont été testées, de 0 à 1 μM (Figure 2) et les organoïdes ont été t...

Discussion

Variations du protocole de différenciation
Depuis l’invention des cupules optiques autoformées par le groupe²⁰ de Yoshiki Sasai, de nombreux laboratoires ont développé des protocoles pour générer des organoïdes rétiniens qui peuvent varier à presque chaque étape 5,18,19,21. Une liste exhaustive des protocoles peut être trouvée dans Capow...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503