Criblages de toxicité dans les organoïdes rétiniens humains pour la découverte pharmaceutique

Résumé

Nous présentons ici un protocole étape par étape pour générer des organoïdes rétiniens humains matures et les utiliser dans un test de toxicité des photorécepteurs afin d’identifier des candidats pharmaceutiques pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge, la télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).

Résumé

Les organoïdes fournissent une plate-forme prometteuse pour étudier le mécanisme et les traitements de la maladie, directement dans le contexte des tissus humains avec la polyvalence et le débit de la culture cellulaire. Les organoïdes rétiniens humains matures sont utilisés pour dépister les traitements pharmaceutiques potentiels pour la maladie dégénérative rétinienne liée à l’âge télangiectasie maculaire de type 2 (MacTel).

Nous avons récemment montré que MacTel peut être causé par des niveaux élevés d’une espèce lipidique atypique, les désoxysphingolipides (deoxySLs). Ces lipides sont toxiques pour la rétine et peuvent entraîner la perte de photorécepteurs qui se produit chez les patients MacTel. Pour dépister la capacité des médicaments à prévenir la toxicité des photorécepteurs du désoxySL, nous avons généré des organoïdes rétiniens humains à partir d’une lignée de cellules souches pluripotentes non induites par MacTel (CSPi) et les avons mûris jusqu’à un âge post-mitotique où ils développent toutes les cellules dérivées de la lignée neuronale de la rétine, y compris les photorécepteurs fonctionnellement matures. Les organoïdes rétiniens ont été traités avec un métabolite deoxySL et l’apoptose a été mesurée dans la couche photoréceptrice par immunohistochimie. À l’aide de ce modèle de toxicité, des composés pharmacologiques qui empêchent la mort des photorécepteurs induite par le désoxySL ont été examinés. À l’aide d’une approche candidate ciblée, nous avons déterminé que le fénofibrate, un médicament couramment prescrit pour le traitement de l’hypercholestérolémie et des triglycérides, peut également prévenir la toxicité du désoxySL dans les cellules de la rétine.

L’écran de toxicité a permis d’identifier avec succès un médicament approuvé par la FDA qui peut prévenir la mort des photorécepteurs. Il s’agit d’une découverte directement exploitable en raison du modèle hautement pertinent pour la maladie testé. Cette plateforme peut être facilement modifiée pour tester un certain nombre de facteurs de stress métaboliques et d’interventions pharmacologiques potentielles pour la découverte de futurs traitements dans les maladies de la rétine.

Introduction

La modélisation des maladies humaines dans des cultures cellulaires et des modèles animaux a fourni des outils inestimables pour la découverte, la modification et la validation de thérapies pharmacologiques, leur permettant de passer d’un médicament candidat à un traitement approuvé. Bien qu’une combinaison de modèles in vitro et non humains in vivo soit depuis longtemps un élément essentiel du pipeline de développement de médicaments, ils échouent souvent à prédire les performances cliniques des nouveaux candidats^{médicaments 1}. Il existe un besoin évident de développer des technologies qui comblent le fossé entre les monocultures cellulaires h....

Protocole

1. Décongélation, passage et expansion des CSPi/CSE

REMARQUE : Pour toutes les étapes de culture cellulaire, utilisez les meilleures pratiques pour maintenir une culture cellulaire stérile.

1. Enduire une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec un milieu matriciel membranaire basal.
   1. Pour préparer 1x de ce milieu, suivre les spécifications du produit ou diluer 75 μL de milieu matriciel froid avec 9 mL de DMEM/F12. Ajouter 1,5 mL de 1x milieu fraîchement préparé par puits dans une assiette de 6 puits. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
   2. Aspirer le milieu de la matrice membranaire basale et rincer chaque puits avec 3 m....

Résultats

Les organoïdes rétiniens ont été générés à partir d’une lignée iPSC non témoin MacTel. Après que les organoïdes aient atteint 26 semaines en culture, ils ont été sélectionnés et divisés en groupes expérimentaux. Les organoïdes ont été traités avec des concentrations variables de désoxySA pour déterminer si le désoxySA est toxique pour les photorécepteurs. Quatre concentrations de désoxySA ont été testées, de 0 à 1 μM (Figure 2) et les organoïdes ont été t.......

Discussion

Variations du protocole de différenciation
Depuis l’invention des cupules optiques autoformées par le groupe²⁰ de Yoshiki Sasai, de nombreux laboratoires ont développé des protocoles pour générer des organoïdes rétiniens qui peuvent varier à presque chaque étape 5,18,19,21. Une liste exhaustive des protocoles peut être trouvée dans Capow.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503