Farmasötik Keşif için İnsan Retinal Organoidlerinde Toksisite Taramaları

Özet

Burada, olgun insan retinal organoidleri üretmek ve bunları yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için farmasötik adayları tanımlamak için bir fotoreseptör toksisite testinde kullanmak için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Özet

Organoidler, hücre kültürünün çok yönlülüğü ve verimi ile doğrudan insan dokusu bağlamında hastalık mekanizmasını ve tedavilerini incelemek için umut verici bir platform sağlar. Olgun insan retinal organoidleri, yaşa bağlı retinal dejeneratif hastalık maküler telanjiektazi tip 2 (MacTel) için potansiyel farmasötik tedavileri taramak için kullanılır.

Son zamanlarda MacTel'in atipik bir lipit türü olan deoksisfingolipidlerin (deoksiSL'ler) yüksek seviyelerinden kaynaklanabileceğini gösterdik. Bu lipitler retina için toksiktir ve MacTel hastalarında meydana gelen fotoreseptör kaybına neden olabilir. İlaçları deoksiSL fotoreseptör toksisitesini önleme yetenekleri açısından taramak için, MacTel kaynaklı olmayan bir pluripotent kök hücre (iPSC) hattından insan retinal organoidleri ürettik ve bunları fonksiyonel olarak olgun fotoreseptörler de dahil olmak üzere retinanın tüm nöronal soy türevi hücrelerini geliştirdikleri mitotik bir yaşa olgunlaştırdık. Retinal organoidler deoksiSL metaboliti ile tedavi edildi ve immünohistokimya kullanılarak fotoreseptör tabaka içinde apoptoz ölçüldü. Bu toksisite modeli kullanılarak, deoksiSL kaynaklı fotoreseptör ölümünü önleyen farmakolojik bileşikler tarandı. Hedeflenen bir aday yaklaşım kullanarak, yüksek kolesterol ve trigliseritlerin tedavisi için yaygın olarak reçete edilen bir ilaç olan fenofibratın, retina hücrelerinde deoksiSL toksisitesini de önleyebileceğini belirledik.

Toksisite taraması, fotoreseptör ölümünü önleyebilen FDA onaylı bir ilacı başarıyla tanımladı. Bu, test edilen hastalıkla ilgili yüksek model nedeniyle doğrudan eyleme geçirilebilir bir bulgudur. Bu platform, retina hastalıklarında gelecekteki tedavi keşfi için herhangi bir sayıda metabolik stresörü ve potansiyel farmakolojik müdahaleleri test etmek için kolayca değiştirilebilir.

Giriş

İnsan hastalığının hücre kültüründe ve hayvan modellerinde modellenmesi, farmakolojik terapötiklerin keşfi, modifikasyonu ve doğrulanması için paha biçilmez araçlar sağlamış ve aday ilaçtan onaylanmış tedaviye ilerlemelerini sağlamıştır. İn vitro ve insan dışı in vivo modellerin bir kombinasyonu uzun zamandır ilaç geliştirme boru hattının kritik bir bileşeni olmasına rağmen, yeni ilaç adaylarının klinik performansını tahmin etmekte sıklıkla başarısız olmaktadırlar¹. Basit insan hücresel monokültürleri ile klinik çalışmalar arasındaki boşluğu dolduran teknolojilerin geliştirilmesine açık bir ihtiyaç vardır. Kendi kendini organize eden üç boyutlu doku kültürleri, organoidlerdeki son teknolojik gelişmeler, modelledikleri dokulara sadakatlerini geliştirmiş ve onları klinik öncesi ilaç geliştirme boru hattında umut verici araçlar haline getirmiştir².

İnsan hücre kültürünün insan olmayan in vivo modellere göre en büyük avantajı, insanlar ve fareler gibi daha yüksek dereceli omurgalılar arasında bile önemli ölçüde değişebilen insan metabolizmasının spesifik karmaşıklıklarını çoğaltma yeteneğidir³. Bununla birlikte, bu özgüllük, doku karmaşıklığındaki bir kayıpla gölgelenebilir; Çoklu hücre tiplerinin karmaşık bir şekilde iç içe geçtiği ve bir monokültürde çoğaltılamayan hücresel alt tipler arasında benzersiz bir simbiyotik metabolik etkileşime sahip olduğu retina dokusu için de durum böyledir⁴. Hücre kültürünün erişilebilirliği ve ölçeklenebilirliği ile karmaşık insan dokularının bir faksını sağlayan insan organoidleri, bu hastalık modelleme platformlarının eksikliklerinin üstesinden gelme potansiyeline sahiptir.

Kök hücrelerden elde edilen retinal organoidlerin, insan nöral retinasının karmaşık dokusunun modellenmesinde özellikle sadık olduğu kanıtlanmıştır⁵. Bu, retinal organoid modelini retina hastalığının araştırılması ve tedavisi için umut verici bir teknoloji haline getirmiştir ^6,7. Bugüne kadar retinal organoidlerdeki hastalık modellemesinin çoğu, retinal organoidlerin hastalığa neden olan genetik varyantlara sahip iPSC hatlarından türetildiği monogenik retinal hastalıklara odaklanmıştır⁷. Bunlar genellikle gelişimsel fenotipler olarak ortaya çıkan oldukça penetrant mutasyonlardır. Genetik mutasyonların ve çevresel stresörlerin normal olarak gelişen dokuyu etkilediği yaşlanan hastalıklar üzerinde etkili bir şekilde daha az çalışma yapılmıştır. Yaşlanmanın nörodejeneratif hastalıkları, karmaşık genetik mirasa ve kısa süreli hücre kültürleri kullanılarak modellenmesi doğal olarak zor olan çevresel stresörlerin katkılarına sahip olabilir. Bununla birlikte, birçok durumda, bu karmaşık hastalıklar, tamamen gelişmiş bir insan dokusu üzerinde test edildiğinde^{, 8 yaşın} nörodejeneratif hastalıklarına güçlü bilgiler sağlayabilen ortak hücresel veya metabolik stresörler üzerinde birleşebilir.

Geç başlangıçlı maküler dejeneratif hastalık olan maküler telanjiektazi tip II (MacTel), yaygın bir metabolik defekt üzerinde birleşen genetik olarak karmaşık bir nörodejeneratif hastalığın harika bir örneğidir. MacTel, makulada fotoreseptör ve Müller glia kaybı ile sonuçlanan, merkezi görmede^ilerleyici bir kayba yol açan nadir görülen retinal dejeneratif bir yaşlanma hastalığıdır 9,10,11,12,13. MacTel'de, belirlenmemiş, muhtemelen çok faktörlü, genetik bir kalıtım, hastalarda dolaşımdaki serinde ortak bir azalmaya neden olur ve bu da deoksisfengolipitler (deoksiSL) adı verilen nörotoksik bir lipit türünde artışa neden ^olur14,15. DeoksiSL birikiminin retina için toksik olduğunu kanıtlamak ve potansiyel farmasötik terapötikleri doğrulamak için, insan retinal organoidlerinde fotoreseptör toksisitesini test etmek için bu protokolü geliştirdik¹⁴.

Burada, insan retinal organoidlerini ayırt etmek, organoidleri kullanarak bir toksisite ve kurtarma testi oluşturmak ve sonuçları ölçmek için özel bir protokolün ana hatlarını çiziyoruz. Şüpheli bir hastalığa neden olan ajan olan deoksiSL'nin dokuya özgü toksisitesini belirlediğimiz ve deoksiSL kaynaklı retina toksisitesinin potansiyel tedavisi için güvenli bir jenerik ilaç olan fenofibratın kullanımını doğruladığımız başarılı bir örnek sunuyoruz. Önceki çalışmalar, fenofibratın hastalarda deoksiSL'nin bozulmasını artırabileceğini ve dolaşımdaki deoksiSL'yi azaltabileceğini göstermiştir, ancak deoksiSL'ye bağlı retina toksisitesini azaltmadaki etkinliği test edilmemiştir^16,17. Her ne kadar spesifik bir örnek sunsak da, bu protokol herhangi bir sayıda metabolik/çevresel stresörün ve potansiyel terapötik ilaçların retina dokusu üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılabilir.

Protokol

1. iPSC'leri/ESC'leri çözme, geçirme ve genişletme

NOT: Tüm hücre kültürü adımlarında, steril bir hücre kültürünü korumak için en iyi uygulamaları kullanın.

1. 6 delikli bir hücre kültürü plakasını bazal membran matris ortamı ile kaplayın.
   1. Bu ortamın 1x'ini hazırlamak için ürün spesifikasyonlarını takip edin veya 75 μL soğuk matris ortamını 9 mL DMEM/F12 ile seyreltin. 6 delikli bir plakaya kuyucuk başına 1,5 mL taze hazırlanmış 1x ortam ekleyin. 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   2. Bazal membran matris ortamını aspire edin ve her bir kuyucuğu 3 mL DMEM / F12 ile durulayın. 2 mL DMEM/F12 ekleyin ve kullanıma kadar 37 °C'de inkübe edin. Plakayı hazırlandığı gün kullanın.
2. PBS'de 10 mM'lik bir kaya inhibitörü (Y-27632 dihidroklorür) stok çözeltisi hazırlayın ve kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
3. Bir şişe iPSC/ESC'yi DMEM/F12 ortamına çözün ve 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve peleti mTeSR ortamında yeniden askıya alın. 10 μM kaya inhibitörü (Y-27632 dihidroklorür) ile mTeSR ortamında kaplanmış 6 kuyucuklu bir kuyuya plaka 1 şişe hücre yerleştirin ve inkübatörde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, medyayı aspire edin ve sadece mTeSR'yi geri ekleyin.
   NOT: Ortam geçene kadar her gün medyayı değiştirin.
4. 500 mL PBS'de 500 μL 0,5 M EDTA'yı seyrelterek PBS'de 0,5 mM EDTA hazırlayın.
5. Geçiş hücreleri% 80-90 akıcılığa ulaştıklarında hücreler. Hücrelerin büyüme hızına bağlı olarak, hücreleri kuyu başına 1: 3 veya 1: 6 bölün.
   1. Yapışmış hücreleri plakadan çıkarmak için, ortamı aspire edin ve PBS'de oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0,5 mM EDTA ile inkübe edin. İnkübasyondan sonra, EDTA çözeltisini çıkarın ve 1 mL mTeSR ortamını p1000 pipetli hücrelere zorla çıkararak hücreleri kaldırın.
   2. Yapışmış kalan hücreleri çıkarmak için mTeSR ortamını ve hücrelerini 5x'e kadar emmeye ve zorla çıkarmaya devam edin. Plaka hücreleri, mTeSR ortamı ile taze bir bazal membran matris kaplamalı 6 delikli plaka üzerine. Plakalar tekrar% 80-100 akıcılığa ulaşana kadar medyayı günlük olarak değiştirmeye devam edin.
6. Hücreler tam 6 delikli bir plakaya genişledikten ve% 80-100 akıcılığa ulaştıktan sonra, sonraki farklılaşmalar için hücre hattını genişletmek veya kriyoprezervasyon için dondurmak için bir kuyucuk ayırın. Embriyoid cisimleri yaparak farklılaşma sürecine başlamak için kalan beş kuyucuğu kullanın.

2. Embriyoid cisimlerin (EB'ler) yapımı

NOT: EB oluşumu ve farklılaşma ortamı tarifleri Cowan ve ^ark.5, Ohlemacher ve ark.18 ve Zhong ve ^ark.19'daki protokollerden türetilmiştir.

1. Aşağıda açıklandığı gibi 1x Dispase çözeltisi ve Nöral İndüksiyon Ortamı (NIM) hazırlayın.
   1. Tozu DMEM/F12 içinde çözerek 10 mg/mL 5x stok Dispase çözeltisi hazırlayın. 0,22 μm filtre kullanan steril filtre. Kullanıma kadar -20 °C'de 1 mL alikot saklayın.
   2. 5x Dispase çözeltisini kullanarak, DMEM / F12'de 1 mL / kuyu 2 mg / mL Dispase hazırlayın. Çözeltiyi 37 ° C'de 30 dakika ısıtın.
   3. DMEM / F12'yi% 1 N2 takviyesi,% 1 MEM NEAA ve% 180 U / mg'da 2 mg / mL heparin ile destekleyerek NIM'i hazırlayın.
2. 16 mL'lik 3:1 mTeSR:NIM (12mL:4mL) karışımı çözeltisini hazırlayın ve oda sıcaklığına ısıtın.
3. Farklılaşmış hücreleri çıkarın ve sıcak Dispase çözeltisi ekleyin.
   1. Farklılaşan hücreleri iPSC'ler/ESC'ler hücre kültüründen çıkarın. Diseksiyon kapsamı altında, opak beyaz kolonileri bir p10 pipet ucu ile kazıyın. Kültür kuyularından mTeSR ortamını aspire edin. Bu, yeni kazınmış olan farklılaşmış kümeleri kaldıracaktır.
   2. Hemen önceden ısıtılmış Dispase çözeltisini ekleyin ve hücre kolonilerinin kenarlarının çoğu mikroskop altında kıvrılmaya başlayana kadar 37 ° C'de inkübe edin. Bu 4-8 dakika sürecektir.
      NOT: Dispase'deki hücrelerin kuluçka süresi her laboratuvar için belirlenmelidir. Süre hücre hatları arasında farklılık gösterebilir ve 3 gün veya daha uzun süre kaplanmış hücreler için daha uzun bir inkübasyon gereklidir. Akıcılığa ulaşması 3 günden fazla süren yavaş büyüyen iPSC'ler / ESC'ler, plakaya daha fazla güçle yapışmaya başlayacak ve bu da hücrelerin kaldırılmasını zorlaştıracaktır. Yavaş büyüyen hücreler için, kaplamadan akıcılığa kadar geçen süreyi azaltmak için tam 6 delikli bir plakaya genişlemek için hücreleri 1: 2'de geçirmeyi deneyin.
4. Çözeltiyi aspire edin ve kuyucuk başına en az 2 mL DMEM / F12 ortamını yavaşça geri ekleyin. DMEM / F12 ortamını yavaşça kuyunun yanına ekleyin, hücrelerin yerinden çıkmamasına dikkat edin.
   1. DMEM / F12 ortamını aspire edin, daha sonra hücre kolonilerini plakadan kaldırmak için doğrudan hücrelere taze 1 mL DMEM / F12'yi zorla geri ekleyin. Bir p1000 pipet ile, mümkün olduğunca çok sayıda hücre kolonisini yerinden çıkarmak için DMEM / F12'yi tekrar tekrar emer ve kuyudaki DMEM/F12'yi 5 kata kadar zorla çıkarır.
      NOT: Farklılaştırıcı/farklılaştırılmış iPSC'ler/ESC'ler, farklılaşmamış iPSC'lerden/ESC'lerden daha fazla plakaya yapışır. Tekrarlanan pipetleme ile çıkmayan hücreler en iyi şekilde geride bırakılır. Aşırı pipetleme hücreleri öldürür ve EB üretiminin verimliliğini azaltır. Hücre kümeleri, küme başına 100-400 hücreye sahip olacaktır.
5. Yüzen kolonileri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve kalan yüzen kolonileri toplamak için kuyucukları kuyu başına ilave 1 mL DMEM/F12 ortamı ile durulayın.
6. Yüzen kolonilerin yerçekimi ile en fazla 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Yerleştikten sonra, 1-2 mL süpernatan hariç hepsini çıkarın. Alttaki yumuşak peleti çalkalamamaya dikkat edin.
7. Peletleri önceden ısıtılmış 3:1 mTeSR:NIM ortamında tekrar askıya alın ve ultra düşük bağlantılı T75 şişeye aktarın. EB'lerin oluşmasına izin vermek için gece boyunca kuluçkaya yatın. Bu, farklılaşmanın 0. Günü olarak kabul edilecektir.
8. EB'lerin nöral progenitörlere farklılaşmasına başlamak için medyayı kademeli olarak NIM olarak değiştirin.
   1. Ertesi gün, ortamı çıkarın ve 10 mL 1:1 mTeSR:NIM ortamıyla değiştirin. Serbest yüzen EB kültüründen medyayı kaldırmak için, EB'lerin şişenin alt köşesine toplanması için şişeyi yukarı doğru çevirin. Süpernatanı aspire edin, alttaki peletteki EB'lerin hiçbirini aspire etmediğinizden emin olun.
   2. Ertesi gün, ortamı 10 mL 1:3 mTeSR:NIM ortamıyla değiştirin.
   3. Ertesi gün, medyayı tam NIM ortamıyla değiştirin. Dispase tedavisini takip eden 7 güne kadar NIM ortamı ile her 2 günde bir ortam değiştirmeye devam edin.

3. EB'lerin kaplanması ve nöral retina farklılaşmasının başlatılması

1. Dispase işleminden bir hafta sonra, serbest yüzen EB'leri, büyüme faktörü azaltılmış bazal membran matris ortamı ile kaplanmış 6 delikli bir plaka üzerine plakalayın. Kaplama plakası için adım 1.1'e bakın.
   1. EB'lerden harcanan medyayı aspire edin ve 12 mL NIM ile değiştirin.
   2. EB'leri yeniden askıya almak için EB içeren medyayı ajite ederek EB'lerin her bir kuyucuğa eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlayın, ardından medyanın 1 / 6'sını (2 mL) hızla çıkarın ve bir kuyuya dağıtın. Kalan kuyular için tekrarlayın.
   3. İnkübasyondan önce, EB'leri eşit şekilde dağıtmak için plakayı yavaşça ileri geri sallayın, sonra yan yana sallayın. EB'ler ortada kümelenirse, düzgün bir şekilde ayırt edilmezler.
      NOT: Kaplama yoğunluğu, farklılaşma için kritik öneme sahiptir. Kuyu başına 30 EB'den daha büyük plakalar taktığınızdan emin olun. EB'lerin üretimi verimli değilse, EB'leri daha az kuyuya dağıtın.
2. NIM ortamı ile medyayı günlük olarak değiştirin. Kuyulardaki medya seviyesini ~ 3 mL'de tutun. Ortamı değiştirirken, kaplanmış EB'leri kurutmamak için 1 mL dışındaki tüm ortamları çıkarın ve hücreleri plakadan kaldırmamak için kuyunun yan tarafına yavaşça 2 mL ortam ekleyin.
3. EB'lerin kaplanmasından dokuz gün sonra, iki gün boyunca medyayı NIM'den Retinal Diferansiyasyon Medyasına (RDM) değiştirmeye başlayın.
   1. Aşağıdakileri karıştırarak RDM'yi hazırlayın:% 48 DMEM / F12 (1: 1) ve% 48 DMEM, A vitamini içermeyen% 2 B27 takviyesi,% 1 MEM NEAA ve% 1 Pen-Strep ile desteklenmiştir. Filtre 0,20 μm filtre kullanarak sterilize edin. RDM, 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
   2. İlk gün, medyayı 1:1 NIM:RDM karışımına geçirin. İkinci gün, medyayı RDM olarak değiştirin. Sonraki tüm günlerde, besleme hücreleri RDM.
      NOT: Önümüzdeki birkaç hafta boyunca, kaplanmış EB'ler, gözle görülür şekilde pigmentli RPE üretmeye başlayan nöral retinal progenitörler oluşturacaktır.

4. Serbest yüzen organoidlerin yapılması ve serbest yüzen organoid kültürlerin korunması

1. EB'leri, ilk Dispase işleminden sonraki 28 günde (EB kaplamadan 21 gün sonra), 1-2^mm2'lik bir ızgarayı kaplanmış EB'lere kesmek için steril bir neşter kullanarak parçalayın. Bu, retinal progenitör kolonileri küçük parçalara ayıracaktır, böylece gelişimin ilerleyen aşamalarında çok büyük olmayacaklar ve merkezlerindeki yetersiz besin değişiminden kaynaklanan nekrozlar olmayacaktır.
2. Kaplama EB'leri ayırın.
   1. Bunu yapmak için, önce her bir kuyucuğa ek 2 mL RDM ekleyin. Daha sonra bir p1000 pipet kullanarak kuyucuklardan ~1000 μL ortam aspire edin. Şimdi medyayı, ucu tamamen suya batırılmış halde doğrudan kaplamalı EB'lerin üzerine zorla çıkarın.
   2. Tüm hücreler plakadan kaldırılana kadar bunu tekrarlayın. Ortamın çıkarılması sırasında ucu suya batırılmış halde tutun ve kabarcıkları önlemek için pipet pistonunu ilk durağın ötesine itmeyin.
3. Yeni ayrılan EB parçalarını steril plastik 125 mL Erlenmeyer şişesine yeniden askıya alın ve şişeyi ~ 40 mL RDM ortamı ile doldurun. Şişeyi standart bir inkübatöre yerleştirilmiş bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin. Çalkalayıcı hızını 130-140 RPM'ye ayarlayın (hız ayarı 3).
   NOT: Organoidlerin bir çalkalayıcı üzerinde kültürlenmesi, daha yüksek bir organoid konsantrasyonunda kültürlenirken birbirine yapışmalarını önler. Biyoreaktörler de aynı sonuçlara ulaşır, ancak bir çalkalayıcı daha ucuzdur.
4. Organoidleri kısmi bir ortam değişimi ile besleyin, ortamın ne kadar sarı aldığına bağlı olarak haftada yaklaşık 12 mL RDM'yi haftada 2-3 kez değiştirin. Erken organoidler çok fazla beslenmeye ihtiyaç duymayacaklar, ancak büyüdükçe daha fazla medya ile daha sık medya değişikliklerine ihtiyaç duyacaklar.
5. Retinal olmayan, aşırı büyümüş ve ölmekte olan organoidleri çıkarmak için her iki haftada bir organoidleri budayın. Bu, ortam israfını önler ve kalan retinal organoidlerin sağlığını iyileştirir.
   1. Hücreleri şişelerinden 5 mL'lik bir pipet kullanarak 6 delikli bir tabağa veya 10 cm'lik bir kaba aktarın. Tabakalı nöroepitel gösteren organoidleri saklayın (Şekil 1A, yıldız işareti). Bu organoidler şeffaf ve beyazdır.
   2. Kötü biçimlendirilmiş veya aşırı büyümüş retinal organoidleri ve retinal olmayan organoidleri 5 mL'lik bir pipetle ayıklayın ve çıkarın. Bunlar genellikle opak ve sarımsı olacaktır (Şekil 1A). Ayrıca tabakalı bir nöroepitel gibi görünmeyen her şeyi çıkarın. İlk birkaç budama emek yoğun olacaktır, ancak organoidler daha büyük ve daha homojen hale geldikçe sonraki her seferinde çok daha kolay hale gelecektir (Şekil 1B).

5. Olgun organoidlerin korunması ve mitotik retina dokusuna farklılaştırılması

1. EB oluşumu için ilk Dispase tedavisini takip eden 56. günde (8. hafta) (bir şişede yerinden çıkmış EB'lerin kültürlenmesinden 28 gün sonra) organoid ortamı RDM + olarak değiştirin. Bu, retina dokusu olarak tamamen olgunlaşmış organoidlere ekstra besin sağlayacaktır.
   1. PBS'de 100 mM taurin hazırlayın. Alikotları kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
   2. RDM'yi% 10 FBS, 100 μM Taurin ve 2 mM ticari glutamin takviyesi ile destekleyerek RDM + 'yı hazırlayın. Filtre 0,20 μm filtre kullanarak sterilize edin.
   3. RDM + ortamını haftada 2-3 kez değiştirmeye devam edin.
2. 17-18. haftalarda (Dispase sonrası tedavi) organoidleri Erlenmeyer şişesinden 5 mL'lik bir pipet kullanarak ultra düşük bir bağlantı 6 delikli plakaya aktarın. İlk hafta boyunca, organoidler artık birbirine yapışmayana kadar organoidleri günlük olarak budamaya ve birbirinden ayırmaya devam edin. Optimal yoğunluk kuyu başına 10-15 organoiddir. Medyayı haftada 2-3 kez değiştirin.
   NOT: Organoidler sık sık birbirine yapışıyorsa veya ortam değişiklikleri arasında ortam çok sarıya dönüyorsa, kuyu başına düşen organoid sayısını azaltın.
3. Organoidlerin, nöral retinal hücrelerin mevcut olduğu 18⁵ . haftaya kadar tamamen post-mitotik hale gelmesini bekleyin. 24. haftaya kadar, organoidin dışında ilkel dış segmentlerin oluşumunu kontrol edin. 26-28. haftalara kadar dış segmentlerin organoidlerin dışında kalın olduğundan emin olun (Şekil 1C). Organoidlerin olgun bir farklılaşma durumunu gösteren dış segmentleri tanımladığı 26. haftadan sonra toksisite testleri yapın.
   NOT: Toksisite testi için sadece iyi diferansiye retinal organoidler kullanın. İyi tanımlanmış dış segmentlere sahip organoidler üzerinde toksisite testi yapılması, tanımlanmalarına izin verecektir.

6. Deoksisfinganin (deoksiSA) ve ilaç tedavisi

NOT: Burada 4 günlük süre boyunca deoksiSA toksisitesini kurtarmak için tek bir fenofibrat tedavisi sunulmaktadır (Şekil 2). Bununla birlikte, organoidlere eklenen deoksiSA konsantrasyonu, organoidler üzerinde deoksiSA tedavisinin süresi ve toksisiteyi kurtarmak için kullanılan ilacın türü¹⁴ , toksisite ve toksisite kurtarmayı test etmek için deneysel ihtiyaçlara göre değiştirilebilir.

1. Etanol içinde 1 mM stok deoksiSA çözeltisi hazırlayın. 1 ay boyunca -20 °C'de saklayın. Alternatif olarak, DMSO'da bir stok deoksiSA çözeltisi hazırlanabilir.
2. İlaç kurtarma için uygun bir toksik deoksiSA konsantrasyonunu belirlemek için seri bir deoksiSA seyreltmesi gerçekleştirin.
   NOT: İlk olarak, bir kurtarma etkisini ölçmek için yeterli hücre ölümüyle sonuçlanacak bir deoksiSA konsantrasyonu belirleyin. Konsantrasyon çok yüksekse, toksik yanıt organoidin parçalanmasına neden olur ve hiçbir kurtarma gözlenmez. Toksik yanıt çok düşükse, önemli bir kurtarma etkisi gözlemlemek zor olacaktır. DeoksiSA toksik yanıtı laboratuvardan laboratuvara ve partiden partiye deoksiSA arasında değişebilir.
   1. 1 mM deoxySA stok çözeltisini, her biri 3 mL RDM+ içinde 0,5 μM, 1 μM ve 2 μM konsantrasyonlarına seyreltin. Bir kontrol tedavisi hazırlamak için RDM + 'ya 3 μL etanol ekleyin.
   2. Diseksiyon mikroskobu altında, grup başına en az 5 organoid içeren 4 grup organoid seçmek için steril bir prob kullanın. Grupları, ultra düşük bir ataşman 6 delikli plakanın ayrı kuyucuklarına bölün. Yaklaşık olarak aynı boyut ve şekle sahip organoidleri seçin.
   3. Organoidlerden mümkün olduğunca fazla RDM + 'yı aspire edin. Her bir organoid kuyusuna, RDM + 'da bir konsantrasyon deoksiSA ekleyin. Organoidlerin dördüncü kuyusuna araç kontrolünü ekleyin.
   4. DeoxySA veya araçta iki günlük kültürden sonra, ortamı RDM + 'da taze hazırlanmış karşılık gelen deoksiSA seyreltmeleri ile değiştirin.
   5. Tedavinin dördüncü gününde, hücre ölümü için organoidleri işlemek ve test etmek için adım 7'ye geçin. Bir deoksiSA konsantrasyonu seçildikten sonra, fenofibrat ile tedavi etmek için adım 6.3'e devam edin.
      NOT: Seçilen deoksiSA tedavi grubunda hedef hücre ölümü, 10.000^μm2 başına 5 - 20 TUNEL pozitif hücredir. Organoidler, tedavi boyunca bir probun dokunuşuyla parçalanmamalıdır.
3. Organoidleri seçilen toksik dozda deoksiSA ve fenofibrat ile tedavi edin.
   1. DMSO'da 40 mM'lik bir fenofibrat stok çözeltisi hazırlayın. -20 °C'de 1 yıla kadar saklayın.
   2. İlaç tedavi ortamını hazırlayın: 3 mL RDM + 'da, 1 mM deoksiSA stok çözeltisini 1 μM deoksiSA'ya seyreltin ve 40 mM fenofibrat stok çözeltisini 20 μM'ye seyreltin.
   3. DeoksiSA arıtma ortamını hazırlayın: 3 mL RDM + 'da, 1 mM deoxySA stok çözeltisini 1 μM deoksiSA'ya seyreltin ve 1,5 μL DMSO ekleyin.
   4. Kontrol ortamını hazırlayın: 3 mL RDM+'da 3 μL etanol ve 1,5 μL DMSO ekleyin.
   5. Steril bir prob kullanan bir diseksiyon mikroskobu altında, grup başına en az beş organoid içeren üç organoid grubu seçin. Grupları, ultra düşük bir ataşman 6 delikli plakanın ayrı kuyucuklarına bölün.
   6. Hazırlanan tedavileri (deoksiSA, deoksiSA + fenofibrat veya kontrol) organoidlere ekleyin. İki gün sonra, kuyulardaki ortamı, karşılık gelen deoksiSA / fenofibrat / kontrol çözeltileri ile desteklenmiş taze hazırlanmış RDM + ile değiştirin.
   7. Tedavinin dördüncü gününde, hücre ölümü için organoidleri işlemek ve tahlil etmek için adım 7'ye geçin (Şekil 2).

7. Organoidlerin gömülmesi ve kriyokesim yapılması

1. 3 mL PBS'ye 1 mL% 16 PFA ampul ekleyerek taze% 4 PFA hazırlayın.
2. RDM+ ortamını organoidlerden çıkarın ve PBS ile bir kez durulayın. Organoidlerden mümkün olduğunca fazla PBS çıkarın. Organoidlere 2 mL taze hazırlanmış% 4 PFA (PBS'de) ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
3. 15 dakikalık inkübasyondan sonra, organoidleri 2 mL PBS ile iki kez durulayın, ardından PBS'de 10 dakika yıkayın.
   NOT: Kimyasal bir duman davlumbazında sabitleme gerçekleştirin ve PFA çözeltisini ve ardından gelen iki PBS durulamasını, duman davlumbazında depolanan uygun şekilde etiketlenmiş bir PFA atık kabına atın.
4. Tüm PBS'yi aspire edin, ardından sabit organoidlere PBS'de% 20 sakkaroz ekleyin. Organoidlerin sakkaroz çözeltisine karıştırıldığından ve üstte bir PBS kabarcığı içinde kalmadığından emin olun. Organoidleri, sakkaroz çözeltisinin dibine batana kadar, yani oda sıcaklığında ~ 1 saat batana kadar sakkaroz çözeltisinde tutun. Sabit organoidler sakkaroz çözeltisinde gece boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
5. Organoidleri OCT çözeltisine bir kriyokesim kalıbına gömün. Koşul başına birden fazla organoid tek bir kalıba gömülebilir. Organoidleri, en iyi retinal bölgelerinin kriyostat üzerinde kesitlenmesini ve organoidlerin ortasının kabaca aynı düzlemde olmasını sağlayacak şekilde yönlendirin. Gömülü organoidleri -20 °C'de dondurun. Gömülü organoidler -80 °C'de yıllarca saklanabilir.
   NOT: Dondurulmuş EKİP'te organoidleri görmek zordur; RPE kümelerini, organoid tanımlamayı kolaylaştırmak için bıçağın bakacağı kalıbın yanına doğru yönlendirin.
6. Kriyoseksiyon organoidleri 10-14 μm kalınlığında kesitlere ayırır ve kesitleri poli-L lizin ile muamele edilmiş slaytlara yapıştırır. Kriyoseksiyon yaparken, organoidlerin ortasını içeren bölümleri tanımlamak için slaytları mikroskop altında tekrar tekrar kontrol edin. Sadece tüm katmanların eşit olarak temsil edildiği organoidlerin orta dilimlerini toplayın (Şekil 2A-C, Şekil 3). Bölümlere ayrıldıktan sonra, slaytlar yıllarca -80 ° C'de bir slayt kutusunda saklanabilir.
   NOT: Organoidin uçlarına alınan dilimler, en dıştaki fotoreseptörleri aşırı örnekleyecektir ve nicelleştirme için uygun değildir. Ortalama büyüklükteki organoidler, tabakalaşmış retina tabakalarının bir kesitini temsil eden organoidin ortasından 10-15 dilim sağlayacaktır.

8. Apoptotik hücreler için TÜNEL boyama

1. Dondurulmuş slaytları 37 ° C'de 30 dakika boyunca çözün. Kızakların hemen 37 °C'ye yerleştirilmesi yoğuşmayı önler. Saf suya batırılmış doku örnekleri dokuyu bozabilir. 37 °C'lik bir inkübasyon, dokunun cam slayda yapışmasını da iyileştirir.
2. Hidrofobik bir kalem kullanarak doku bölümlerinin etrafındaki cam slaytta sürekli bir kenarlık oluşturun. Bu bir sınır sağlayacak ve az miktarda çözelti ile yeterli fiksasyon ve antikor inkübasyonları sağlayacaktır. 20 dakika boyunca yaklaşık 100-200 μL (hacim hidrofobik sınırlanmış bölgeyi dökülmeden dolduracaktır) taze hazırlanmış% 4 PFA ekleyin. Kimyasal bir duman davlumbazında sabitleme gerçekleştirin ve PFA çözeltisini duman davlumbazında depolanan uygun şekilde etiketlenmiş PFA atık kabına atın.
3. Slaytları PBS'de bir kez durulayın, ardından oda sıcaklığında 25 dakika boyunca PBS'de yıkayın.
4. TÜNEL karışımını hazırlayın. Hem mor hem de mavi şişeleri in situ hücre ölüm tespit kitinden çözün. 100 μL menekşe şişesi çözeltisini çıkarın (negatif bir kontrol için kullanılabilir) ve kalan 450 μL çözeltiyi menekşe şişesinden mavi şişeden 50 μL çözelti ile birleştirin. İyice karıştırın ve karanlıkta tutun. Her bir şişe seti (toplam 500 μL) 5-10 slaytı boyayabilir.
5. Doku dilimlerini geçirgenleştirin.
   1. Permeabilizasyon Çözeltisi Hazırlayın:% 0.1 TritonX-100 ve% 0.1 Sodyum Sitrat İçeren PBS
   2. PBS'yi örnek slaytlardan çıkarın ve ardından örneklere Permeabilizasyon Çözümü ekleyin. Buz bloğunda veya 4 ° C'de 2 dakika inkübe edin. Bunu takiben, PBS'de bir kez durulayın, ardından PBS'de 10 dakika yıkayın.
6. PBS'yi çıkarın ve katlanmış bir dokunun köşesini kullanarak mümkün olduğunca fazla çözelti kurutun. Hidrofobik kalemle çizilen alanın büyüklüğüne bağlı olarak numunelere 50-100 μL hazırlanmış TÜNEL karışımı ekleyin. Cam kapak kayması ile örtün ve karanlıkta 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Aşağıdaki adımlar için tüm inkübasyonlar ve yıkamalar, floroforların ağartılmasını önlemek için karanlıkta yapılmalıdır. Işığı engellemek için karanlık bir kutu kullanın veya slaytları alüminyum folyo ile örtün.
7. Fotoreseptörleri etiketleyin. PBS ile bir kez durulayın, ardından PBS'de 20 dakika yıkayın. PBS'yi çıkarın, ardından PBS'de% 0.1 Tween ve% 5 eşek serumu ile 1:500 seyreltilmiş birincil Recoverin antikoru (tavşan anti-Recoverin) ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
8. Birincil antikoru çıkardıktan sonra, PBS'de bir kez durulayın, ardından PBS'de 20 dakika yıkayın. İkincil antikor, turuncu veya kırmızı florofor içeren eşek anti-tavşanı,% 0.1 Ara ve% 5 eşek serumu ile PBS'de 1: 1.000 seyreltilmiş ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. PBS ile bir kez durulayın, ardından PBS'de 20 dakika yıkayın. PBS'de 1:1000'de DAPI ekleyin, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
9. PBS ile bir kez durulayın, ardından PBS'de 20 dakika yıkayın. PBS'yi çıkarın ve montaj ortamını ekleyin. Kapak kayması ekleyin, oje ile kapatın ve karanlıkta kurumaya bırakın. Slaytlar 4 °C'de karanlık bir kapta 1 haftaya kadar saklanabilir.
   NOT: En iyi görüntü kalitesi için ertesi gün fotoğraf çekin.

9. Organoid dilimlerin görüntülenmesi ve ölümün ölçülmesi.

NOT: Görüntüleme, üç florofor kanalı arasında ayrım yapma yeteneğine sahip bir konfokal mikroskop gerektirir. Bu deneyde yeşil (Alexa Fluor 488), turuncu (Alexa Fluor 555) ve UV (DAPI) kanalları kullanılmıştır. Floroforların herhangi bir kombinasyonu, emisyonların diğer kanallara akmamasını sağlamak için kullanılabilir.

1. Görüntüleme ve nicelleştirme için retina bölümlerini bulun. Mikroskobun düşük bir büyütmesi altında (5x veya 10x), fotoreseptörlerin sitoplazmasını etiketleyen Recoverin boyama ve tüm hücrelerin çekirdeklerini etiketleyen DAPI boyama, dilimlenmiş organoidin bozulmamış, iyi biçimlendirilmiş ve organoidin temsili bir kesitini örnekleyen bir düzlemde bulunan bir bölgesini bulmak için kullanın (Şekil 2 ve Şekil 3 ). En az birkaç hücre kalınlığında ayrı bir dış nükleer fotoreseptör tabakasına ve Recoverin boyamasına sahip olmayan ayrı ve farklı bir çekirdek tabakasına sahip bir bölüm bulun (Şekil 2 ve Şekil 3).
2. Görüntüyü çerçeveleyin. Mikroskobun büyütmesini 20x hedefe yükseltin ve görüntüyü fotoreseptör tabakasının mümkün olduğunca fazlasıyla doldurmak için slaytı çerçeveleyin (Şekil 3).
3. Z-düzlemini ayarlayın. Z-yığınlarını görüntüleyen bir mikroskop kullanıyorsanız, dilimin tüm derinliğini görüntülemek için Z aralığının üst ve alt sınırlarını ayarlayın. Deneysel bir setteki tüm görüntüler için aynı Z-yığını kalınlığını kullanın, böylece tüm numunelerde aynı miktarda doku test edilir. Z yığınlarını görüntüleyen bir mikroskop kullanmıyorsanız, görüntüyü dilimin ortasına odaklayın.
4. Bir Z-yığını ediniminde üç florofor kanalını da görüntüleyin. Ölmekte olan bir hücreyi pozitif olarak tanımlamak için her üç kanal da gereklidir. Organoid başına bir alan görüntüleyin.
5. Görüntü kümesini, piksel başına alan oranını koruyan bir dosya biçiminde kaydedin.

10. Ölmekte olan hücrelerin nicelleştirilmesi

1. FIJI (Resim J) yazılımında görüntü yığınlarını açın. Biyo-Biçimler İçe Aktarma Seçenekleri penceresinde, "ayrı pencerelere böl" bölümünün altındaki hiçbir kutunun seçili olmadığından emin olun. Hizalanmış görüntü kanalları arasında kaydırma yapmak, hücreleri uygun şekilde tanımlamak için kritik öneme sahiptir.
2. Görüntü > Yığınlar'a tıklayarak Z-stack görüntü kümesini düzleştirin ve ardından açılır menüden 'Z projesi'ni seçin. Bu, niceleme için yeni bir görüntü oluşturacaktır. Organoidler Z serisinde görüntülenmediyse, bu adımı atlayın.
3. Recoverin boyama işlemini gösteren görüntü kanalını seçin (bu örnekte kırmızı). Araç çubuğundaki çokgen seçim aracına tıklayın ve görüntüdeki fotoreseptörlerin sürekli bir bölgesini özetleyin (Şekil 3A). Ölçümleri Analiz Et > Ayarla'ya tıklayın. Ölçümleri Ayarla açılır penceresinde, Alan'ın yanındaki kutuyu seçin, Analiz Et'e tıklayın ve ölmekte olan hücreleri saymak üzere fotoreseptörlerin alanını ölçmek için Ölçüm'ü seçin (veya kısayol olarak "m" tuşuna basın). Alan ölçümü bir açılır pencere ölçümleri penceresinde görünür.
4. Daha önce seçilen fotoreseptör bölgesindeki TUNEL-pozitif çekirdekleri sayın (Şekil 3B, C). Araç çubuğundaki nokta aracına sağ tıklayın ve çok noktalı aracı seçin. Sadece TUNEL kanalında, DAPI pozitif çekirdeklerle örtüşen TUNEL pozitif boyama ve Recoverin boyama üzerine tıklayın. Pozitif hücreleri doğrulamak için kanallar arasında geçiş yapın.
5. Organoid başına fotoreseptörlerde hücre ölümü için normalleştirilmiş bir değer elde etmek için TUNEL pozitif hücrelerin sayısını bölgeye bölün (Şekil 2D, E).

Sonuçlar

Retinal organoidler MacTel olmayan bir kontrol iPSC hattından üretildi. Organoidler kültürde 26 haftaya ulaştıktan sonra seçildi ve deney gruplarına ayrıldı. Organoidler, deoksiSA'nın fotoreseptörler için toksik olup olmadığını belirlemek için değişen konsantrasyonlarda deoksiSA ile muamele edildi. Dört deoksiSA konsantrasyonu, 0 ila 1 μM arasında test edildi (Şekil 2) ve organoidler her geçen gün medya değişiklikleri ile 8 gün boyunca tedavi edildi. DeoksiSA'ya ...

Tartışmalar

Farklılaştırma protokolü varyasyonları
Yoshiki Sasai'nin grup 20 tarafından kendi kendini oluşturan optik kapların icadından bu yana, birçok laboratuvar neredeyse her adımda^{değişebilen} retinal organoidler üretmek için protokoller geliştirmiştir ^5,18,19,21. Protokollerin ayrıntılı bir listesi Capowski ve ^{ark.22'de<...}

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503