Screening di tossicità negli organoidi retinici umani per la scoperta farmaceutica

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo passo-passo per generare organoidi retinici umani maturi e utilizzarli in un test di tossicità dei fotorecettori per identificare i candidati farmaceutici per la malattia degenerativa retinica legata all'età telangiectasia maculare di tipo 2 (MacTel).

Abstract

Gli organoidi forniscono una piattaforma promettente per studiare il meccanismo e i trattamenti della malattia, direttamente nel contesto del tessuto umano con la versatilità e la produttività della coltura cellulare. Gli organoidi retinici umani maturi sono utilizzati per lo screening di potenziali trattamenti farmaceutici per la telangiectasia maculare legata all'età della malattia degenerativa della retina di tipo 2 (MacTel).

Abbiamo recentemente dimostrato che MacTel può essere causato da livelli elevati di una specie lipidica atipica, i desossisfingolipidi (deossiSL). Questi lipidi sono tossici per la retina e possono guidare la perdita di fotorecettori che si verifica nei pazienti MacTel. Per esaminare i farmaci per la loro capacità di prevenire la tossicità dei fotorecettori deossiSL, abbiamo generato organoidi retinici umani da una linea di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) non MacTel e li abbiamo maturati fino a un'età post-mitotica in cui sviluppano tutte le cellule derivate dalla linea neuronale della retina, compresi i fotorecettori funzionalmente maturi. Gli organoidi retinici sono stati trattati con un metabolita deossiSL e l'apoptosi è stata misurata all'interno dello strato fotorecettore utilizzando l'immunoistochimica. Utilizzando questo modello di tossicità, sono stati sottoposti a screening i composti farmacologici che prevengono la morte dei fotorecettori indotta da deossiSL. Utilizzando un approccio candidato mirato, abbiamo determinato che il fenofibrato, un farmaco comunemente prescritto per il trattamento del colesterolo alto e dei trigliceridi, può anche prevenire la tossicità del deossiSL nelle cellule della retina.

Lo schermo di tossicità ha identificato con successo un farmaco approvato dalla FDA che può prevenire la morte dei fotorecettori. Questo è un risultato direttamente attuabile grazie al modello altamente rilevante per la malattia testato. Questa piattaforma può essere facilmente modificata per testare qualsiasi numero di fattori di stress metabolici e potenziali interventi farmacologici per la futura scoperta del trattamento nelle malattie retiniche.

Introduzione

La modellazione delle malattie umane in colture cellulari e modelli animali ha fornito strumenti inestimabili per la scoperta, la modifica e la convalida di terapie farmacologiche, consentendo loro di passare dal farmaco candidato alla terapia approvata. Sebbene una combinazione di modelli in vitro e non umani in vivo sia stata a lungo una componente critica della pipeline di sviluppo di farmaci, spesso non riescono a prevedere le prestazioni cliniche di nuovi farmaci candidati¹. Vi è una chiara necessità di sviluppare tecnologie che colmino il divario tra monocolture cellulari umane semplicistiche e sperimentazioni cliniche. I recenti progressi tecnologici nelle colture tissutali tridimensionali auto-organizzate, gli organoidi, hanno migliorato la loro fedeltà ai tessuti che modellano, rendendoli strumenti promettenti nella pipeline di sviluppo di farmaci preclinici².

Uno dei principali vantaggi della coltura cellulare umana rispetto ai modelli in vivo non umani è la capacità di replicare le complessità specifiche del metabolismo umano che possono variare considerevolmente anche tra vertebrati di ordine superiore come gli esseri umani e i topi³. Tuttavia, questa specificità può essere oscurata da una perdita di complessità tissutale; Questo è il caso del tessuto retinico in cui più tipi di cellule sono intrecciati in modo intricato e hanno un'interazione metabolica simbiotica unica tra sottotipi cellulari che non possono essere replicati in una monocoltura⁴. Gli organoidi umani, che forniscono un facsimile di tessuti umani complessi con l'accessibilità e la scalabilità della coltura cellulare, hanno il potenziale per superare le carenze di queste piattaforme di modellazione delle malattie.

Gli organoidi retinici derivati da cellule staminali si sono dimostrati particolarmente fedeli nel modellare il complesso tessuto della retina neurale umana⁵. Ciò ha reso il modello organoide retinico una tecnologia promettente per lo studio e il trattamento delle malattie retiniche ^6,7. Ad oggi gran parte della modellizzazione della malattia negli organoidi retinici si è concentrata sulle malattie retiniche monogeniche in cui gli organoidi retinici derivano da linee iPSC con varianti genetiche che causano malattie⁷. Si tratta generalmente di mutazioni altamente penetranti che si manifestano come fenotipi dello sviluppo. Meno lavoro è stato fatto efficacemente sulle malattie dell'invecchiamento in cui mutazioni genetiche e fattori di stress ambientali influenzano il tessuto che si è sviluppato normalmente. Le malattie neurodegenerative dell'invecchiamento possono avere un'eredità genetica complessa e contributi da fattori di stress ambientali che sono intrinsecamente difficili da modellare utilizzando colture cellulari a breve termine. Tuttavia, in molti casi queste malattie complesse possono fondersi su comuni fattori di stress cellulari o metabolici che, se testati su un tessuto umano completamente sviluppato, possono fornire potenti informazioni sulle malattie neurodegenerative dell'invecchiamento⁸.

La malattia degenerativa maculare ad esordio tardivo, la teleangectasia maculare di tipo II (MacTel), è un ottimo esempio di una malattia neurodegenerativa geneticamente complessa che si fonde su un difetto metabolico comune. MacTel è una rara malattia degenerativa retinica dell'invecchiamento che provoca la perdita di fotorecettori e glia di Müller nella macula, portando a una progressiva perdita nella visione centrale 9,10,11,12,13. In MacTel, un'eredità genetica indeterminata, possibilmente multifattoriale, guida una riduzione comune della serina circolante nei pazienti, con conseguente aumento di una specie lipidica neurotossica chiamata desossisfingolipidi (deossiSL)^14,15. Per dimostrare che l'accumulo di deoxySL è tossico per la retina e per convalidare potenziali terapie farmaceutiche, abbiamo sviluppato questo protocollo per analizzare la tossicità dei fotorecettori negli organoidi retinici umani¹⁴.

Qui delineiamo un protocollo specifico per differenziare gli organoidi retinici umani, stabilendo un saggio di tossicità e salvataggio utilizzando organoidi e quantificando i risultati. Forniamo un esempio di successo in cui determiniamo la tossicità tessuto-specifica di un sospetto agente patogenogeno, il deoxySL, e convalidiamo l'uso di un farmaco generico sicuro, il fenofibrato, per il potenziale trattamento della tossicità retinica indotta da deossiSL. Lavori precedenti hanno dimostrato che il fenofibrato può aumentare la degradazione del deossiSL e ridurre la deossiSL circolante nei pazienti, tuttavia, la sua efficacia nel ridurre la tossicità retinica indotta da deossiSL non è stata testata^16,17. Sebbene presentiamo un esempio specifico, questo protocollo può essere utilizzato per valutare l'effetto di qualsiasi numero di fattori di stress metabolici / ambientali e potenziali farmaci terapeutici sul tessuto retinico.

Protocollo

1. Scongelamento, passaggio ed espansione delle iPSC/ESC

NOTA: Per tutte le fasi di coltura cellulare, utilizzare le migliori pratiche per mantenere una coltura cellulare sterile.

1. Rivestire una piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con mezzo a matrice di membrana basale.
   1. Per preparare 1x di questo mezzo, seguire le specifiche del prodotto o diluire il mezzo a matrice fredda da 75 μL con 9 ml di DMEM/F12. Aggiungere 1,5 ml di 1x mezzo per pozzetto appena preparato in una piastra a 6 pozzetti. Incubare a 37 °C per 30 min.
   2. Aspirare il mezzo della matrice della membrana basale e risciacquare ogni pozzetto con 3 ml di DMEM / F12. Aggiungere 2 mL di DMEM/F12 e incubare a 37 °C fino all'uso. Usa il piatto il giorno in cui viene preparato.
2. Preparare una soluzione madre 10 mM di inibitore della roccia (Y-27632 dicloridrato) in PBS e conservare a -20 °C fino all'uso.
3. Scongelare un flaconcino di iPSCs/ESC in mezzo DMEM/F12 e centrifugare a 400 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in mezzo mTeSR. Piastra 1 flaconcino di cellule su un pozzetto a 6 pozzetti rivestito in mezzi mTeSR con 10 μM di inibitore della roccia (Y-27632 dicloridrato) e incubare durante la notte nell'incubatore. Il giorno successivo, aspirare i supporti e aggiungere solo mTeSR.
   NOTA: Cambiare il supporto ogni giorno fino al passaggio.
4. Preparare 0,5 mM EDTA in PBS diluendo 500 μL di 0,5 M EDTA in 500 mL di PBS.
5. Cellule di passaggio quando raggiungono l'80-90% di confluenza. Dividere le celle 1:3 o 1:6 per pozzetto, a seconda del tasso di crescita delle cellule.
   1. Per rimuovere le cellule aderenti dalla piastra, aspirare il mezzo e incubare con 0,5 mM EDTA in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione di EDTA e sollevare le cellule espellendo con forza 1 mL di terreno mTeSR sulle cellule con una pipetta p1000.
   2. Continuare ad aspirare ed espellere con forza il mezzo mTeSR e le celle, fino a 5x, per rimuovere le cellule rimanenti aderite. Celle a piastre su una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice basale fresca, con mezzo mTeSR. Continuare a sostituire i fluidi ogni giorno fino a quando le piastre raggiungono nuovamente l'80-100% di confluenza.
6. Una volta che le cellule si sono espanse fino a raggiungere una piastra completa a 6 pozzetti e hanno raggiunto l'80-100% di confluenza, mettere da parte un pozzetto per espandere la linea cellulare per le successive differenziazioni o congelare per la crioconservazione. Usa i restanti cinque pozzetti per iniziare il processo di differenziazione creando corpi embrioidi.

2. Creazione di corpi embrioidi (EB)

NOTA: Le ricette dei mezzi di formazione e differenziazione EB derivano dai protocolli di Cowan et ^al.5, Ohlemacher et al.18 e Zhong et ^al.19.

1. Preparare 1x Soluzione Dispase e Neural Induction Media (NIM) come descritto di seguito.
   1. Preparare 10 mg/ml di soluzione madre 5x di Dispase sciogliendo la polvere in DMEM/F12. Filtro sterile con filtro da 0,22 μm. Conservare 1 mL di aliquote a -20 °C fino all'uso.
   2. Utilizzando la soluzione 5x Dispase, preparare 1 mL/pozzetto di 2 mg/mL Dispase in DMEM/F12. Riscaldare la soluzione a 37 °C per 30 min.
   3. Preparare NIM integrando DMEM/F12 con un supplemento di N2 all'1%, NEAA all'1% di MEM e 2 mg/ml di eparina a 180 U/mg. NIM può essere conservato a 4 °C per un massimo di un mese.
2. Preparare e riscaldare 16 mL di miscela 3:1 di soluzione mTeSR:NIM (12mL:4mL) a temperatura ambiente.
3. Rimuovere le cellule differenziate e aggiungere una soluzione calda di Dispase.
   1. Rimuovere le cellule differenzianti dalla coltura cellulare di iPSCs/ESC. Sotto un cannocchiale di dissezione, raschiare via le colonie bianche opache con una punta di pipetta p10. Aspirare il terreno mTeSR dai pozzi di coltura. Questo rimuoverà i grumi differenziati che sono stati appena raschiati.
   2. Aggiungere immediatamente la soluzione di Dispase preriscaldata e incubare a 37 °C fino a quando la maggior parte dei bordi delle colonie cellulari inizia a raggomitolarsi al microscopio. Ci vorranno 4-8 minuti.
      NOTA: Il tempo di incubazione per le cellule in Dispase dovrà essere determinato per ciascun laboratorio. La durata può differire tra le linee cellulari e un'incubazione più lunga è necessaria per le cellule che sono state placcate per 3 giorni o più. Le iPSC / ESC a crescita lenta che impiegano più di 3 giorni per raggiungere la confluenza inizieranno ad aderire con maggiore forza alla piastra, rendendo difficile sollevare le cellule. Per le celle a crescita lenta, prova a passare le celle a 1: 2 per l'espansione in una piastra completa a 6 pozzetti per ridurre il tempo dalla placcatura alla confluenza.
4. Aspirare la soluzione e aggiungere delicatamente almeno 2 ml di terreno DMEM/F12 per pozzetto. Aggiungere DMEM/F12 mezzo lentamente sul lato del pozzetto facendo attenzione a non rimuovere le cellule.
   1. Aspirare il mezzo DMEM/F12, quindi aggiungere con forza 1 mL di DMEM/F12 fresco direttamente sulle cellule per sollevare le colonie cellulari dalla piastra. Con una pipetta p1000 aspirare ripetutamente ed espellere con forza DMEM/F12 nel pozzetto, fino a 5x, per rimuovere il maggior numero possibile di colonie cellulari.
      NOTA: Le iPSC/ESC differenzianti/differenziate aderiscono alla piastra più delle iPSC/ESC indifferenziate. Le cellule che non si staccano con pipettaggio ripetuto sono meglio lasciate indietro. L'eccesso di pipettaggio uccide le celle e riduce l'efficienza della produzione di EB. I grumi di cellule avranno tra 100-400 cellule per grumo.
5. Trasferire le colonie galleggianti in un tubo conico da 15 ml e risciacquare i pozzetti con un ulteriore mezzo DMEM/F12 da 1 mL per pozzetto per raccogliere eventuali colonie galleggianti rimanenti.
6. Lasciare che le colonie galleggianti si depositino per gravità per non più di 5 minuti. Una volta sistemato, rimuovere tutti tranne 1-2 mL di surnatante. Fare attenzione a non agitare il pellet morbido sul fondo.
7. Risospendere il pellet in mezzo 3:1 mTeSR:NIM preriscaldato e trasferirlo in un matraccio T75 a bassissimo attacco. Incubare durante la notte per consentire la formazione di EB. Questo sarà considerato il giorno 0 della differenziazione.
8. Cambiare gradualmente i media in NIM per iniziare la differenziazione degli EB in progenitori neurali.
   1. Il giorno seguente, rimuovere il supporto e sostituirlo con 10 mL di supporto 1:1 mTeSR:NIM. Per rimuovere i supporti dalla cultura EB fluttuante, sollevare il pallone in modo che gli EB si raccolgano nell'angolo inferiore del pallone. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non aspirare nessuno degli EB nel pellet sul fondo.
   2. Il giorno seguente, sostituire il supporto con 10 mL di mezzo 1:3 mTeSR:NIM.
   3. Il giorno successivo, sostituire il supporto con il supporto NIM completo. Continuare a cambiare il fluido ogni 2 giorni con NIM medium fino a 7 giorni dopo il trattamento con Dispase.

3. Placcatura degli EB e avvio della differenziazione retinica neurale

1. Una settimana dopo il trattamento Dispase, gli EB fluttuanti su una piastra a 6 pozzetti rivestita con un mezzo di membrana basale ridotto dal fattore di crescita. Per rivestire la piastra, fare riferimento al passaggio 1.1.
   1. Aspirare i fluidi esausti dagli EB e sostituirli con 12 ml di NIM.
   2. Garantire una distribuzione uniforme degli EB in ciascun pozzetto agitando il mezzo contenente EB per risospendere gli EB, quindi rimuovere rapidamente 1/6 del mezzo (2 ml) ed erogare in un pozzetto. Ripetere l'operazione per i pozzi rimanenti.
   3. Prima dell'incubazione, agitare delicatamente la piastra, avanti e indietro poi da un lato all'altro, per distribuire uniformemente gli EB. Se gli EB si raggruppano nel mezzo, non si distingueranno correttamente.
      NOTA: la densità di placcatura è fondamentale per la differenziazione. Assicurati di placcare più di 30 EB per pozzetto. Se la produzione di EB non era efficiente, distribuire gli EB in un minor numero di pozzi.
2. Cambia i media ogni giorno con NIM medium. Mantenere il livello dei supporti nei pozzetti a ~ 3 ml. Quando si cambiano i fluidi, rimuovere tutti tranne 1 mL di supporto per non asciugare gli EB placcati e aggiungere delicatamente 2 mL di fluido sul lato del pozzetto per non sollevare le celle dalla piastra.
3. Nove giorni dopo la placcatura degli EB, iniziare a cambiare il terreno da NIM a Retinal Differentiation Media (RDM) nel corso di due giorni.
   1. Preparare RDM mescolando quanto segue: 48% DMEM / F12 (1: 1) e 48% DMEM integrato con 2% B27 integratore senza vitamina A, 1% MEM NEAA e 1% Pen-Strep. Filtrare con filtro da 0,20 μm. RDM può essere conservato a 4 °C per un massimo di un mese.
   2. Il primo giorno, passare a un mix 1:1 di NIM:RDM. Il secondo giorno, cambia il supporto in RDM. Tutti i giorni successivi, alimentare le celle RDM.
      NOTA: Nelle prossime settimane, gli EB placcati formeranno progenitori retinici neurali che inizieranno a generare RPE visibilmente pigmentato.

4. Produzione di organoidi fluttuanti e mantenimento di colture organoidi fluttuanti

1. EB placcati in frammenti a 28 giorni dopo il trattamento iniziale con Dispase (21 giorni dopo la placcatura EB) utilizzando un bisturi sterile per tagliare una griglia di 1-2 mm² in EB placcati. Questo separerà le colonie progenitrici retiniche in piccoli pezzi in modo che più tardi nello sviluppo non diventino troppo grandi e necrosi da uno scambio di nutrienti insufficiente nel loro centro.
2. EB placcati staccati.
   1. Per fare ciò, aggiungere prima altri 2 ml di RDM a ciascun pozzetto. Quindi aspirare ~ 1000 μL di fluido dai pozzetti usando una pipetta p1000. Ora espellere con forza il supporto direttamente sugli EB placcati con la punta completamente sommersa.
   2. Ripetere l'operazione fino a quando tutte le celle sono state sollevate dalla piastra. Tenere la punta sommersa durante l'espulsione del fluido e non spingere lo stantuffo della pipetta oltre il primo stop per evitare bolle.
3. Risospendere i pezzi di EB staccati nascentemente in un matraccio Erlenmeyer sterile di plastica da 125 mL e riempire il pallone con ~40 mL di materiale RDM. Posizionare il pallone su uno shaker orbitale posto in un incubatore standard. Impostare la velocità dello shaker su 130-140 RPM (impostazione della velocità 3).
   NOTA: La coltura di organoidi su uno shaker impedisce loro di aderire insieme durante la coltura a una concentrazione più elevata di organoidi. Anche i bioreattori raggiungono gli stessi fini, ma uno shaker è meno costoso.
4. Nutrire gli organoidi con un cambio parziale del terreno, sostituendo circa 12 ml di RDM 2-3 volte a settimana, a seconda di quanto diventa giallo il terreno. Gli organoidi precoci non richiedono molta alimentazione, ma man mano che crescono, richiederanno cambi di terreno più frequenti con più mezzi.
5. Potare gli organoidi ogni due settimane per rimuovere organoidi non retinici, troppo cresciuti e morenti. Ciò impedisce lo spreco di mezzi e migliora la salute degli organoidi retinici rimanenti.
   1. Trasferire le celle dal loro pallone su una piastra a 6 pozzetti o su un piatto da 10 cm utilizzando una pipetta da 5 ml. Mantenere organoidi che mostrano neuroepitelio stratificato (Figura 1A, asterisco). Questi organoidi sono trasparenti e bianchi.
   2. Risolvere e rimuovere gli organoidi retinici mal formati o troppo cresciuti e gli organoidi non retinici con una pipetta da 5 ml. Questi saranno generalmente opachi e giallastri (Figura 1A). Rimuovi anche tutto ciò che non assomiglia a un neuroepitelio stratificato. Le prime potature saranno laboriose, ma diventeranno molto più facili ogni volta successiva man mano che gli organoidi diventeranno più grandi e più omogenei (Figura 1B).

5. Mantenere organoidi maturi e differenziarli in un tessuto retinico post-mitotico

1. Al giorno 56 (settimana 8) dopo il trattamento iniziale con Dispase per la formazione di EB (28 giorni dopo la coltura di EB spostate in un pallone) cambiare i mezzi organoidi in RDM+. Ciò fornirà nutrienti extra agli organoidi completamente maturi come tessuto retinico.
   1. Preparare 100 mM di taurina in PBS. Conservare le aliquote a -20 °C fino all'uso.
   2. Preparare RDM + integrando RDM con 10% FBS, 100 μM taurina e 2 mM integratore di glutammina commerciale. Filtrare con filtro da 0,20 μm.
   3. Continua a cambiare RDM + media 2-3 volte a settimana.
2. Alla settimana 17-18 (trattamento post-Dispase) trasferire gli organoidi dal matraccio Erlenmeyer a una piastra a 6 pozzetti ultra-bassa utilizzando una pipetta da 5 ml. Per la prima settimana continuare a potare e separare gli organoidi l'uno dall'altro ogni giorno fino a quando gli organoidi non si attaccano più. La densità ottimale è di 10-15 organoidi per pozzetto. Cambia media 2-3 volte a settimana.
   NOTA: Ridurre il numero di organoidi per pozzetto se gli organoidi aderiscono frequentemente l'uno all'altro o se il supporto diventa molto giallo tra i cambi di supporto.
3. Aspettatevi che gli organoidi diventino completamente post-mitotici entro la settimana 18⁵ quando le cellule retiniche neurali sono presenti ovunque. Entro la settimana 24, verificare la formazione di segmenti esterni rudimentali all'esterno dell'organoide. Entro la settimana 26-28 assicurarsi che i segmenti esterni siano spessi all'esterno degli organoidi (Figura 1C). Eseguire saggi di tossicità dopo la settimana 26 quando gli organoidi hanno definito segmenti esterni che indicano uno stato di differenziazione maturo.
   NOTA: Utilizzare solo organoidi retinici ben differenziati per il test di tossicità. L'esecuzione di saggi di tossicità su organoidi con segmenti esterni ben definiti consentirà la loro identificazione.

6. Deossisfinganina (deossiSA) e trattamento farmacologico

NOTA: Presentato qui è un singolo trattamento di fenofibrato per salvare la tossicità del deossiSA per un periodo di 4 giorni (Figura 2). La concentrazione di deossiSA aggiunta agli organoidi, la durata del trattamento con deossiSA sugli organoidi e il tipo di farmaco usato per salvare la tossicità¹⁴ possono, tuttavia, essere modificati in base alle esigenze sperimentali di test di tossicità e di salvataggio della tossicità.

1. Preparare 1 mM di soluzione madre di deossiSA in etanolo. Conservare a -20 °C per 1 mese. In alternativa, è possibile preparare una soluzione madre di deossiSA in DMSO.
2. Eseguire una diluizione seriale di deossiSA per determinare una concentrazione tossica appropriata di deossiSA per il salvataggio del farmaco.
   NOTA: Per prima cosa determinare una concentrazione di deossiSA che si tradurrà in una morte cellulare sufficiente per misurare un effetto di salvataggio. Se la concentrazione è troppo alta, la risposta tossica comporterà la disintegrazione dell'organoide e non si osserverà alcun salvataggio. Se la risposta tossica è troppo bassa, sarà difficile osservare un significativo effetto di salvataggio. La risposta tossica al deossiSA può variare da laboratorio a laboratorio e da lotto a lotto di deossiSA.
   1. Diluire 1 mM di soluzione madre di deossiSA a concentrazioni di 0,5 μM, 1 μM e 2 μM in 3 mL di RDM+, ciascuna. Aggiungere 3 μL di etanolo a RDM+ per preparare un trattamento di controllo.
   2. Al microscopio a dissezione, utilizzare una sonda sterile per selezionare 4 gruppi di organoidi con un minimo di 5 organoidi per gruppo. Dividere i gruppi in pozzetti separati di una piastra a 6 pozzetti ultra-bassa. Seleziona organoidi che hanno approssimativamente le stesse dimensioni e forma.
   3. Aspirare il più possibile RDM+ dagli organoidi. A ciascun pozzetto di organoidi, aggiungere una concentrazione di deossiSA in RDM+. Aggiungi il controllo del veicolo al quarto pozzetto di organoidi.
   4. Dopo due giorni di coltura in deossiSA o veicolo, sostituire il terreno con diluizioni di deossiSA corrispondenti appena preparate in RDM+.
   5. Il quarto giorno di trattamento, procedere alla fase 7 per elaborare e analizzare gli organoidi per la morte cellulare. Una volta selezionata una concentrazione di deossiSA, continuare con il punto 6.3 per trattare con fenofibrato.
      NOTA: La morte delle cellule bersaglio nel gruppo di trattamento con deossiSA selezionato è di 5 - 20 cellule TUNEL positive per 10.000 μm². Gli organoidi non devono disintegrarsi con il tocco di una sonda nel corso del trattamento.
3. Trattare gli organoidi con la dose tossica selezionata di deossiSA e fenofibrato.
   1. Preparare una soluzione madre da 40 mM di fenofibrato nel DMSO. Conservare a -20 °C per un massimo di 1 anno.
   2. Preparare i mezzi di trattamento farmacologico: in 3 mL di RDM+, diluire 1 mM di soluzione madre di deossiSA in 1 μM di deossiSA e diluire 40 mM di soluzione madre di fenofibrato a 20 μM.
   3. Preparare i mezzi di trattamento deossiSA: in 3 mL di RDM+, diluire 1 mM di soluzione madre di deossiSA in 1 μM di deossiSA e aggiungere 1,5 μL di DMSO.
   4. Preparare il mezzo di controllo: in 3 mL RDM+, aggiungere 3 μL di etanolo e 1,5 μL di DMSO.
   5. Sotto un microscopio a dissezione utilizzando una sonda sterile selezionare tre gruppi di organoidi con un minimo di cinque organoidi per gruppo. Dividere i gruppi in pozzetti separati di una piastra a 6 pozzetti ultra-bassa.
   6. Aggiungere i trattamenti preparati (deossiSA, deossiSA + fenofibrato o controllo) agli organoidi. Dopo due giorni, cambiare i mezzi nei pozzetti con RDM + appena preparato integrato con corrispondenti soluzioni deossiSA / fenofibrato / controllo.
   7. Il quarto giorno di trattamento procedere alla fase 7 per elaborare e analizzare gli organoidi per la morte cellulare (Figura 2).

7. Incorporazione e criosezione di organoidi

1. Preparare un PFA fresco al 4% aggiungendo 1 mL di fiala di PFA al 16% a 3 mL di PBS.
2. Rimuovere i supporti RDM+ dagli organoidi e risciacquare una volta con PBS. Rimuovere quanto più PBS possibile dagli organoidi. Aggiungere 2 ml di PFA al 4% preparato (in PBS) agli organoidi e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
3. Dopo 15 minuti di incubazione, sciacquare gli organoidi due volte con 2 ml di PBS, quindi lavare in PBS per 10 minuti.
   NOTA: Eseguire il fissaggio in una cappa aspirante chimica e scartare la soluzione di PFA e due successivi risciacqui PBS in un contenitore per rifiuti PFA opportunamente etichettato conservato nella cappa aspirante.
4. Aspirare tutto il PBS, quindi aggiungere il 20% di saccarosio in PBS agli organoidi fissi. Assicurarsi che gli organoidi siano mescolati nella soluzione di saccarosio e non rimangano in una bolla PBS sulla parte superiore. Conservare gli organoidi nella soluzione di saccarosio fino a quando non affondano sul fondo della soluzione di saccarosio, cioè ~ 1 h a temperatura ambiente. Gli organoidi fissi possono essere conservati in soluzione di saccarosio per una notte a 4 °C.
5. Incorporare gli organoidi in una soluzione OCT in uno stampo per criosezione. Più organoidi per condizione possono essere incorporati in uno stampo. Orientare gli organoidi assicurandosi che le loro migliori regioni retiniche saranno sezionate sul criostato e il centro degli organoidi sia all'incirca sullo stesso piano. Congelare gli organoidi incorporati a -20 °C. Gli organoidi incorporati possono essere conservati a -80 °C per anni.
   NOTA: Gli organoidi sono difficili da vedere nell'OCT congelato; orientare i cluster RPE verso il lato dello stampo che sarà rivolto verso la lama per facilitare l'identificazione degli organoidi.
6. Gli organoidi della criosezione in sezioni spesse 10-14 μm e aderiscono alle sezioni trattate con poli-L lisina. Durante la criosezione, controllare ripetutamente i vetrini al microscopio per identificare le sezioni che contengono il centro degli organoidi. Raccogli solo le fette intermedie degli organoidi in cui tutti gli strati sono rappresentati uniformemente (Figura 2A-C, Figura 3). Una volta sezionati, i vetrini possono essere conservati in una scatola di scorrimento a -80 °C per anni.
   NOTA: Le fette prelevate alle estremità dell'organoide sovracampionano i fotorecettori più esterni e non sono appropriate per la quantificazione. Gli organoidi di medie dimensioni forniranno 10-15 fette del centro dell'organoide che rappresenta una sezione trasversale degli strati retinici stratificati.

8. Colorazione TUNEL per cellule apoptotiche

1. Scongelare i vetrini congelati per 30 minuti a 37 °C. Il posizionamento immediato dei vetrini a 37 °C impedisce la formazione di condensa. I campioni di tessuto imbevuti di acqua pura possono distorcere il tessuto. Un'incubazione a 37 °C migliora anche l'adesione del tessuto al vetrino.
2. Crea un bordo continuo sul vetrino intorno alle sezioni di tessuto usando una penna idrofobica. Ciò fornirà un bordo e garantirà un'adeguata fissazione e incubazioni di anticorpi con un piccolo volume di soluzioni. Aggiungere circa 100-200 μL (il volume riempirà la regione bordata di idrofobia senza fuoriuscire) di PFA al 4% appena preparato per 20 minuti. Eseguire il fissaggio in una cappa aspirante chimica e scartare la soluzione di PFA in un contenitore per rifiuti PFA opportunamente etichettato conservato nella cappa aspirante.
3. Risciacquare i vetrini una volta in PBS, quindi lavare in PBS per 25 minuti a temperatura ambiente.
4. Preparare la miscela TUNEL. Scongelare sia le fiale viola che quelle blu dal kit di rilevamento della morte cellulare in situ. Rimuovere 100 μL di soluzione viola del flaconcino (utilizzabile per un controllo negativo) e unire i restanti 450 μL di soluzione dal flaconcino viola con 50 μL di soluzione dal flaconcino blu. Mescolare bene e tenere al buio. Ogni set di fiale (500 μL totali) può macchiare 5-10 vetrini.
5. Permeabilizzare le fette di tessuto.
   1. Preparare la soluzione di permeabilizzazione: PBS con TritonX-100 allo 0,1% e citrato di sodio allo 0,1%
   2. Rimuovere PBS dalle diapositive dei campioni, quindi aggiungere la soluzione di permeabilizzazione ai campioni. Incubare per 2 minuti su blocchi di ghiaccio o a 4 °C. Successivamente, risciacquare una volta in PBS quindi lavare in PBS per 10 minuti.
6. Rimuovere PBS e asciugare quanta più soluzione possibile utilizzando l'angolo di un tessuto piegato. Aggiungere 50-100 μL di miscela TUNEL preparata ai campioni, a seconda delle dimensioni dell'area disegnata dalla penna idrofobica. Coprire con vetrino e incubare a 37 °C per 1 h al buio.
   NOTA: Tutte le incubazioni e i lavaggi per le seguenti fasi devono essere eseguiti al buio per evitare lo sbiancamento dei fluorofori. Utilizzare una scatola scura o coprire le diapositive con un foglio di alluminio per bloccare la luce.
7. Etichettare i fotorecettori. Risciacquare una volta con PBS quindi lavare per 20 minuti in PBS. Rimuovere PBS quindi aggiungere l'anticorpo primario Recoverin (coniglio anti-Recoverin) diluito 1:500 in PBS con 0,1% Tween e 5% siero d'asino. Incubare a 4 °C durante la notte.
8. Dopo aver rimosso l'anticorpo primario, sciacquare una volta in PBS quindi lavare in PBS per 20 minuti. Aggiungere anticorpi secondari, anti-coniglio d'asino con un fluoroforo arancione o rosso, diluito 1:1.000 in PBS con 0,1% Tween e 5% siero d'asino e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. Risciacquare una volta con PBS quindi lavare per 20 minuti in PBS. Aggiungere DAPI a 1:1000 in PBS, incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
9. Risciacquare una volta con PBS quindi lavare per 20 minuti in PBS. Rimuovere PBS e aggiungere il supporto di montaggio. Aggiungere la vetrina, sigillare con lo smalto e lasciare asciugare al buio. I vetrini possono essere conservati a 4 °C in un contenitore buio per un massimo di 1 settimana.
   NOTA: per la migliore qualità dell'immagine, scatta le immagini il giorno successivo.

9. Imaging delle fette organoidi e quantificazione della morte.

NOTA: L'imaging richiede un microscopio confocale con capacità di distinguere tra tre canali fluorofori. Questo esperimento utilizza canali verde (Alexa Fluor 488), arancione (Alexa Fluor 555) e UV (DAPI). Qualsiasi combinazione di fluorofori può essere utilizzata garantendo che le emissioni non sanguinino negli altri canali.

1. Localizzare le sezioni retiniche per l'imaging e la quantificazione. Sotto un basso ingrandimento del microscopio (5x o 10x) utilizzare la colorazione Recoverin, che etichetta il citoplasma dei fotorecettori, e la colorazione DAPI, che etichetta i nuclei di tutte le cellule, per individuare una regione dell'organoide affettato che è intatta, ben formata e in un piano che campiona una sezione trasversale rappresentativa dell'organoide (Figura 2 e Figura 3 ). Trova una sezione che abbia uno strato nucleare esterno distinto di fotorecettori che sia spesso almeno alcune cellule e uno strato separato e distinto di nuclei che non hanno colorazione Recoverin (Figura 2 e Figura 3).
2. Incorniciare l'immagine. Aumentare l'ingrandimento del microscopio a un obiettivo 20x e inquadrare il vetrino per riempire l'immagine con il maggior strato possibile di fotorecettore (Figura 3).
3. Impostate il piano Z. Se si utilizza un microscopio che immagini Z-stacks impostare i limiti superiore e inferiore della gamma Z per visualizzare l'intera profondità della fetta. Utilizzare lo stesso spessore Z-stack per tutte le immagini in un set sperimentale in modo che la stessa quantità di tessuto venga analizzata in tutti i campioni. Se non si utilizza un microscopio che immagini Z-stacks, mettere a fuoco l'immagine al centro della fetta.
4. Immagina tutti e tre i canali dei fluorofori in un'acquisizione Z-stack. Tutti e tre i canali sono necessari per identificare positivamente una cellula morente. Immagine di un'area per organoide.
5. Salvare il set di immagini in un formato di file che mantenga il rapporto di area per pixel.

10. Quantificare le cellule morenti

1. Stack di immagini aperti nel software FIJI (Image J). Nella finestra Opzioni di importazione dei bioformati , assicurarsi che non sia selezionata alcuna casella nella sezione "suddivisione in finestre separate". Lo scorrimento tra i canali di immagine allineati è fondamentale per identificare correttamente le celle.
2. Appiattisci il set di immagini Z-stack facendo clic su Image > Stacks , quindi seleziona "Progetto Z" dal menu a discesa. Questo creerà una nuova immagine per la quantificazione. Se gli organoidi non sono stati visualizzati nella serie Z, saltare questo passaggio.
3. Selezionare il canale immagine che mostra la colorazione Recoverin (rosso, in questo esempio). Fare clic sullo strumento di selezione del poligono nella barra degli strumenti e delineare una regione continua di fotorecettori nell'immagine (Figura 3A). Fare clic su Analizza > Imposta misurazioni. Nella finestra pop-up Imposta misure selezionare la casella accanto ad Area, fare clic su Analizza e selezionare Misura per misurare l'area (o premere "m" come scorciatoia) dei fotorecettori per contare le cellule morenti. La misurazione dell'area verrà visualizzata in una finestra pop-up di misurazione.
4. Contare i nuclei TUNEL-positivi nella regione dei fotorecettori precedentemente selezionata (Figura 3B,C). Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento punto nella barra degli strumenti e selezionare lo strumento multipunto. Solo nel canale TUNEL, fare clic sulla colorazione positiva TUNEL che si sovrappone a un nucleo positivo DAPI e alla colorazione Recoverin. Passare da un canale all'altro per convalidare le celle positive.
5. Dividere il numero di cellule positive al TUNEL per l'area per ottenere un valore normalizzato per la morte cellulare nei fotorecettori per organoide (Figura 2D,E).

Risultati

Gli organoidi retinici sono stati generati da una linea iPSC di controllo non MacTel. Dopo che gli organoidi hanno raggiunto le 26 settimane di coltura, sono stati selezionati e divisi in gruppi sperimentali. Gli organoidi sono stati trattati con concentrazioni variabili di deossiSA per determinare se il deossiSA è tossico per i fotorecettori. Sono state testate quattro concentrazioni di deossiSA, da 0 a 1 μM (Figura 2) e gli organoidi sono stati trattati per 8 giorni, con cambiamenti dei ...

Discussione

Variazioni del protocollo di differenziazione
Dall'invenzione delle coppe ottiche autoformanti da parte del gruppo²⁰ di Yoshiki Sasai, molti laboratori hanno sviluppato protocolli per generare organoidi retinici che possono variare in quasi ogni fase 5,18,19,21. Un elenco esaustivo di protocolli può essere trovato in Capowski et ^al....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503