Скрининг токсичности органоидов сетчатки человека для фармацевтических открытий

Резюме

Здесь мы представляем пошаговый протокол для создания зрелых органоидов сетчатки человека и использования их в анализе токсичности фоторецепторов для выявления фармацевтических кандидатов для возрастного дегенеративного заболевания сетчатки макулярной телеангиэктазии типа 2 (MacTel).

Аннотация

Органоиды обеспечивают многообещающую платформу для изучения механизма заболевания и методов лечения непосредственно в контексте тканей человека с универсальностью и пропускной способностью клеточной культуры. Зрелые органоиды сетчатки человека используются для скрининга потенциальных фармацевтических препаратов для лечения возрастного дегенеративного заболевания сетчатки макулярной телеангиэктазии типа 2 (MacTel).

Недавно мы показали, что МакТел может быть вызван повышенным уровнем атипичных видов липидов, дезоксисфинголипидов (дезоксиSL). Эти липиды токсичны для сетчатки и могут привести к потере фоторецепторов, которая происходит у пациентов MacTel. Чтобы проверить лекарства на их способность предотвращать токсичность фоторецепторов deoxySL, мы сгенерировали органоиды сетчатки человека из линии плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), не индуцированной MacTel, и созрели до постмитотического возраста, когда они развивают все клетки сетчатки, полученные от нейронной линии, включая функционально зрелые фоторецепторы. Органоиды сетчатки обрабатывали метаболитом дезоксиSL, а апоптоз измеряли в слое фоторецепторов с использованием иммуногистохимии. Используя эту модель токсичности, были проверены фармакологические соединения, которые предотвращают гибель фоторецепторов, индуцированную дезоксиSL. Используя целевой подход-кандидат, мы определили, что фенофибрат, препарат, обычно назначаемый для лечения высокого уровня холестерина и триглицеридов, также может предотвращать токсичность дезоксиSL в клетках сетчатки.

Скрининг токсичности успешно идентифицировал одобренный FDA препарат, который может предотвратить гибель фоторецепторов. Это прямой практический вывод благодаря протестированной модели, имеющей отношение к заболеваниям. Эта платформа может быть легко модифицирована для тестирования любого количества метаболических стрессоров и потенциальных фармакологических вмешательств для будущих открытий лечения заболеваний сетчатки.

Введение

Моделирование заболеваний человека на клеточных культурах и животных моделях предоставило бесценные инструменты для открытия, модификации и проверки фармакологических терапевтических средств, что позволило им перейти от препарата-кандидата к одобренной терапии. Несмотря на то, что комбинация моделей in vitro и нечеловеческих моделей in vivo уже давно является важнейшим компонентом процесса разработки лекарств, они часто не могут предсказать клиническую эффективность новых кандидатов на лекарства¹. Существует очевидная потребность в разработке технологий, которые устранят разрыв между упрощенными клеточными монокультурами человека и клиническими испытаниями. Последние технологические достижения в области самоорганизующихся трехмерных тканевых культур, органоидов, улучшили их точность к тканям, которые они моделируют, что делает их многообещающими инструментами в доклинической разработке лекарств².

Основным преимуществом культуры клеток человека по сравнению с нечеловеческими моделями in vivo является способность воспроизводить специфические тонкости метаболизма человека, которые могут значительно различаться даже между позвоночными более высокого порядка, такими как люди и мыши³. Однако эта специфичность может быть омрачена потерей сложности тканей; Так обстоит дело с тканью сетчатки, где несколько типов клеток причудливо переплетаются и имеют уникальное симбиотическое метаболическое взаимодействие между клеточными подтипами, которое не может быть воспроизведено в монокультуре⁴. Человеческие органоиды, которые обеспечивают факсимиле сложных тканей человека с доступностью и масштабируемостью клеточной культуры, имеют потенциал для преодоления недостатков этих платформ моделирования заболеваний.

Органоиды сетчатки, полученные из стволовых клеток, оказались особенно точными при моделировании сложной ткани нервной сетчатки^{человека 5}. Это сделало органоидную модель сетчатки перспективной технологией для изучения и лечения заболеваний сетчатки ^6,7. На сегодняшний день большая часть моделирования заболеваний в органоидах сетчатки сосредоточена на моногенных заболеваниях сетчатки, где органоиды сетчатки происходят из линий iPSC с болезнетворными генетическими вариантами⁷. Как правило, это высокопроникающие мутации, которые проявляются в виде фенотипов развития. Меньше работы было эффективно сделано для лечения болезней старения, когда генетические мутации и стрессоры окружающей среды влияют на ткани, которые развиваются нормально. Нейродегенеративные заболевания старения могут иметь сложное генетическое наследование и вклад стрессоров окружающей среды, которые по своей природе трудно моделировать с использованием краткосрочных клеточных культур. Однако во многих случаях эти сложные заболевания могут объединяться с общими клеточными или метаболическими стрессорами, которые при тестировании на полностью развитой ткани человека могут дать мощное представление о нейродегенеративных заболеваниях старения⁸.

Дегенеративное заболевание желтого пятна с поздним началом, макулярная телеангиэктазия типа II (MacTel), является отличным примером генетически сложного нейродегенеративного заболевания, которое объединяется с общим метаболическим дефектом. MacTel - это редкое дегенеративное заболевание сетчатки старения, которое приводит к потере фоторецепторов и глии Мюллера в макуле, что приводит к прогрессирующей потере центрального зрения 9,10,11,12,13. В MacTel неопределенное, возможно, многофакторное генетическое наследование приводит к общему снижению циркулирующего серина у пациентов, что приводит к увеличению нейротоксичных видов липидов, называемых дезоксисфинголипидами (deoxySL)^14,15. Чтобы доказать, что накопление deoxySL токсично для сетчатки, и проверить потенциальную фармацевтическую терапию, мы разработали этот протокол для анализа токсичности фоторецепторов в органоидах сетчатки человека¹⁴.

Здесь мы описываем конкретный протокол для дифференциации органоидов сетчатки человека, установления токсичности и спасательного анализа с использованием органоидов и количественной оценки результатов. Мы приводим успешный пример, когда мы определяем тканеспецифическую токсичность подозреваемого болезнетворного агента, дезоксиSL, и подтверждаем использование безопасного непатентованного препарата, фенофибрата, для потенциального лечения дезоксиSL-индуцированной токсичности сетчатки. Предыдущая работа показала, что фенофибрат может увеличивать деградацию дезоксиSL и снижать циркулирующий дезоксиSL у пациентов, однако его эффективность в снижении дезоксиSL-индуцированной токсичности сетчатки не проверялась^16,17. Хотя мы представляем конкретный пример, этот протокол может быть использован для оценки влияния любого количества метаболических/экологических стрессоров и потенциальных терапевтических препаратов на ткань сетчатки.

протокол

1. Размораживание, пропускание и расширение ИПСК/ЭСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов культивирования клеток используйте лучшие практики для поддержания стерильной клеточной культуры.

1. Покройте 6-луночную клеточную культуральную пластину матричной средой базальной мембраны.
   1. Чтобы приготовить 1x этой среды, следуйте спецификациям продукта или разбавьте 75 мкл холодной матричной среды 9 мл DMEM/F12. Добавьте 1,5 мл свежеприготовленной среды 1x на лунку в 6-луночную тарелку. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин.
   2. Аспирируйте матричную среду базальной мембраны и промойте каждую скважину 3 мл DMEM/F12. Добавьте 2 мл DMEM/F12 и инкубируйте при 37 °C до использования. Используйте тарелку в день ее приготовления.
2. Приготовьте исходный раствор 10 мМ ингибитора горных пород (дигидрохлорид Y-27632) в PBS и храните при -20 ° C до использования.
3. Разморозьте флакон с ИПСК/ЭСК в среду DMEM/F12 и центрифугу при 400 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в среде mTeSR. Пластину 1 флакона с клетками помещают в 6-луночную лунку с покрытием в среде mTeSR с 10 мкМ ингибитора горных пород (дигидрохлорид Y-27632) и инкубируют в течение ночи в инкубаторе. На следующий день аспирируйте носитель и добавьте обратно только mTeSR.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте носитель каждый день до конца.
4. Приготовьте 0,5 мМ ЭДТА в PBS, разбавив 500 мкл 0,5 М ЭДТА в 500 мл PBS.
5. Проход ячеек, когда они достигают 80-90% слияния. Разделите ячейки 1:3 или 1:6 на лунку, в зависимости от скорости роста клеток.
   1. Чтобы удалить прилипшие клетки из пластины, аспирируют среду и инкубируют с 0,5 мМ ЭДТА в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. После инкубации удалите раствор ЭДТА и снимите клетки, с силой вытолкнув 1 мл среды mTeSR в клетки с помощью пипетки p1000.
   2. Продолжайте всасывать и с силой выталкивайте среду и клетки mTeSR до 5 раз, чтобы удалить прилипшие оставшиеся клетки. Пластинчатые ячейки на свежую 6-луночную пластину с матричным покрытием из базальной мембраны со средой mTeSR. Продолжайте ежедневно заменять носитель до тех пор, пока пластины снова не достигнут 80-100% слияния.
6. После того, как клетки расширились до полной 6-луночной пластины и достигли 80-100% слияния, выделите одну лунку для расширения клеточной линии для последующей дифференцировки или замораживания для криоконсервации. Используйте оставшиеся пять лунок, чтобы начать процесс дифференцировки путем создания эмбриоидных тел.

2. Создание эмбриоидных тел (ЭБ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты формирования и дифференциации ЭБ получены из протоколов в Cowan et ^al.5, Ohlemacher et al.18 и Zhong et ^al.19.

1. Приготовьте 1x раствор Dispase и среду для нейронной индукции (NIM), как описано ниже.
   1. Приготовьте 10 мг / мл 5-кратного исходного раствора Dispase, растворив порошок в DMEM / F12. Стерильный фильтр с использованием фильтра 0,22 мкм. Храните 1 мл аликвот при -20 ° C до использования.
   2. Используя 5-кратный раствор Dispase, приготовьте 1 мл / лунку 2 мг / мл Dispase в DMEM / F12. Подогревайте раствор при температуре 37 °C в течение 30 мин.
   3. Приготовьте NIM, дополнив DMEM/F12 1% добавкой N2, 1% MEM NEAA и 2 мг/мл гепарина в концентрации 180 ЕД/мг. NIM можно хранить при 4 °C до одного месяца.
2. Приготовьте и подогрейте 16 мл смеси раствора mTeSR:NIM (12 мл: 4 мл) в соотношении 3:1 до комнатной температуры.
3. Удалите дифференцированные клетки и добавьте теплый раствор Dispase.
   1. Удалить дифференцирующие клетки из культуры клеток ИПСК/ЭСК. Под диссекционным прицелом соскребите непрозрачные белые колонии наконечником пипетки p10. Аспирируйте среду mTeSR из культуральных лунок. Это удалит дифференцированные комки, которые были только что соскобленные.
   2. Немедленно добавьте предварительно подогретый раствор Dispase и инкубируйте при 37 ° C до тех пор, пока большая часть краев клеточных колоний не начнет сворачиваться под микроскопом. Это займет 4-8 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации клеток в Dispase должно быть определено для каждой лаборатории. Продолжительность может различаться между клеточными линиями, и для клеток, которые были покрыты в течение 3 дней или более, требуется более длительная инкубация. Медленно растущие ИПСК / ЭСК, которым требуется более 3 дней, чтобы достичь слияния, начнут с большей силой прилипать к пластине, что затрудняет отрыв клеток. Для медленно растущих клеток попробуйте пропустить ячейки в соотношении 1:2 для расширения в полноценную 6-луночную пластину, чтобы сократить время от покрытия до слияния.
4. Аспирируйте раствор и аккуратно добавьте не менее 2 мл среды DMEM/F12 на лунку. Медленно добавляйте среду DMEM/F12 в сторону лунки, стараясь не вытеснить клетки.
   1. Затем аспирируйте среду DMEM/F12, затем с силой добавьте свежий 1 мл DMEM/F12 непосредственно в клетки, чтобы удалить клеточные колонии из пластины. С помощью пипетки p1000 многократно всасывайте и с силой выталкивайте DMEM/F12 в лунку до 5 раз, чтобы вытеснить как можно больше клеточных колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцирующие/дифференцированные ИПСК/ЭСК прилипают к пластине больше, чем недифференцированные ИПСК/ЭСК. Клетки, которые не отрываются при повторном пипетировании, лучше оставить. Избыточное пипетирование убивает клетки и снижает эффективность производства БЭ. Клеточные скопления будут иметь от 100 до 400 клеток в группе.
5. Перенесите плавающие колонии в коническую трубку объемом 15 мл и промойте лунки дополнительной средой DMEM/F12 объемом 1 мл на лунку для сбора оставшихся плавающих колоний.
6. Дайте плавающим колониям осесть под действием силы тяжести не более 5 минут. После оседания удалите все, кроме 1-2 мл надосадочной жидкости. Следите за тем, чтобы не взбалтывать мягкие гранулы на дне.
7. Ресуспендируйте гранулы в предварительно разогретой среде 3:1 mTeSR:NIM и переложите в колбу T75 со сверхнизкой насадкой. Инкубируйте в течение ночи, чтобы образовались ЭБ. Это будет считаться Днем 0 дифференциации.
8. Постепенно меняйте среду на NIM, чтобы начать дифференцировку БЭ в нейронных предшественников.
   1. На следующий день удалите носитель и замените его 10 мл среды 1:1 mTeSR:NIM. Чтобы удалить носитель из свободно плавающей культуры ЭБ, опрокиньте колбу вверх так, чтобы ЭБ собирались в нижнем углу колбы. Отдохните надосадочную жидкость, следя за тем, чтобы не аспирировать ни один из EB в грануле на дне.
   2. На следующий день замените носитель на 10 мл среды 1:3 mTeSR:NIM.
   3. На следующий день замените носитель на полный носитель NIM. Продолжайте менять среду каждые 2 дня со средой NIM до 7 дней после лечения Dispase.

3. Покрытие ЭБ и инициация нейронной дифференцировки сетчатки

1. Через неделю после обработки Dispase пластинчатые свободно плавающие ЭБ на 6-луночную пластину, покрытую матричной средой базальной мембраны с пониженным фактором роста. Чтобы покрыть пластину, см. шаг 1.1.
   1. Аспирируют отработанные среды из ЭБ и заменяют 12 мл NIM.
   2. Обеспечьте равномерное распределение ЭБ в каждой лунке, перемешивая ЭБ-содержащую среду для ресуспендирования ЭБ, затем быстро удаляйте 1/6 часть среды (2 мл) и распределяйте в одну лунку. Повторите то же самое для остальных лунок.
   3. Перед инкубацией аккуратно встряхните тарелку вперед и назад, а затем из стороны в сторону, чтобы равномерно распределить ЭБ. Если ЭБ сгруппируются посередине, они не будут правильно дифференцироваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность покрытия имеет решающее значение для дифференциации. Убедитесь, что на скважину приходится более 30 EB. Если добыча ЭБ была неэффективной, распределите ЭБ по меньшему количеству скважин.
2. Ежедневно меняйте носитель с помощью носителя NIM. Поддерживайте уровень среды в лунках на уровне ~3 мл. При смене среды удалите все, кроме 1 мл среды, чтобы не высохнуть покрытые ЭБ, и осторожно добавьте 2 мл среды к стенке лунки, чтобы не отрывать ячейки от пластины.
3. Через девять дней после нанесения БЭ начните смену среды с NIM на среду дифференцировки сетчатки (RDM) в течение двух дней.
   1. Приготовьте RDM, смешав следующее: 48% DMEM/F12 (1:1) и 48% DMEM с добавкой 2% B27 без витамина А, 1% MEM NEAA и 1% Pen-Strep. Фильтр стерилизуют с помощью фильтра 0,20 мкм. RDM можно хранить при температуре 4 °C до одного месяца.
   2. В первый день переключите носитель на смесь NIM:RDM 1:1. На второй день смените носитель на RDM. Все последующие дни питают клетки RDM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В течение следующих нескольких недель гальванизированные ЭБ сформируют нейронные предшественники сетчатки, которые начнут генерировать заметно пигментированный РПЭ.

4. Создание свободно плавающих органоидов и поддержание свободно плавающих органоидных культур

1. Фрагментированные ЭБ через 28 дней после первоначальной обработки Dispase (через 21 день после ЭБ-покрытия) с использованием стерильного скальпеля для разрезания сетки 1-2 мм² на ЭБ с покрытием. Это разделит колонии предшественников сетчатки на небольшие куски, чтобы позже в развитии они не стали слишком большими и некрозами из-за недостаточного обмена питательных веществ в их центре.
2. Отсоедините ЭБ с гальваническим покрытием.
   1. Для этого сначала добавьте дополнительно 2 мл RDM в каждую лунку. Затем аспирируйте ~1000 мкл среды из лунок с помощью пипетки p1000. Теперь с силой выталкивайте носитель непосредственно на ЭБ с полностью погруженным наконечником.
   2. Повторяйте это до тех пор, пока все клетки не будут подняты с тарелки. Держите наконечник погруженным в воду во время выброса среды и не проталкивайте поршень пипетки дальше первого упора, чтобы избежать образования пузырьков.
3. Ресуспендируйте зарождающиеся отделившиеся куски EB в стерильную пластиковую колбу Эрленмейера объемом 125 мл и заполните колбу ~ 40 мл среды RDM. Поместите колбу на орбитальный шейкер, помещенный в стандартный инкубатор. Установите скорость вращения шейкера на 130-140 об/мин (настройка скорости 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование органоидов на шейкере предотвращает их слипание при культивировании при более высокой концентрации органоидов. Биореакторы также достигают тех же целей, но шейкер дешевле.
4. Кормите органоиды с частичной сменой среды, заменяя примерно 12 мл RDM 2-3 раза в неделю, в зависимости от того, насколько желтеет среда. Ранние органоиды не требуют большого количества подкормки, но по мере роста им потребуется более частая смена среды с большим количеством сред.
5. Обрезайте органоиды каждые две недели, чтобы удалить неретинальные, разросшиеся и отмирающие органоиды. Это предотвращает истощение среды и улучшает здоровье оставшихся органоидов сетчатки.
   1. Перенесите клетки из колбы на 6-луночную тарелку или 10-сантиметровую чашку с помощью пипетки объемом 5 мл. Храните органоиды, которые отображают многослойный нейроэпителий (рис. 1А, звездочка). Эти органоиды прозрачные и белые.
   2. Отсортируйте и удалите плохо сформированные или разросшиеся органоиды сетчатки, а также неретинальные органоиды с помощью пипетки объемом 5 мл. Как правило, они будут непрозрачными и желтоватыми (рис. 1A). Также удалите все, что не похоже на многослойный нейроэпителий. Первые несколько обрезок будут трудоемкими, но с каждым последующим разом будут становиться намного легче, поскольку органоиды становятся больше и однороднее (рис. 1B).

5. Сохранение зрелых органоидов и дифференцировка их в постмитотическую ткань сетчатки

1. На 56-й день (8-я неделя) после первоначальной обработки диспазой для образования БЭ (через 28 дней после культивирования вытесненных БЭ в колбе) замените органоидную среду на RDM+. Это обеспечит дополнительными питательными веществами полностью созревшие органоиды, такие как ткань сетчатки.
   1. Приготовьте 100 мМ таурина в PBS. Хранить аликвоты при температуре -20 °C до использования.
   2. Приготовьте RDM+, добавив в RDM 10% FBS, 100 мкМ таурина и 2 мМ коммерческого глютамина. Фильтр стерилизуют с помощью фильтра 0,20 мкм.
   3. Продолжайте менять носитель RDM+ 2-3 раза в неделю.
2. На 17-18 неделе (после лечения Dispase) перенесите органоиды из колбы Эрленмейера в 6-луночную пластину со сверхнизкой насадкой с помощью пипетки объемом 5 мл. В течение первой недели продолжайте ежедневно обрезать и отделять органоиды друг от друга до тех пор, пока органоиды не перестанут слипаться. Оптимальная плотность – 10-15 органоидов на лунку. Меняйте носитель 2-3 раза в неделю.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите количество органоидов в лунке, если они часто прилипают друг к другу или если среда становится очень желтой между сменой среды.
3. Ожидайте, что органоиды станут полностью постмитотическими к 18-5 неделям, когда нервные клетки сетчатки будут присутствовать повсюду. К 24 неделе проверьте наличие рудиментарных наружных сегментов на внешней стороне органоида. К 26-28 неделе убедитесь, что внешние сегменты толстые снаружи органоидов (рис. 1C). Проведите анализы токсичности после 26-й недели, когда органоиды определили внешние сегменты, обозначающие зрелое состояние дифференцировки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только хорошо дифференцированные органоиды сетчатки для анализа токсичности. Проведение анализа токсичности органоидов с четко очерченными внешними сегментами позволит идентифицировать их.

6. Дезоксисфинганин (дезоксиСА) и медикаментозное лечение

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлена однократная обработка фенофибратом для спасения токсичности дезоксиСА в течение 4 дней (рис. 2). Однако концентрация дезоксиСА, добавляемого к органоидам, продолжительность обработки дезоксиСА на органоидах и тип лекарственного средства, используемого для спасения^{токсичности 14} , могут быть изменены в соответствии с экспериментальными потребностями для анализа токсичности и спасения токсичности.

1. Приготовьте 1 мМ исходного раствора дезоксиСА в этаноле. Хранить при температуре -20 °C в течение 1 месяца. В качестве альтернативы исходный раствор дезоксиСА может быть приготовлен в ДМСО.
2. Выполните серийное разведение дезоксиСА, чтобы определить соответствующую токсическую концентрацию дезоксиСА для спасения лекарств.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала определите концентрацию дезоксиСА, которая приведет к достаточной гибели клеток для измерения эффекта спасения. Если концентрация слишком высока, токсическая реакция приведет к распаду органоида, и спасения не будет наблюдаться. Если токсическая реакция будет слишком низкой, будет трудно наблюдать значительный эффект спасения. Токсическая реакция deoxySA может варьироваться от лаборатории к лаборатории и от партии к партии deoxySA.
   1. Разбавьте 1 мМ исходного раствора deoxySA до концентраций 0,5 мкМ, 1 мкМ и 2 мкМ в 3 мл RDM+ каждый. Добавьте 3 мкл этанола в RDM+, чтобы приготовить контрольную обработку.
   2. Под диссекционным микроскопом используйте стерильный зонд, чтобы выбрать 4 группы органоидов с минимум 5 органоидами в группе. Разделите группы на отдельные лунки сверхнизкой насадки 6-луночной пластины. Отбирают органоиды, которые имеют примерно одинаковый размер и форму.
   3. Аспирируйте как можно больше RDM+ из органоидов. В каждую лунку органоидов добавьте одну концентрацию дезоксиСА в RDM+. Добавьте управление транспортным средством в четвертую лунку органоидов.
   4. После двух дней культивирования в deoxySA или носителе замените среду свежеприготовленными соответствующими разведениями deoxySA в RDM+.
   5. На четвертый день лечения перейдите к шагу 7, чтобы обработать и проанализировать органоиды на гибель клеток. После того, как концентрация дезоксиСА была выбрана, перейдите к шагу 6.3 для обработки фенофибратом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Гибель клеток-мишеней в выбранной группе лечения deoxySA составляет 5 - 20 TUNEL-положительных клеток на 10 000^{мкм 2} . Органоиды не должны распадаться при прикосновении зонда в ходе лечения.
3. Обработайте органоиды подобранной токсической дозой дезоксиСА и фенофибрата.
   1. Приготовьте 40 мМ исходного раствора фенофибрата в ДМСО. Хранить при температуре -20 °C до 1 года.
   2. Подготовьте среду для лечения лекарственным средством: в 3 мл RDM+ разбавьте 1 мМ исходного раствора дезоксиСА до 1 мкМ дезоксиСА и разбавьте 40 мМ исходного раствора фенофибрата до 20 мкМ.
   3. Подготовьте среду для обработки deoxySA: в 3 мл RDM+ разбавьте 1 мМ исходного раствора deoxySA до 1 мкМ дезоксиСА и добавьте 1,5 мкл ДМСО.
   4. Подготовьте контрольную среду: в 3 мл RDM+ добавьте 3 мкл этанола и 1,5 мкл ДМСО.
   5. Под микроскопом для вскрытия с помощью стерильного зонда выбирают три группы органоидов, по крайней мере, пять органоидов в группе. Разделите группы на отдельные лунки сверхнизкой насадки 6-луночной пластины.
   6. Добавьте подготовленные препараты (дезоксиСА, дезоксиСА + фенофибрат или контроль) к органоидам. Через двое суток сменить среду в лунках свежеприготовленным RDM+ с добавлением соответствующих растворов deoxySA / фенофибрата / контроля.
   7. На четвертый день лечения приступайте к шагу 7 для обработки и анализа органоидов на гибель клеток (рис. 2).

7. Встраивание и криосекция органоидов

1. Приготовьте свежий 4% PFA, добавив 1 мл ампулы 16% PFA к 3 мл PBS.
2. Удалите носитель RDM+ из органоидов и один раз промойте PBS. Удалите как можно больше PBS из органоидов. Добавьте 2 мл свежеприготовленного 4% PFA (в PBS) к органоидам и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре.
3. После 15-минутной инкубации дважды промыть органоиды 2 мл PBS, затем промыть в PBS в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните фиксацию в химическом вытяжном шкафу и выбросьте раствор PFA и две последующие полоскания PBS в контейнер для отходов PFA с соответствующей маркировкой, хранящийся в вытяжном шкафу.
4. Аспирируйте весь PBS, затем добавьте 20% сахарозы в PBS к фиксированным органоидам. Убедитесь, что органоиды смешаны с раствором сахарозы и не остаются в пузырьке PBS сверху. Органоиды держат в растворе сахарозы до тех пор, пока они не опустятся на дно раствора сахарозы, т.е. ~1 ч при комнатной температуре. Фиксированные органоиды можно хранить в растворе сахарозы в течение ночи при температуре 4 °C.
5. Встройте органоиды в раствор ОКТ в криосекционную форму. Несколько органоидов в каждом условии могут быть встроены в одну форму. Сориентируйте органоиды, гарантируя, что их лучшие области сетчатки будут ссечены на криостате, а середина органоидов находится примерно в одной плоскости. Заморозьте встроенные органоиды при -20 °C. Встроенные органоиды могут храниться при температуре -80 °C в течение многих лет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды трудно увидеть в замороженном ОКТ; Ориентируйте кластеры СИЗОД к той стороне формы, которая будет обращена к лезвию, чтобы облегчить идентификацию органоидов.
6. Органоиды криосекции разбивают на срезы толщиной 10-14 мкм и приклеивают срезы к предметным стеклам, обработанным поли-L-лизином. Во время криосекции неоднократно проверяйте предметные стекла под микроскопом, чтобы определить срезы, содержащие середину органоидов. Собирайте только средние срезы органоидов, где все слои представлены равномерно (рис. 2A-C, рис. 3). После секционирования предметные стекла могут храниться в ящике для слайдов при температуре -80 °C в течение многих лет.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы, взятые на концах органоида, будут чрезмерно отбирать самые внешние фоторецепторы и не подходят для количественного определения. Органоиды среднего размера обеспечивают 10-15 срезов середины органоида, который представляет собой поперечное сечение слоистых слоев сетчатки.

8. Окрашивание TUNEL для апоптотических клеток

1. Разморозьте замороженные горки в течение 30 минут при температуре 37 °C. Немедленное размещение предметных стекол при температуре 37 °C предотвращает образование конденсата. Образцы тканей, замоченные в чистой воде, могут деформировать ткань. Инкубация при температуре 37 °C также улучшает адгезию ткани к предметному стеклу.
2. Создайте сплошную границу на стекле, оберните срезы тканей с помощью гидрофобной ручки. Это обеспечит границу и обеспечит адекватную фиксацию и инкубацию антител при небольшом объеме растворов. Добавьте примерно 100-200 мкл (объем заполнит область с гидрофобной каймой, не проливаясь) свежеприготовленного 4% PFA в течение 20 минут. Выполните фиксацию в химическом вытяжном шкафу и выбросьте раствор PFA в контейнер для отходов PFA с соответствующей маркировкой, хранящийся в вытяжном шкафу.
3. Промойте предметные стекла один раз в PBS, затем стирайте в PBS в течение 25 минут при комнатной температуре.
4. Приготовьте смесь TUNEL. Разморозьте фиолетовые и синие флаконы из набора для обнаружения гибели клеток in situ. Удалите 100 мкл раствора фиолетового флакона (можно использовать для отрицательного контроля) и смешайте оставшиеся 450 мкл раствора из фиолетового флакона с 50 мкл раствора из синего флакона. Хорошо перемешайте и держите в темноте. Каждый набор флаконов (всего 500 мкл) может окрашивать 5-10 предметных стекол.
5. Пронизывают срезы тканей.
   1. Приготовьте раствор для пермеабилизации: PBS с 0,1% TritonX-100 и 0,1% цитрата натрия
   2. Удалите PBS с образцов слайдов, а затем добавьте раствор для пермеабилизации в образцы. Инкубировать в течение 2 мин на блоке льда или при 4 °C. После этого один раз прополощите в PBS, затем постирайте в PBS в течение 10 минут.
6. Удалите PBS и высушите как можно больше раствора, используя уголок сложенной ткани. Добавьте к образцам 50-100 мкл приготовленной смеси TUNEL в зависимости от размера области, нарисованной гидрофобной ручкой. Накрыть стеклянной крышкой и выдерживать при 37 °C в течение 1 ч в темноте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все инкубации и промывки для следующих этапов должны выполняться в темноте, чтобы предотвратить обесцвечивание флуорофоров. Используйте либо темную коробку, либо накройте слайды алюминиевой фольгой, чтобы заблокировать свет.
7. Пометьте фоторецепторы. Промойте один раз с помощью PBS, затем стирайте в течение 20 минут в PBS. Удалите PBS, затем добавьте первичное антитело Recoverin (анти-Recoverin кролика), разбавленное 1:500 в PBS 0,1% Tween и 5% ослиной сыворотки. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
8. После удаления первичных антител один раз ополосните в PBS, затем промывайте в PBS в течение 20 минут. Добавьте вторичное антитело, ослиное противокроличье с оранжевым или красным фторфором, разбавленным 1:1,000 в PBS с 0,1% твином и 5% ослиной сывороткой и инкубируйте при комнатной температуре в течение 2 часов. Промойте один раз с помощью PBS, затем стирайте в течение 20 минут в PBS. Добавьте DAPI в соотношении 1:1000 в PBS, выдерживайте при комнатной температуре в течение 10 минут.
9. Промойте один раз с помощью PBS, затем стирайте в течение 20 минут в PBS. Извлеките PBS и добавьте монтажный носитель. Накройте шликером, запечатайте лаком для ногтей и оставьте сохнуть в темноте. Предметные стекла можно хранить при температуре 4 °C в темной таре до 1 недели.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для наилучшего качества изображения делайте снимки на следующий день.

9. Визуализация органоидных срезов и количественная оценка смерти.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации требуется конфокальный микроскоп с возможностью различать три флуорофорных канала. В этом эксперименте используются зеленый (Alexa Fluor 488), оранжевый (Alexa Fluor 555) и УФ (DAPI) каналы. Можно использовать любую комбинацию флуорофоров, гарантируя, что выбросы не попадут в другие каналы.

1. Найдите срезы сетчатки для визуализации и количественной оценки. При малом увеличении микроскопа (5x или 10x) используйте окрашивание Recoverin, которое маркирует цитоплазму фоторецепторов, и окрашивание DAPI, которое маркирует ядра всех клеток, чтобы найти область нарезанного органоида, которая является неповрежденной, хорошо сформированной и находится в плоскости, которая отбирает репрезентативное поперечное сечение органоида (рис. 2 и рис. 3 ). Найдите участок, который имеет отчетливый внешний ядерный слой фоторецепторов, толщиной по крайней мере в несколько клеток, и отдельный и отчетливый слой ядер, которые не имеют окрашивания Recoverin (рис. 2 и рис. 3).
2. Кадрируйте изображение. Увеличьте увеличение микроскопа до 20-кратного объектива и поместите предметное стекло в рамку, чтобы заполнить изображение как можно большей частью фоторецепторного слоя (рис. 3).
3. Установите Z-плоскость. При использовании микроскопа, который отображает Z-стеки, установите верхнюю и нижнюю границы Z-диапазона, чтобы получить изображение на всю глубину среза. Используйте одинаковую толщину Z-стека для всех изображений в экспериментальном наборе, чтобы во всех образцах анализировалось одинаковое количество ткани. Если вы не используете микроскоп, который отображает Z-стеки, сфокусируйте изображение на середине среза.
4. Изображение всех трех каналов флуорофоров в Z-стеке. Все три канала необходимы для положительной идентификации умирающей клетки. Изображение одной области на органоид.
5. Сохраните набор изображений в формате файла, который сохраняет соотношение площади на пиксель.

10. Количественная оценка умирающих клеток

1. Открывайте стеки изображений в программном обеспечении FIJI (Image J). В окне « Параметры импорта биоформатов » убедитесь, что в разделе «Разделить на отдельные окна» не установлены флажки. Прокрутка между выровненными каналами изображения имеет решающее значение для правильной идентификации ячеек.
2. Сведите набор изображений Z-stack, щелкнув « >Стеки изображений », затем выберите «Проект Z» в раскрывающемся меню. Это создаст новое изображение для количественной оценки. Если органоиды не были изображены в Z-серии, пропустите этот шаг.
3. Выберите канал изображения, на котором показано окрашивание Recoverin (в данном примере красный). Нажмите на инструмент выделения полигонов на панели инструментов и обведите непрерывную область фоторецепторов на изображении (рис. 3A). Нажмите «Анализировать» > установить измерения. Во всплывающем окне «Установить измерения» установите флажок рядом с «Площадь», нажмите «Анализировать» и выберите «Измерить», чтобы измерить площадь (или нажмите «m» в качестве ярлыка) фоторецепторов для подсчета умирающих клеток. Измерение площади появится во всплывающем окне измерений.
4. Подсчитайте TUNEL-положительные ядра в ранее выбранной области фоторецептора (рис. 3B, C). Щелкните правой кнопкой мыши точечный инструмент на панели инструментов и выберите многоточечный инструмент. Только в канале TUNEL нажмите на положительное окрашивание TUNEL, которое перекрывается положительными ядрами DAPI, и окрашивание Recoverin. Переключение между каналами для проверки положительных клеток.
5. Разделите количество TUNEL-положительных клеток на площадь, чтобы получить нормализованное значение гибели клеток в фоторецепторах на органоид (рис. 2D, E).

Результаты

Органоиды сетчатки были получены из контрольной линии iPSC, не относящейся к MacTel. После того, как органоиды достигли 26 недель в культуре, они были отобраны и разделены на экспериментальные группы. Органоиды обрабатывали различными концентрациями дезоксиСА, чтобы определить, токситен ли ?...

Обсуждение

Вариации протокола дифференциации
С момента изобретения самоформирующихся оптических чашек группой²⁰ Йошики Сасаи многие лаборатории разработали протоколы для генерации органоидов сетчатки, которые могут изменяться почти на каждом этапе 5,18,19,21.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503