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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.

Resumen

La terapia individualizada para pacientes con fibrosis quística (FQ) se puede lograr con un modelo de enfermedad in vitro para comprender la actividad basal del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) y la restauración a partir de compuestos de moléculas pequeñas. Nuestro grupo se centró recientemente en establecer un modelo organoide bien diferenciado derivado directamente de las células epiteliales nasales humanas primarias (HNE). La histología de organoides seccionados, la tinción inmunofluorescente de montaje completo y las imágenes (utilizando microscopía confocal, microscopía inmunofluorescente y campo brillante) son esenciales para caracterizar organoides y confirmar la diferenciación epitelial en preparación para ensayos funcionales. Además, los organoides HNE producen lúmenes de diferentes tamaños que se correlacionan con la actividad de CFTR, distinguiendo entre organoides CF y no CF. En este manuscrito, se describe en detalle la metodología para el cultivo de organoides HNE, centrándose en la evaluación de la diferenciación utilizando las modalidades de imagen, incluida la medición del área de lúmenes basales (un método de medición de la actividad CFTR en organoides que cualquier laboratorio con un microscopio puede emplear), así como el enfoque automatizado desarrollado para un ensayo funcional (que requiere equipos más especializados).

Introducción

Introducción a la técnica
Los ensayos basados en cultivos ex vivo son una herramienta cada vez más utilizada para la medicina de precisión y el estudio de la fisiopatología de enfermedades. El cultivo primario de células epiteliales nasales humanas (HNE) se ha utilizado en numerosos estudios de fibrosis quística 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , una enfermedad autosómica recesiva que afecta la función de las células epiteliales en múltiples órganos. El cultivo de HNE proporciona una fuente renovable de epitelios de las vías respiratorias que se pueden obtener prospectivamente y recapitula las cualidades electrofisiológicas y bioquímicas para probar la actividad del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Las células HNE se pueden muestrear con efectos secundarios mínimos14, similar a los hisopos respiratorios virales comunes. Recientemente se ha publicado un trabajo de investigación que describe un modelo para el estudio de la fibrosis quística derivado de biopsias con cepillo HNE11,13. Si bien es similar a otros modelos que utilizan HNEprimaria 2,3 y tejido intestinal 15,16,17,18,19, la caracterización detallada de la diferenciación y la obtención de imágenes de este modelo se describen aquí para su uso en la investigación de la FQ y para ayudar en los estudios de otras enfermedades de las vías respiratorias 13 . El modelo organoide no es ilimitado como las líneas celulares inmortalizadas, sino que puede ampliarse mediante reprogramación condicional (utilizando fibroblastos alimentadores irradiados e inactivados e inhibidores de la Rho-quinasa) a un estado más similar al de las células madre 20,21,22,23. El procesamiento de biopsias con cepillo HNE utilizando este método produce un gran número de células epiteliales para su uso en múltiples aplicaciones con un mayor rendimiento, al tiempo que conserva la capacidad de diferenciarse completamente. Si bien este protocolo se desarrolló utilizando células alimentadoras, otros investigadores que deseen evitar la tecnología de células alimentadoraspueden utilizar otras metodologías 14,24.

Importancia de la técnica para la biología pulmonar
Se ha dedicado un estudio significativo a comprender cómo la ausencia de CFTR regular y funcional en la membrana celular de las células epiteliales resulta en una disfunción en los pulmones, el páncreas, el hígado, el intestino u otros tejidos. El transporte disfuncional de iones epiteliales, particularmente el de cloruro y bicarbonato, da como resultado una disminución del volumen de los fluidos del revestimiento epitelial y cambios en las secreciones mucosas, lo que lleva a la estasis mucosa y la obstrucción. En otras enfermedades de las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria, el movimiento ciliar alterado afecta el aclaramiento mucociliar y conduce a estasis mucosa y obstrucción25. Por lo tanto, el modelo organoide HNE actual se ha desarrollado para diversas aplicaciones, dependiendo del diseño experimental y los recursos del investigador. Esto incluye imágenes de células vivas utilizando tinciones de células vivas; fijación y seccionamiento para caracterizar la morfología; tinción de inmunofluorescencia con anticuerpos e imágenes confocales de montaje completo para evitar la interrupción de las estructuras intraluminales; y imágenes de campo brillante y tomografía de coherencia microóptica para mediciones cuantitativas de la frecuencia de latido ciliar y el transporte mucociliar13. Para facilitar la expansión a otros investigadores, se utilizaron reactivos y suministros disponibles comercialmente para el cultivo. Se desarrolló un ensayo funcional que utilizó técnicas comunes de microscopio y equipos más especializados. En general, si bien el presente modelo fue diseñado para evaluar la actividad de CFTR al inicio o en respuesta a la terapéutica, las técnicas descritas en este protocolo se pueden aplicar a otras enfermedades que involucran la función de las células epiteliales, especialmente el transporte de líquido celular epitelial.

Comparación con otras metodologías
Recientemente se desarrolló la utilidad de este modelo organoide correlacionando in vitro las respuestas moduladoras CFTR de los organoides de los pacientes con su respuesta clínica11. En particular, también se demuestra que el modelo actual era paralelo a las respuestas de corriente de cortocircuito, el estándar de oro actual para evaluar la función CFTR, en los mismos pacientes. La corriente de cortocircuito difiere del ensayo de hinchazón porque el primero mide la función CFTR a través del transporte iónico26. En contraste, este ensayo mide un efecto más aguas abajo con el transporte de fluidos, proporcionando información adicional sobre la función general de CFTR 27,28,29,30,31,32. Las mediciones de corriente de cortocircuito han seguido siendo un método común y fiable para determinar la actividad del canal de cloruro CFTR 1,33. Estos ensayos electrofisiológicos requieren equipos especializados y costosos, requieren muchas veces más células para cada réplica experimental que el ensayo organoide, no se pueden automatizar fácilmente y no son susceptibles de escalar para aplicaciones de mayor rendimiento. Otro modelo organoide derivado de epitelios intestinales tiene ventajas adicionales 15,16,17,18, como una capacidad replicativa más excelente, pero no se deriva de un tejido de las vías respiratorias ni está disponible universalmente. Los cepillados HNE se obtienen con cepillos de citología de bajo costo sin necesidad de sedación y con un riesgo mínimo. Obtener el cepillado no requiere un médico y puede ser realizado por coordinadores de investigación capacitados y otro personal de investigación14. El modelo organoide HNE puede ser cultivado por cualquier laboratorio con capacidades de cultivo celular primario, y algunas de las aplicaciones se pueden realizar con técnicas de microscopía estándar. En conjunto, estas ventajas proporcionan acceso adicional a la tecnología para evaluar la función epitelial de las vías respiratorias que de otro modo podría no estar disponible para algunos laboratorios. Además, los organoides HNE se pueden utilizar para estudiar otros estados de enfermedad que afectan a las vías respiratorias, como la discinesia ciliar primaria25 o la infección viral, que los organoides intestinales no pueden.

Protocolo

Las muestras de HNE se recolectaron en el hospital Children's of Alabama. Todos los procedimientos y métodos descritos aquí han sido aprobados por la Universidad IRB de Alabama en Birmingham (UAB IRB #151030001). Para facilitar la expansión y mejorar la función de las células epiteliales nasales humanas (HNE), los métodos de cultivo actuales se adaptan del conocido método de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI)28,34. Los HNE se recogieron inicialmente mediante biopsia con pincel como se describió anteriormente12,14, con la única diferencia de utilizar un cepillo de citología. Todas las etapas de procesamiento de muestras y cultivo celular se realizaron en el gabinete de bioseguridad.

1. Cultivo celular y expansión de células epiteliales nasales

  1. Después del cepillado, guarde la muestra de biopsia nasal en 8 ml de medios RPMI en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo y transfiérala al laboratorio dentro de las 4 h (no más de 24 h).
  2. Disociar la biopsia con cepillo nasal en 8 ml de medios RPMI en un tubo cónico de 15 ml pasando el cepillo de citología a través de una punta de pipeta de gran diámetro de 1 ml (cortar la punta) varias veces hasta que el cepillo esté libre de tejido.
  3. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a 4 °C, retirar el sobrenadante y luego volver a suspender el pellet celular en 3 ml de solución de desprendimiento celular (ver Tabla de materiales) e incubar a temperatura ambiente durante 16 min para digerir.
  4. Utilice 5 ml de medios de expansión (Tabla 1) para lavar las celdas dos veces. Luego, agregue células a un matraz T75 pre-sembrado con fibroblastos 3T3 irradiados e inactivados22 (50% -60% de confluencia) para co-cultivar las células y expandirse en el medio de expansión durante 7-14 días (ver Figura 1 para la colonia apropiada). Antes de su uso, pruebe los fibroblastos 3T3 irradiados para asegurarse de que no puedan proliferar, lo que influirá negativamente en la expansión de las células epiteliales.
    NOTA: Deseche las células si la confluencia de células epiteliales nasales no alcanza el 70% dentro de los 14 días.
  5. Para las células derivadas de pacientes con FQ, introducir cuatro antibióticos (100 μg/mL de tobramicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B, 100 μg/mL de ceftazidima, 100 μg/mL de vancomicina, ver Tabla de Materiales) en el medio de expansión para la desinfección de las células durante los primeros 3 días de cultivo, y luego reemplazar los medios con medios de expansión libres de antibióticos que cambien los medios cada 2 días.
    NOTA: Este uso limitado de antibióticos está destinado a reducir la pérdida de cultivo debido a la colonización bacteriana al tiempo que fomenta la proliferación después de que se eliminan los antibióticos adicionales. Estos antibióticos se pueden adaptar a los resultados microbiológicos específicos del paciente, con sensibilidades, si es necesario.
  6. Cosechar HNE de cocultivo utilizando el método de tripsinización doble22 una vez que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia. Este método garantiza que los fibroblastos 3T3 irradiados e inactivados se eliminen del matraz y no contaminen la siembra organoide posterior.
    1. Lave las células con 1x DPBS, y luego agregue 1.5 ml de tripsina-EDTA al 0.05% en el matraz T75 durante 4 min a 37 ° C para eliminar el fibroblasto 3T3 irradiado e inactivado del cultivo.
    2. Enjuague el matraz T75 con 1x DPBS dos veces para lavar bien los fibroblastos 3T3 restantes; añadir 1,5 ml de tripsina-EDTA al 0,05% en el matraz T75 durante 10 min a 37 °C para separar las HNE.
    3. Neutralizar la tripsina con el inhibidor de tripsina de soja (ver Tabla de Materiales) en una proporción de 1:1. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min, y luego retirar el sobrenadante. Después de lavar las células con 5 ml de medios de expansión una vez, las células están listas para la siembra para cultivar organoides.
      NOTA: Se recomienda que los HNE con un número de paso de tres se utilicen para experimentos adicionales.

2. Crecimiento y diferenciación de organoides en diapositivas e insertos de cultivo

  1. Descongelar la matriz extracelular (ECM) de cultivo de organoides durante la noche a 4 °C. Puntas de pipeta frías a 4 °C y diapositivas de angiogénesis de 15 pocillos (ver Tabla de materiales) durante la noche a 4 °C.
    NOTA: La ECM debe colocarse a 4 ° C la noche antes de que se deba realizar la recolección de células.
  2. Cubra los portaobjetos con 5 μL de ECM 100% frío sobre hielo (pipeta 5 μL de ECM 100% frío con una punta de pipeta fría en cada pozo del portaobjetos de 15 pocillos), y luego colóquelos en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C durante al menos 30 min para la consolidación.
  3. Contar los HNE cosechados del cocultivo utilizando un hemocitómetro y diluir las células a 500 células/μL en número total con un 20% de ECM diluido por medios de diferenciación (Tabla 2) en hielo. Luego, sembra 5 μL de la mezcla de células frías/ECM en cada pocillo de los portaobjetos recubiertos con ECM.
  4. Transfiera inmediatamente los portaobjetos a una incubadora de cultivo a 37 °C durante 1 h para consolidar la mezcla célula/ECM.
  5. Alimente las células en cada pocillo de los portaobjetos de angiogénesis de 15 pocillos con 50 μL de medios de diferenciación. Cambie los medios cada dos días hasta que los organoides estén listos para más experimentos.
    NOTA: Los organoides generalmente se pueden visualizar después de 1-2 días. Hay 20-90 organoides comúnmente formados en cada pozo de las diapositivas. Los organoides generalmente pueden sobrevivir durante 40-60 días en ECM con alimentación cada dos días cuando se mantienen en una incubadora humidificada a 37 ° C.
  6. Cultive los organoides en los insertos de cultivo (ver Tabla de Materiales) para una mayor cantidad para aplicaciones específicas (como seccionamiento para histología o inmunofluorescencia) según los pasos mencionados a continuación.
    1. Para cultivar organoides en los insertos de cultivo, prepare el cultivo de organoides ECM, las puntas de la pipeta y los insertos como se menciona en los pasos 2.1-2.2. Cubra los insertos con 100 μL de ECM 100% frío.
    2. Sembra 60 μL de mezcla de célula/ECM (500 células/μL con 20% de ECM en medios de diferenciación) sobre el recubrimiento de ECM en el inserto.
      NOTA: Todos los demás pasos para hacer organoides en los insertos son los mismos que los realizados en las diapositivas, pasos 2.4-2.5.
    3. Agregue 600 μL del medio de diferenciación en la parte inferior del inserto. Cambie los medios cada día alterno hasta que los organoides se utilicen para experimentos, generalmente de 2 a 3 semanas.

3. Preparación y aislamiento de organoides para inmunofluorescencia de montaje completo

  1. Aislamiento y fijación de organoides
    1. Pretratar portaobjetos de cámara de fondo de vidrio de 8 pocillos con adhesivo celular (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos siguiendo la Referencia35. Después de desechar la solución, seque al aire los pocillos durante 30 minutos.
    2. Para cosechar los organoides, retire los medios de la parte superior de la ECM y luego agregue 50 μL de PBS frío 1x en cada pozo de los portaobjetos de 15 pocillos en hielo (1: 1 con volumen de ECM).
    3. Pipete hacia arriba y hacia abajo 3-5 veces usando 200 μL de la punta de la pipeta de gran diámetro, y luego dispense la solución en el centro de un pozo de los portaobjetos de la cámara de 8 pocillos.
    4. Retire inmediatamente el exceso de líquido de los pozos con una pipeta de punta fina. Luego, coloque el deslizamiento de la cámara en una incubadora de 37 ° C durante 40 minutos para mejorar el organoide que se adhiere al fondo de vidrio.
    5. Después de lavar suavemente con 1x PBS dos veces, fije los organoides con 300 μL de paraformaldehído al 4% en cada pozo durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
    6. Lavar dos veces con 1x PBS y almacenar los organoides en 1x PBS a 4 °C para inmunotinción durante un máximo de 2 semanas.
  2. Tinción por inmunofluorescencia
    1. Para reducir la autofluorescencia, agregue 250 μL de 50 mM NH4Cl en 1x PBS en cada pozo de las diapositivas en RT durante 30 min mientras agita suavemente en un agitador a 20 rpm.
    2. Después de lavar con 1x PBS dos veces, permeabilice las células con 0.1% Triton X-100 durante 30 min a RT mientras agita suavemente a 20 rpm.
    3. Después de lavar con 1x PBS dos veces, agregue 300 μL de solución de bloqueo, incluyendo 5% de BSA y 0.1% de Triton X-100 en 1x PBS, en cada pozo durante 1 h en RT.
    4. Después del lavado, agregue anticuerpos primarios en los pocillos apropiados seguidos de anticuerpos secundarios (ver Tabla de Materiales). Preparar soluciones de anticuerpos primarios y secundarios en 2% de BSA y 0.3% de Triton X-100 en 1x PBS. Incubar todos los anticuerpos primarios a 4 °C durante 2 días y todos los anticuerpos secundarios a 4 °C durante 1 día.
      NOTA: Las concentraciones finales dependen de la proteína deseada para el experimento. Compruebe la concentración de existencias en la ficha técnica del fabricante. A continuación, calcule las concentraciones finales en función de las diluciones utilizadas en la Tabla de Materiales.
    5. Después de la incubación, lave bien los pocillos con 1x PBS y agregue DAPI en BSA al 2% y Triton X-100 al 0.3% en cada pozo para la tinción nuclear.
    6. Tome imágenes de los organoides utilizando un microscopio de barrido láser confocal, con un objetivo de inmersión en aceite de 20-60x (ver Tabla de materiales). Utilice el modo Z-stack para establecer los límites superior e inferior de la imagen y utilice el tamaño óptimo de paso Z recomendado determinado por el software confocal.
      NOTA: Se utilizaron las siguientes cuatro longitudes de onda de excitación láser confocal: 408,7 nm, 489,1 nm, 561,7 nm y 637,9 nm.

4. Preparación y aislamiento de organoides para seccionamiento histológico

  1. Para cosechar los organoides para estudios histológicos, retire los medios del cultivo y agregue 50 μL de PBS frío 1x en cada pozo de los portaobjetos en hielo.
  2. Pipetee hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces usando una punta de pipeta de gran diámetro de 200 μL, combine todas las soluciones de los insertos de deslizamiento o cultivo de 15 pocillos en un tubo cónico de 15 ml sobre hielo. Ajuste el volumen total de solución en el tubo a 10 ml agregando 1x PBS frío adicional.
  3. Centrifugar el tubo a 4 °C, 300 x g durante 5 min; aspire el sobrenadante y agregue 60 μL de histogel caliente (ver Tabla de Materiales) para mezclar con el pellet organoide usando un 200 μL de la punta de la pipeta de gran diámetro.
  4. Transfiera inmediatamente la suspensión a un molde histológico. Después de la consolidación del histogel a temperatura ambiente, coloque el bloque de molde en paraformaldehído al 4% para su fijación durante la noche a 4 ° C.
  5. Después de incrustar en parafina, corte el bloque de histogel en secciones transversales de 5 μm (por ejemplo, con un microtomo), fije las secciones en portaobjetos de vidrio y manche con hematoxilina y eosina (H & E) o anticuerpos marcados con inmunofluorescencia. Tome imágenes con un microscopio de campo brillante o un microscopio de epifluorescencia invertida (consulte la Tabla de materiales).

5. Imágenes de organoides vivos

NOTA: Los siguientes pasos se llevan a cabo utilizando un sistema de imágenes automatizado (consulte la Tabla de materiales). Los diferentes sistemas de imagen deben adaptar estos pasos siguiendo las instrucciones específicas de su fabricante. Independientemente del equipo utilizado, los organoides vivos de imágenes requieren una cámara ambiental humidificada y con temperatura controlada con un controlador de gas CO2 acompañado.

  1. Para monitorear la diferenciación de organoides antes de realizar un ensayo de hinchazón funcional36, capture las imágenes completas de la diapositiva manualmente con cualquier microscopio de campo brillante o con un sistema de imágenes automatizado, como se detalla a continuación.
    1. Encienda la alimentación del sistema de imágenes automatizado y del controlador de gas CO2/O2 y permita que el sistema complete la calibración automatizada (~30 min).
    2. Después de completar, ajuste la temperatura del sistema de imágenes a 37 ° C; agregue 15 ml de agua estéril al depósito de humidificación, abra las válvulas de CO2 , cierre las tapas y deje que el sistema de imágenes se predicueste durante un mínimo de 30 minutos antes de la toma de imágenes.
    3. Abra el software de imágenes automatizadas para configurar un protocolo para la creación de imágenes y elija la ubicación para guardar los datos experimentales sin procesar.
      NOTA: Se ha proporcionado un archivo de protocolo de ejemplo (Archivo complementario 1), específico para el sistema de imágenes, como plantilla para la obtención automatizada de imágenes de organoides para monitorear la diferenciación de organoides.
    4. Una vez que se cumplan los ajustes ambientales, transfiera inmediatamente hasta dos diapositivas de 15 pocillos con tapas a la cámara ambiental en el inserto del soporte de diapositivas del sistema de imagen automatizado (consulte la Tabla de materiales).
    5. Seleccione los pozos a los que se va a tomar una imagen y comience a tomar imágenes para completar la obtención de imágenes de los pozos deseados.
      NOTA: Los ajustes básicos recomendados son: objetivo de aire 4x y 10x, canal de campo brillante, montaje de 2 x 2 para objetivo de 4x para cubrir toda el área del pozo, montaje de 4 x 4 para un objetivo de 10x. Configuración de la pila Z: de tres a seis segmentos de pila Z, tamaño del paso Z = 50-100 μm, uno o dos segmentos por debajo del punto de enfoque automático y de tres a cinco segmentos por encima.
  2. Para obtener imágenes de organoides vivos para su uso en un ensayo de hinchazón inducida por forskolina (FIS), use un microscopio con una etapa automatizada equipada con una cámara de imágenes controlada ambientalmente que permite el control de la temperatura y el CO2 .
    1. Comience con los pasos 5.1.1-5.1.4, sustituya el archivo de protocolo en el paso 5.1.3 por el proporcionado en el archivo de protocolo de ejemplo (Archivo complementario 2) que contiene la configuración específica para realizar un ensayo FIS.
    2. Antes de cada experimento, ajuste la configuración de exposición evaluando al menos tres pocillos para cada diapositiva (extremo izquierdo, medio y extremo derecho). Aplique las compensaciones de coordenadas X e Y para asegurarse de que el objetivo estará en el centro del pozo para todos los pozos.
      NOTA: Los ajustes básicos recomendados son: objetivo de aire 4x, Canal 1 = Campo brillante, Canal 2 = DAPI, montaje 2 x 2 (cuatro mosaicos de imagen). Configuración de la pila Z: de tres a cuatro segmentos de pila Z, tamaño del paso Z = 50-100 μm, un segmento por debajo del punto de enfoque automático y dos o tres segmentos por encima. Tiempo de adquisición de la imagen: 8 h con intervalos de 20 min (Lecturas totales = 25; La lectura 1 es T = 0).
    3. Una vez que todos los ajustes estén seleccionados adecuadamente, elija los pozos a los que desea crear imágenes para ambas diapositivas, o seleccione todos, y comience la ejecución según las instrucciones del equipo.
    4. Después de ejecutarlo, guarde el experimento, cierre el software de imágenes y apague el sistema de imágenes37.

6. Mediciones de lúmenes de referencia

NOTA: Esto se hace utilizando un software de análisis de imágenes manual (consulte la Tabla de materiales). Se puede seguir una metodología similar utilizando un software de código abierto38 o cualquier software que pueda medir el área de una región en una imagen.

  1. En el software, abra el Panel de medición automatizada haciendo clic con el botón secundario en la parte inferior de la pantalla, seleccione Medición y, a continuación, Resultados de medición automatizada. El área de cada región de interés (ROI) medida aparecerá allí.
  2. Abra la imagen organoide en el software y seleccione 5-10 organoides con lúmenes visibles.
    NOTA: Los lúmenes serán un área circular en el centro del organoide que es visiblemente diferente en color que el resto del organoide (Figura 2A).
  3. Usando la función de medición de ROI de polígono, mantenga presionado el botón derecho en la imagen para abrir el menú y seleccione ROI poligonal para delinear el organoide completo para obtener el área de superficie total (TSA) del organoide. Luego, usando la misma característica, delinee el área de lúmenes (LA) (Figura 2B).
  4. Repita para los organoides restantes en el pozo y todos los pozos en el ensayo.
  5. Exporte los datos a Excel. Divida el LA por la TSA y promedie todos los organoides de la muestra para obtener la Relación de Lúmenes Basales (BLR)11,13.
    NOTA: Por lo general, ~ 87% de los organoides sin FQ tendrán un BLR superior a 0.6, y el 97% será superior a 0.5, mientras que solo el 14% de los organoides con FQ tendrán un BLR superior a 0.6, y el 31% será superior a 0.5.

7. Pretratamiento e imágenes automatizadas de organoides HNE

NOTA: Todos los pasos previos al tratamiento se llevan a cabo en un gabinete de bioseguridad limpio. Preconfigure el sistema de imágenes automatizado y el software para registrar el ensayo antes del paso 7.1. La incubación con DAPI es opcional, pero se recomienda como a prueba de fallos si la calidad de las imágenes de campo brillante se ve comprometida. En este caso, el canal DAPI (377 nm) se puede analizar en su lugar.

  1. Preincubar los organoides en un pozo de portaobjetos de 15 pocillos con 50 μL de medios de diferenciación que contengan DAPI con o sin 100 μM de CFTRinh-172 (ver Tabla de Materiales) en una incubadora de 37 °C durante 1 h. Mientras los organoides se incuban, realice el paso 5.2.1 utilizando un protocolo personalizado de ensayo de hinchazón siguiendo el Archivo Suplementario 2.
  2. Retire el medio de preincubación con una pipeta Pasteur de vidrio con aspiración. Añadir 10 μM de forskolina y 100 μM de IBMX (cócteles de estimulación) (ver Tabla de Materiales) para un volumen total de medios de diferenciación de 50 μL en cada pozo.
    NOTA: Asegúrese de que no se introduzcan burbujas en los pozos. Las burbujas en las imágenes afectarán el análisis automatizado.
  3. Sin demora, comience el protocolo de imágenes FIS siguiendo los pasos 5.2.2 a 5.2.4. Adquiere imágenes cada 20 min en cada pozo, con un tiempo de ejecución total de 8 h.

8. Análisis automatizado del ensayo de hinchazón inducida por forskolina en organoides HNE

  1. Abra el software de análisis automatizado de imágenes, busque el experimento previamente guardado en el paso 7.3 y abra las imágenes del experimento.
  2. Elija la ventana del recipiente que se va a evaluar y seleccione la opción que contiene las imágenes procesadas que han sido cosidas y proyectadas en z. Este paso debe proporcionar una imagen de todo el pozo con todos los organoides dentro del marco de imágenes para enmascarar la evaluación y las mediciones.
  3. Elija la imagen de pozo para evaluar. Seleccione Analizar. Repita este proceso para otras imágenes a fin de garantizar un enmascaramiento adecuado para todas las imágenes incluidas en las mediciones automatizadas. Guarde los parámetros de configuración.
  4. Después de completar la configuración de análisis, aplique los cambios. El software cambiará las mediciones en función de la configuración.
    NOTA: Una vez completado el preprocesamiento inicial de la imagen, se deben realizar medidas de control de calidad (QC) para garantizar un enmascaramiento consistente. Estos incluyen la revisión manual de todos los pozos para garantizar que los organoides estén dentro del marco de la imagen, que las burbujas o los escombros no estén enmascarados de manera inapropiada, y verificar el enmascaramiento en el campo brillante y los canales DAPI.
  5. Exporte los datos para el análisis resumido (incluidos los gráficos y el análisis estadístico).

Resultados

La expansión de los HNE es esencial para un cultivo de organoides próspero. Las HNE de una recolección de muestra exitosa deben expandirse a más del 70% de confluencia alrededor de 10 días. Un ejemplo de muestras exitosas y no exitosas se muestra en la Figura 1A y la Figura 1B, respectivamente. Las células deben descartarse si no pueden alcanzar el 70% de confluencia a los 14 días después del cocultivo con células 3T3 irradiadas. Cualqu...

Discusión

Este manuscrito proporciona metodologías detalladas para imágenes completas en vivo y fijas de los organoides epiteliales de las vías respiratorias derivados de la biopsia con cepillo HNE. Describe ensayos funcionales que pueden determinar la actividad de CFTR en un individuo. Los HNE proporcionan un tejido primario mínimamente invasivo para una variedad de aplicaciones. Las técnicas de expansión ofrecidas aquí se pueden utilizar para modelar la enfermedad de las vías respiratorias, incluidos los organoides. Los ...

Divulgaciones

JSG figura como inventor en una solicitud de patente 20170242033 de la Universidad de Carolina del Norte que describe un modelo similar. Cuando la tecnología licenciada de la UNC produce regalías, los inventores reciben una parte de los ingresos. De lo contrario, los autores declaran que no hay conflictos de intereses. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, en la recopilación, análisis o interpretación de datos, en la redacción del manuscrito o en la decisión de publicar los resultados.

Agradecimientos

Agradecemos las contribuciones de todos los participantes que donaron biopsias con cepillo HNE para desarrollar este protocolo. Agradecemos a Latona Kersh y al personal de la Unidad de Investigación Infantil por coordinar el reclutamiento de voluntarios del estudio y la recolección de muestras. Agradecemos a Lily Deng, Johnathan Bailey y Stephen Mackay, ex aprendices en nuestro laboratorio, por su asistencia técnica. Agradecemos a Zhong Liu y Rui Zhao por su ayuda técnica. Steven M. Rowe, director del Centro de Investigación de CF de la UAB, aporta liderazgo y recursos, sin los cuales este trabajo no sería posible. También nos gustaría agradecer a Sarah Guadiana de Biotek por su ayuda con la formación de instrumentos, a Robert Grabski por la asistencia en microscopía confocal en el Centro de Imágenes de Alta Resolución de la UAB y a Dezhi Wang por la asistencia histológica en el Núcleo de Histología de la UAB. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH). Subvención K23HL143167 (a JSG), Subvención de la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) GUIMBE18A0-Q (a JSG), el Centro de Fibrosis Quística Gregory Fleming James [NIH Grants R35HL135816 y DK072482 y el Programa de Investigación y Desarrollo de la Universidad CFF de Alabama en Birmingham (UAB) (Rowe19RO)], y el Centro de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la UAB (NIH Grant UL1TR001417).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Nasal brushMedical Packaging CYB1CYB-1Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette TipsThermoFisher Scientific02-707-141Large bore pipette tips
AccutaseThermoFisher ScientificA1110501Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTAGibco25300-054
Trypsin inhibitor from soybeanSigmaT6522Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrixCorning356255Extracellular matrix (EM)
µ-Slide AngiogenesisIbidi8150615-well slide
24-Well TranswellCorning7200154Culture insert
Chambered CoverglassThermoFisher Scientific1554098-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveThermoFisher Scientific354240Cell adhesive
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences50980487
Triton X-100Alfa AesarA16046
BSAThermoFisher ScientificBP1600-100
NucBlueThermoFisher ScientificR37605DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)NikonInverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25NikonConfocal microscope
NIS Elements- Basic ResearchNikonmanual imaging analysis software
HistogelThermoFisher ScientificHG-4000-012
Disposable Base MoldsThermoFisher Scientific41-740
Lionheart FXBioTekBTLFXAutomated image system
Lionheart CoverBioTekBT1450009Environmental Control Lid
Humidity ChamberBioTekBT1450006Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2BioTekBT1210013Gas controller
Microplate/Slide Stage InsertBioTekBT1450527Slide holder
Gen5 Imaging Prime SoftwareBioTekBTGEN5IPRIMAutomated imaging analysis software
4x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320515
10x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320516
LED CubeBioTekBT1225007
Filter Cube (DAPI)BioTekBT1225100DAPI
CFTRinh-172Selleck ChemicalsS7139
ForskolinSigmaF6886
IBMXSigmaI5879
Expansion Media
DMEMThermoFisher Scientific11965
F12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765
Fetal Bovine SerumThermoFisher Scientific 16140-071
Penicillin/StreptomycinThermoFisher Scientific 15-140-122
Cholera ToxinSigma C8052
Epidermal Growth Factor (EGF)ThermoFisher Scientific PHG0314
Hydrocortisone (HC)Sigma H0888
InsulinSigma I9278
AdenineSigma A2786
Y-27632Stemgent 04-0012-02
Antibiotic Media
CeftazidimeAlfa Aesar J66460-03
TobramycinAlfa Aesar J67340
VancomycinAlfa Aesar J67251
Amphotericin BSigma A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1)ThermoFisher Scientific 11330-32
Ultroser-GPall 15950-017
Fetal Clone IIHyclone SH30066.03
Bovine Brain ExtractLonza CC-4098
InsulinSigma I-9278
HydrocortisoneSigma H-0888
TriiodothyronineSigma T-6397
TransferrinSigma T-0665
EthanolamineSigma E-0135
EpinephrineSigmaE-4250
O-PhosphorylethanolamineSigmaP-0503
Retinoic AcidSigmaR-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibodyR&D SystemsMAB1660Dilution: 100x
ZO-1 antibodyThermo FisherMA3-39100-A647Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibodySigmaHPA008246Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulinSigmaT7451Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibodyAbcamAb11315Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA21202Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594InvitrogenA21207Dilution: 2000x

Referencias

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