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요약

상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.

초록

낭포성 섬유증 (CF) 환자에 대한 개별화 된 치료는 기준선 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 활성 및 소분자 화합물로부터의 복원을 이해하기 위해 시험관 내 질병 모델로 달성 될 수 있습니다. 우리 그룹은 최근 일차 인간 비강 상피 세포 (HNE)에서 직접 파생 된 잘 분화 된 오가노이드 모델을 수립하는 데 중점을 두었습니다. 절편된 오가노이드의 조직학, 전체 탑재 면역형광 염색 및 이미징(공초점 현미경, 면역형광 현미경 및 밝은 필드 사용)은 기능적 분석에 대비하여 오가노이드를 특성화하고 상피 분화를 확인하는 데 필수적입니다. 또한, HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하며, CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 이 원고에서는 HNE 오가노이드를 배양하기위한 방법론이 자세히 설명되어 있으며, 기준선 루멘 면적 측정 (현미경을 사용하는 모든 실험실에서 사용할 수있는 오가노이드에서 CFTR 활성 측정 방법)을 포함한 이미징 양식을 사용한 분화 평가뿐만 아니라 기능 분석에 대한 개발 된 자동화 된 접근법 (더 전문화 된 장비가 필요함)에 중점을 둡니다.

서문

기술 소개
Ex vivo 배양 기반 분석은 정밀 의학 및 질병 병리 생리학 연구에 점점 더 많이 활용되는 도구입니다. 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포 배양은 낭포성 섬유증의 수많은 연구에 사용되어 왔으며 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , 여러 장기에서 상피 세포 기능에 영향을 미치는 상염색체 열성 질환. HNE 배양은 전향적으로 얻을 수 있는 기도 상피의 재생 가능한 공급원을 제공하고 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 활성을 시험하기 위해 전기생리학적 및 생화학적 특성을 되풀이합니다. HNE 세포는 일반적인 바이러스성 호흡기 면봉과 유사한 최소한의 부작용(14)으로 샘플링될 수 있다. HNE 브러쉬 생검으로부터 유래된 낭포성 섬유증 연구에 대한 모델을 기술하는 연구 작업은 최근11,13에 발표되었다. 일차 HNE2,3 및 장 조직15,16,17,18,19를 사용하는 다른 모델과 유사하지만, CF 연구에 사용하고 다른 기도 질환의 연구를 돕기 위해 이 모델의 분화 및 영상화에 대한 상세한 특성화가 여기에 기술되어 있다 13 . 오가노이드 모델은 불멸화된 세포주처럼 무제한이 아니지만, 조건부 재프로그래밍(조사되고 불활성화된 피더 섬유아세포 및 Rho-kinase 억제제 사용)에 의해 보다 줄기 세포 유사 상태20,21,22,23으로 확장될 수 있다. 이 방법을 사용하여 HNE 브러쉬 생검을 처리하면 완전히 분화 할 수있는 능력을 유지하면서 더 높은 처리량으로 여러 응용 분야에서 사용할 수있는 많은 수의 상피 세포가 생성됩니다. 이 프로토콜이 피더 세포를 사용하여 개발되었지만, 피더 세포 기술(14,24)을 피하고자 하는 조사자들에 의해 다른 방법론들이 사용될 수 있다.

폐 생물학에 대한 기술의 중요성
중요한 연구는 상피 세포의 세포막에 규칙적이고 기능하는 CFTR이 없으면 폐, 췌장, 간, 장 또는 기타 조직에서 어떻게 기능 장애를 초래하는지 이해하는 데 전념했습니다. 기능 장애가있는 상피 이온 수송, 특히 염화물과 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피가 감소하고 점액 분비물의 변화를 일으켜 점액 정체 및 폐색으로 이어집니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 다른 기도 질환에서, 변경된 섬모 운동은 점액 클리어런스를 손상시키고 점액 정체 및 폐색(25)을 초래한다. 따라서, 현재의 HNE 오가노이드 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용을 위해 개발되고 있다. 여기에는 살아있는 세포 얼룩을 이용한 살아있는 세포 이미징이 포함됩니다. 형태학을 특성화하기 위한 고정 및 단면화; 항체로 면역 형광 염색 및 발광 내 구조를 파괴하는 것을 피하기 위해 전체 마운트 공초점 이미징; 및 섬모 비트 빈도 및 점액 수송의 정량적 측정을 위한 밝은 장 이미징 및 마이크로 광학 간섭 단층 촬영(13). 다른 조사자로의 확장을 용이하게 하기 위해, 상업적으로 이용가능한 시약 및 공급물을 배양에 사용하였다. 일반적인 현미경 기술과 더 전문화 된 장비를 사용하는 기능적 분석이 개발되었습니다. 전반적으로, 본 모델은 기준선에서 또는 치료제에 반응하여 CFTR 활성을 평가하도록 설계된 반면, 이 프로토콜에 기술된 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 수반하는 다른 질환에 적용될 수 있다.

다른 방법론과의 비교
최근에 이 오가노이드 모델의 유용성은 환자의 오가노이드의 시험관내 CFTR 조절제 반응을 그들의 임상 반응(11)과 상관관계에 의해 개발되었다. 특히, 본 모델이 동일한 환자에서 CFTR 기능을 평가하기 위한 현재의 황금 표준인 단락 전류 반응을 병렬화했다는 것도 입증되었다. 단락 전류는 전자가 이온 수송(26)을 통해 CFTR 기능을 측정하기 때문에 팽윤 분석과 다르다. 대조적으로, 이 분석은 유체 수송을 통한 더 많은 다운스트림 효과를 측정하여, CFTR 27,28,29,30,31,32의 전체 기능에 대한 추가 정보를 제공한다. 단락 전류 측정은 CFTR 염화물 채널 활성 1,33을 결정하기 위한 일반적이고 신뢰할 수 있는 방법임이 계속되고 있다. 이러한 전기생리학적 분석은 전문화되고 값비싼 장비가 필요하며, 오가노이드 분석법보다 각 실험 복제에 대해 몇 배 더 많은 세포를 필요로 하며, 쉽게 자동화할 수 없으며, 더 높은 처리량 애플리케이션을 위해 확장이 불가능하다. 장 상피로부터 유래된 또 다른 오가노이드 모델은 보다 우수한 복제 능력과 같은 추가적인 이점 15,16,17,18을 갖지만, 기도 조직으로부터 유래되거나 보편적으로 이용가능하지 않다. HNE 칫솔질은 진정 작용이 필요없고 최소한의 위험으로 저렴한 세포학 브러시로 얻을 수 있습니다. 양치질을 얻는 것은 임상의가 필요하지 않으며 훈련 된 연구 코디네이터 및 다른 연구 직원(14)에 의해 수행 될 수있다. HNE 오가노이드 모델은 일차 세포 배양 능력을 가진 모든 실험실에서 배양할 수 있으며, 일부 용도는 표준 현미경 기술로 수행할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 장점은 일부 실험실에서 사용할 수없는 기도 상피 기능을 평가하기위한 기술에 대한 추가 액세스를 제공합니다. 또한, HNE 오가노이드는 장내 오가노이드가 할 수 없는 원발성 섬모 운동이상증25 또는 바이러스 감염과 같이 기도에 영향을 미치는 다른 질병 상태를 연구하는데 이용될 수 있다.

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프로토콜

HNE 샘플은 앨라배마 어린이 병원에서 수집되었습니다. 여기에 설명 된 모든 절차와 방법은 버밍엄의 IRB 앨라배마 대학교 (UAB IRB # 151030001)의 승인을 받았습니다. 인간 비강 상피 세포 (HNEs)의 확장을 촉진하고 기능을 향상시키기 위해, 본 배양 방법은 잘 알려진 공기-액체 계면 (ALI) 배양 방법28,34로부터 적응된다. HNEs는 이전에 기술된 바와 같이 브러시 생검에 의해 초기에 수집되었고,12,14, 유일한 차이점은 세포학 브러쉬의 사용이었다. 모든 시료 처리 단계 및 세포 배양은 생물안전 캐비닛에서 수행되었다.

1. 세포 배양 및 비강 상피 세포의 확장

  1. 양치 후, 비강 생검 샘플을 얼음 위의 15 mL 원뿔형 튜브에 RPMI 배지 8 mL에 보관하고 4 시간 이내에 실험실로 옮깁니다 (24 시간 이하).
  2. 비강 브러쉬 생검을 15 mL 원뿔형 튜브에서 8 mL의 RPMI 배지 내로 해리시키고, 브러쉬가 조직을 맑게 할 때까지 1 mL의 큰 보어 피펫 팁(팁을 잘라내기)을 통해 세포학 브러쉬를 여러 번 통과시킨다.
  3. 세포를 4°C에서 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하고, 상층액을 제거한 다음, 세포 펠릿을 3 mL의 세포 분리 용액( 표 표 참조)에 재현탁시키고, 실온에서 16분 동안 인큐베이션하여 소화시킨다.
  4. 5 mL의 확장 배지 (표 1)를 사용하여 세포를 두 번 세척하십시오. 이어서, 조사되고 불활성화된 3T3 섬유아세포22 (50%-60% 합류)로 미리 시딩된 T75 플라스크에 세포를 첨가하여 세포를 공동배양하고 7-14일 동안 팽창 배지에서 팽창시킨다 (적절한 콜로니에 대해서는 도 1 참조). 사용하기 전에 조사된 3T3 섬유아세포가 증식할 수 없도록 테스트하여 상피 세포 확장에 부정적인 영향을 미칩니다.
    참고: 비강 상피 세포 합류가 14일 이내에 70%에 도달하지 못하면 세포를 폐기하십시오.
  5. CF 환자에서 유래 한 세포의 경우 네 가지 항생제 (토브라마이신 100 μg / mL, 암포테리신 B 2.5 μg / mL, 세프 타지딤 100 μg / mL, 반코마이신 100 μg / mL, 물질 표 참조)를 배양 첫 3 일 동안 세포를 소독하기 위해 확장 배지에 넣은 다음 2 일마다 배지를 교체하는 항생제가없는 확장 배지로 교체하십시오.
    참고: 이 제한된 항생제 사용은 박테리아 콜로니화로 인한 배양 손실을 줄이면서 추가 항생제가 제거된 후 증식을 촉진하기 위한 것입니다. 이러한 항생제는 필요한 경우 민감성과 함께 환자의 특정 미생물학 결과에 맞게 조정할 수 있습니다.
  6. 이중 트립신화 방법22 를 사용하여 공동 배양물로부터 HNEs를 수확하여 일단 세포가 대략 80% 합류에 도달하면. 이 방법은 조사되고 비활성화 된 3T3 섬유 아세포가 플라스크에서 제거되고 후속 오가노이드 시딩을 오염시키지 않도록합니다.
    1. 세포를 1x DPBS로 세척하고, T75 플라스크에 0.05% 트립신-EDTA 1.5 mL를 첨가한 후 37°C에서 4분 동안 조사하여 불활성화된 3T3 섬유아세포를 배양물로부터 제거하였다.
    2. T75 플라스크를 1x DPBS로 두 번 헹구어 나머지 3T3 섬유아세포를 완전히 씻어내십시오. 1.5 mL의 0.05% 트립신-EDTA를 T75 플라스크에 첨가하여 37°C에서 10분 동안 HNEs를 분리한다.
    3. 트립신을 대두 트립신 억제제 ( 물질 표 참조)로 1:1 비율로 중화시킨다. 세포를 5분 동안 500 x g 에서 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다. 세포를 5 mL의 확장 배지로 한 번 세척한 후, 세포는 오가노이드를 성장시키기 위해 시딩할 준비가 된다.
      참고: 통과 번호가 세 개인 HNE는 추가 실험에 사용하는 것이 좋습니다.

2. 슬라이드와 배양 인서트에서 오가노이드의 성장과 분화

  1. 오가노이드 배양물을 세포외 매트릭스 (ECM)를 4°C에서 하룻밤 동안 해동시킨다. 피펫 팁을 4°C로 냉각시키고 4°C에서 하룻밤 동안 15-웰 혈관신생 슬라이드( 재료표 참조)를 한다.
    참고: ECM은 세포 수확이 완료되기 전날 밤 4°C에서 두어야 한다.
  2. 슬라이드를 5 μL의 차가운 100% ECM으로 얼음 상(15-웰 슬라이드의 각 웰에 차가운 피펫 팁이 있는 차가운 100% ECM의 피펫 5 μL)로 코팅한 다음, 이를 통합시키기 위해 적어도 30분 동안 37°C에서 세포 배양 인큐베이터에 넣는다.
  3. 혈구세포계를 사용하여 공동 배양에서 수확한 HNEs를 계수하고 얼음 위에서 분화 배지에 의해 희석된 20% ECM으로 총 수의 500 세포/μL로 세포를 희석한다(표 2). 그런 다음 차가운 세포/ECM 혼합물 5μL를 ECM으로 코팅된 슬라이드의 각 웰에 시드합니다.
  4. 슬라이드를 즉시 37°C의 배양 인큐베이터로 1시간 동안 옮기어 세포/ECM 혼합물을 통합시킨다.
  5. 세포를 15-웰 혈관신생 슬라이드의 각 웰에 50 μL의 분화 배지로 공급한다. 오가노이드가 추가 실험을 위해 준비 될 때까지 격일로 미디어를 변경하십시오.
    참고 : 오가노이드는 일반적으로 1-2 일 후에 시각화 할 수 있습니다. 슬라이드의 각 웰에는 일반적으로 20-90 개의 오가노이드가 형성됩니다. 오가노이드는 전형적으로 37°C의 가습된 인큐베이터에 보관될 때 격일로 먹이를 주면서 ECM에서 40-60일 동안 생존할 수 있다.
  6. 아래에 언급된 단계에 따라 특정 용도(예: 조직학 또는 면역형광을 위한 절편화)를 위해 더 많은 양을 위해 배양 삽입 물(표 문헌 참조)에서 오가노이드를 배양한다.
    1. 배양 인서트에서 오가노이드를 성장시키기 위해, 단계 2.1-2.2에서 언급된 바와 같이 오가노이드 배양 ECM, 피펫 팁 및 인서트를 준비한다. 인서트를 100μL의 차가운 100% ECM으로 코팅합니다.
    2. 인서트의 ECM 코팅 위에 60 μL의 세포/ECM 혼합물(분화 매질에서 20% ECM을 갖는 500 세포/μL)을 시드한다.
      참고: 인서트에서 오가노이드를 만들기 위한 다른 모든 단계는 슬라이드에서 수행된 단계(2.4-2.5단계)와 동일합니다.
    3. 600 μL의 분화 배지를 삽입물의 바닥 부분에 첨가한다. 오가노이드가 실험에 사용될 때까지 매일 번갈아 가며 배지를 교체하십시오 (일반적으로 2-3 주).

3. 전체 탑재 면역형광을 위한 오가노이드의 제조 및 분리

  1. 오가노이드의 분리 및 고정
    1. 8-웰 유리 바닥 챔버 슬라이드를 셀 접착제( 재료 표 참조)로 30분 동안 전처리한 다음 참고문헌35. 용액을 버린 후 웰을 30 분 동안 공기 건조시킵니다.
    2. 오가노이드를 수확하기 위해, ECM의 상부로부터 배지를 제거한 다음, 50 μL의 차가운 1x PBS를 얼음 상의 15-웰 슬라이드의 각 웰에 첨가한다(ECM 부피로 1:1).
    3. 200 μL의 대형 보어 피펫 팁을 사용하여 3-5회 상하로 피펫을 상하로 하고, 이어서 용액을 8-웰 챔버 슬라이드의 웰의 중앙에 분배한다.
    4. 미세 팁 피펫으로 웰에서 과도한 액체를 즉시 제거하십시오. 이어서, 챔버 슬라이드를 37°C 인큐베이터에 넣고 40분 동안 유리 바닥에 부착하는 오가노이드를 강화시킨다.
    5. 1x PBS로 두 번 부드럽게 세척한 후, 오르가노이드를 실온에서 30분 동안 각 웰에 300 μL의 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다(RT).
    6. 1x PBS로 2회 세척하고, 오르가노이드를 최대 2주 동안 면역염색을 위해 4°C에서 1x PBS에 저장한다.
  2. 면역형광염색
    1. 자동 형광을 감소시키려면, 20 rpm에서 진탕기 상에서 부드럽게 진탕하면서 1x PBS 중의 250 mMNH4Cl을 30분 동안 RT에서 슬라이드의 각 웰에 첨가한다.
    2. 1x PBS로 두 번 세척한 후, 20 rpm에서 부드럽게 진탕하면서 RT에서 30분 동안 0.1% 트리톤 X-100으로 세포를 투과시켰다.
    3. 1x PBS로 두 번 세척한 후, 1x PBS에 5% BSA 및 0.1% 트리톤 X-100을 포함하는 블로킹 용액 300 μL를 첨가하고, RT에서 1시간 동안 각 웰에 넣었다.
    4. 세척 후, 일차 항체를 적절한 웰에 첨가한 다음, 이차 항체를 첨가 한다(물질 표 참조). 1x PBS에서 2% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100의 1차 및 2차 항체 용액을 준비한다. 모든 일차 항체를 4°C에서 2일 동안 인큐베이션하고, 모든 이차 항체를 4°C에서 1일 동안 인큐베이션한다.
      참고: 최종 농도는 실험에 원하는 단백질에 따라 달라집니다. 제조업체의 데이터 시트에서 재고 농도를 확인하십시오. 그런 다음, 물질 표에 사용된 희석액을 기준으로 최종 농도를 계산한다.
    5. 인큐베이션 후, 웰을 1x PBS로 깨끗이 세척하고, 핵 염색을 위해 각 웰에 DAPI를 2% BSA 및 0.3% 트리톤 X-100에 첨가한다.
    6. 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 20-60x 오일 침지 목표를 사용하여 오가노이드 를 이미지화하십시오 (재료 표 참조). Z-스택 모드를 사용하여 이미지의 상한과 하한을 설정하고 공초점 소프트웨어에 의해 결정된 권장 최적의 Z 단계 크기를 사용합니다.
      참고: 다음 네 개의 공초점 레이저 여기 파장이 사용되었습니다: 408.7 nm, 489.1 nm, 561.7 nm 및 637.9 nm.

4. 조직학적 절편화를 위한 오가노이드의 제조 및 분리

  1. 조직학적 연구를 위한 오가노이드를 수확하기 위해, 배양물로부터 배지를 제거하고 50 μL의 차가운 1x PBS를 얼음 위의 슬라이드의 각 웰에 첨가한다.
  2. 200 μL 대형 보어 피펫 팁을 사용하여 3 ~ 5회 상하로 피펫하고, 15-웰 슬라이드 또는 배양 인서트의 모든 용액을 얼음 위의 15 mL 원뿔형 튜브에 결합합니다. 추가의 차가운 1x PBS를 첨가하여 튜브 내의 총 용액 부피를 10 mL로 조정한다.
  3. 튜브를 4°C, 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하는 단계; 상청액을 흡인하고 60 μL의 따뜻한 히스토겔 ( 표 참조)을 첨가하여 200 μL의 큰 보어 피펫 팁을 사용하여 오가노이드 펠릿과 혼합한다.
  4. 즉시 현탁액을 조직학 주형으로 옮깁니다. 실온에서 히스토겔을 응고시킨 후, 몰드 블록을 4% 파라포름알데히드에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 고정시킨다.
  5. 파라핀에 임베딩한 후, 히스토겔 블록을 5 μm 단면(예: 마이크로톰)으로 절단하고, 절편을 유리 슬라이드 상에 고정하고, 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 또는 면역형광 표지된 항체를 사용하여 염색한다. 밝은 필드 현미경 또는 거꾸로 된 epi-fluorescence 현미경을 사용하여 이미지를 촬영 하십시오 (표 참조).

5. 살아있는 오가노이드의 이미징

참고: 다음 단계는 자동화된 이미징 시스템을 사용하여 수행됩니다( 재료 표 참조). 서로 다른 이미징 시스템은 특정 제조업체의 지침에 따라 이러한 단계를 조정해야 합니다. 활용되는 장비에 관계없이, 라이브 오가노이드를 이미징하려면CO2 가스 컨트롤러가 동반된 온도 제어 및 가습된 환경 챔버가 필요합니다.

  1. 기능적 팽윤 분석(36)을 수행하기 전에 오가노이드의 분화를 모니터링하기 위해, 아래에 설명된 바와 같이, 임의의 밝은 필드 현미경 또는 자동화된 이미징 시스템으로 수동으로 전체 슬라이드 이미지를 캡처한다.
    1. 자동 이미징 시스템 및 CO2/O2 가스 컨트롤러 에 전원을 켜고 시스템이 자동 교정(최대 30분)을 완료할 수 있도록 합니다.
    2. 완료 후 이미징 시스템 온도를 37°C로 설정합니다. 가습 저장소에 멸균수 15mL를 넣고,CO2 밸브를 열고, 뚜껑을 닫고, 이미징 시스템이 이미징 전에 최소 30분 동안 사전 인큐베이션되도록 합니다.
    3. 자동화된 이미징 소프트웨어를 열어 이미징을 위한 프로토콜을 설정하고 원시 실험 데이터를 저장할 위치를 선택합니다.
      참고: 이미징 시스템에 특정한 예제 프로토콜 파일(보충 파일 1)은 오가노이드 분화를 모니터링하기 위한 오가노이드의 자동 이미징을 위한 템플릿으로 제공되었다.
    4. 환경 설정이 충족되면 뚜껑이 있는 최대 두 개의 15웰 슬라이드를 자동 이미지 시스템의 슬라이드 홀더 인서트의 환경 챔버로 즉시 옮깁니다( 재료 표 참조).
    5. 이미징할 웰을 선택하고 이미징을 시작하여 원하는 웰의 이미징을 완료합니다.
      참고: 기본 권장 설정은 다음과 같습니다: 4x 및 10x 공기 목표, 밝은 필드 채널, 전체 우물 영역을 커버하는 4x 목표의 경우 2 x 2 몽타주, 10x 목표의 경우 4 x 4 몽타주. Z 스택 설정: Z-스택 슬라이스 세 개에서 여섯 개, Z 스텝 크기 = 50-100 μm, 자동 초점 포인트 아래의 슬라이스 하나-두 개, 위의 슬라이스 세 개에서 다섯 개까지.
  2. 포스콜린 유도 팽윤(FIS) 분석에 사용하기 위해 살아있는 오가노이드를 이미지화하려면 온도 및CO2 제어를 허용하는 환경 제어 이미징 챔버가 장착된 자동화 스테이지가 있는 현미경을 사용하십시오.
    1. 단계 5.1.1-5.1.4부터 시작하여 5.1.3단계의 프로토콜 파일을 FIS 분석을 수행하기 위한 특정 설정을 포함하는 예제 프로토콜 파일(보충 파일 2)에 제공된 것으로 대체합니다.
    2. 각 실험 전에 각 슬라이드에 대해 최소 세 개의 웰(맨 왼쪽, 중간 및 맨 오른쪽)을 평가하여 노출 설정을 조정합니다. X 및 Y 좌표 오프셋을 적용하여 목표가 모든 웰의 우물 중앙에 있는지 확인합니다.
      참고: 기본 권장 설정은 공기 목표 4배, 채널 1 = 밝은 필드, 채널 2 = DAPI, 2 x 2몽타주(이미지 타일 4개)입니다. Z 스택 설정: Z 스택 슬라이스 세 개에서 네 개, Z 스텝 크기 = 50-100μm, 자동 초점 포인트 아래 슬라이스 하나, 위의 슬라이스 두 개에서 세 개까지. 이미지 수집 시간: 20분 간격으로 8시간(총 판독값 = 25; 읽기 1은 T = 0)이다.
    3. 모든 설정이 적절하게 선택되면 두 슬라이드에 대해 이미지를 만들 웰을 선택하거나 모두를 선택하고 장비 지침에 따라 실행을 시작합니다.
    4. 실행 후, 실험을 저장하고, 이미징 소프트웨어를 닫고, 이미징 시스템(37)을 종료한다.

6. 기준선 루멘 측정

참고: 이 작업은 수동 이미징 분석 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다( 자료 표 참조). 유사한 방법론이 오픈 소스 소프트웨어(38 ) 또는 이미지 상의 영역의 영역을 측정할 수 있는 임의의 소프트웨어를 사용하여 뒤따를 수 있다.

  1. 소프트웨어에서 화면 하단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 측정을 선택한 다음 자동 측정 결과를 선택하여 자동 측정 패널을 엽니다. 측정된 각 관심 영역(ROI)의 영역이 거기에 나타납니다.
  2. 소프트웨어에서 오가노이드 이미지를 열고 보이는 루멘이있는 5-10 개의 오가노이드를 선택하십시오.
    참고: 루멘은 오가노이드의 중간에 있는 원형 영역으로, 나머지 오가노이드와 색상이 눈에 띄게 다릅니다(그림 2A).
  3. 다각형 ROI 측정 기능을 사용하여 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 메뉴를 열고 다각형 ROI 를 선택하여 전체 오가노이드의 윤곽을 그려 오가노이드의 총 표면적(TSA)을 얻습니다. 그런 다음 동일한 기능을 사용하여 루멘 영역(LA)을 윤곽을 그립니다(그림 2B).
  4. 웰 내의 나머지 오가노이드 및 분석에서 모든 웰에 대해 반복한다.
  5. 데이터를 내보내 Excel로 내보냅니다. LA를 TSA로 나누고 샘플로부터의 모든 오가노이드를 평균화하여 기준선 루멘 비(BLR)11,13을 얻는다.
    참고 : 일반적으로 비 CF 오가노이드의 ~ 87 %는 0.6 이상의 BLR을 가지며 97 %는 0.5 이상이며 CF 오가노이드의 14 %만이 0.6 이상의 BLR을 가지며 31 %는 0.5 이상입니다.

7. HNE 오가노이드의 전처리 및 자동 이미징

참고 : 모든 전처리 단계는 깨끗한 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. 단계 7.1 이전에 분석을 기록하기 위한 자동화된 이미징 시스템 및 소프트웨어를 미리 설정한다. DAPI를 사용한 인큐베이션은 선택 사항이지만 밝은 필드 이미지의 품질이 저하되는 경우 페일 세이프로 권장됩니다. 이 경우, DAPI 채널(377nm)이 대신 분석될 수 있다.

  1. 예비-오가노이드를 15°C 인큐베이터에서 1시간 동안 37°C 인큐베이터에서 100 μM의 CFTRinh-172 유무에 관계없이 DAPI를 함유하는 분화 배지 50 μL와 함께 15-웰 슬라이드 의 웰에서 인큐베이션한다. 오가노이드가 인큐베이션되는 동안, 보충 파일 2에 이어 팽윤 분석 사용자 정의 프로토콜을 사용하여 단계 5.2.1을 수행한다.
  2. 흡인으로 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 예비 인큐베이션 배지를 제거한다. 10 μM의 포스콜린 및 100 μM의 IBMX (자극 칵테일) ( 표 참조)를 50 μL의 총 부피의 분화 매질을 각 웰에 첨가한다.
    참고: 우물에 거품이 생기지 않았는지 확인하십시오. 이미지의 거품은 자동 분석에 영향을 미칩니다.
  3. 지체 없이, 단계 5.2.2 내지 5.2.4에 이어서 FIS 이미징 프로토콜을 시작한다. 각 웰에서 20분마다 이미지를 획득하고 총 런타임은 8시간입니다.

8. HNE 오가노이드에 대한 포스콜린 유도 부종 분석의 자동화 분석

  1. 자동화된 이미징 분석 소프트웨어를 열고 7.3단계에서 이전에 저장한 실험을 찾은 다음 실험 이미지를 불러옵니다.
  2. 평가할 용기 창을 선택하고 스티칭되고 z-투영된 처리된 이미지를 포함하는 옵션을 선택합니다. 이 단계는 마스킹 평가 및 측정을 위해 이미징 프레임 내의 모든 오가노이드와 함께 전체 우물의 사진을 제공해야합니다.
  3. 평가할 이미지를 선택하십시오. 분석을 선택합니다. 자동화된 측정에 포함된 모든 이미지에 대해 적절한 마스킹을 보장하기 위해 다른 이미지에 대해 이 과정을 반복합니다. 설정 매개 변수를 저장합니다.
  4. 분석 설정을 완료한 후 변경 내용을 적용합니다. 소프트웨어는 설정에 따라 측정을 변경합니다.
    참고: 초기 이미지 전처리가 완료된 후에는 일관된 마스킹을 보장하기 위해 품질 관리(QC) 조치를 수행해야 합니다. 여기에는 오가노이드가 이미징 프레임 내에 있는지, 거품이나 파편이 부적절하게 마스킹되지 않았는지 확인하기 위해 모든 웰을 수동으로 검토하고, 밝은 필드 및 DAPI 채널에서 마스킹을 확인하는 것이 포함됩니다.
  5. 요약 분석(그래프 및 통계 분석 포함)을 위해 데이터를 내보냅니다.

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결과

HNEs 확장은 번성하는 오가노이드 배양에 필수적입니다. 성공적인 샘플 수집의 HNE는 약 10 일 동안 70 % 이상의 합류로 확장되어야합니다. 성공한 샘플과 실패한 샘플의 예는 각각 그림 1A 및 그림 1B에 나와 있습니다. 조사된 3T3 세포와 공동 배양한 후 14일까지 70% 합류에 도달할 수 없는 경우 세포를 폐기해야 한다. 오염된 모든 세포는 추가적?...

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토론

이 원고는 HNE 브러시 생검에서 유래 된기도 상피 오가노이드의 포괄적 인 라이브 및 고정 이미징을위한 상세한 방법론을 제공합니다. 그것은 개체에서 CFTR 활성을 결정할 수있는 기능적 분석을 설명합니다. HNE는 다양한 용도를 위한 최소 침습성 일차 조직을 제공합니다. 여기에 제공된 확장 기술은 오가노이드를 포함한 기도 질환을 모델링하는 데 사용될 수 있습니다. 오가노이드는 정밀한 치료 ?...

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공개

JSG는 유사한 모델을 설명하는 노스 캐롤라이나 대학의 특허 출원 20170242033에 발명가로 등록되어 있습니다. UNC의 라이센스 기술이 로열티를 생산할 때, 발명가는 수익의 몫을 받는다. 그렇지 않으면 저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다. 기금 제공자는 연구의 설계, 데이터 수집, 분석 또는 해석, 원고 작성 또는 결과 발표 결정에 아무런 역할을하지 못했습니다.

감사의 말

우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 HNE 브러시 생검을 기증 한 모든 참가자의 기여에 감사드립니다. 연구 자원 봉사자 모집 및 샘플 수집을 조정해 주신 Latona Kersh와 Children's Research Unit 직원에게 감사드립니다. 릴리 덩, 조나단 베일리, 그리고 우리 실험실의 전 연수생이었던 스티븐 맥케이에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 Zhong Liu와 Rui Zhao에게 기술적 인 도움을 주셔서 감사합니다. UAB의 CF 연구 센터 책임자 인 Steven M. Rowe는 리더십과 자원을 제공하며,이 없이는 이러한 작업이 불가능합니다. 또한 Biotek의 Sarah Guadiana에게 계측기 훈련 지원을 해준 Sarah Guadiana, UAB 고해상도 이미징 시설에서 공초점 현미경 검사 지원을 해준 Robert Grabski, UAB Histology Core에서 조직학적 지원을 해준 Dezhi Wang에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. 그랜트 K23HL143167 (JSG에), 낭포성 섬유증 재단 (CFF) 그랜트 GUIMBE18A0-Q (JSG에), 그레고리 플레밍 제임스 낭포성 섬유증 센터 [NIH 그랜트 R35HL135816 및 DK072482 및 버밍엄 앨라배마 CFF 대학 (UAB) 연구 개발 프로그램 (Rowe19RO)], UAB 임상 및 번역 과학 센터 (NIH 그랜트 UL1TR001417).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Nasal brushMedical Packaging CYB1CYB-1Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette TipsThermoFisher Scientific02-707-141Large bore pipette tips
AccutaseThermoFisher ScientificA1110501Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTAGibco25300-054
Trypsin inhibitor from soybeanSigmaT6522Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrixCorning356255Extracellular matrix (EM)
µ-Slide AngiogenesisIbidi8150615-well slide
24-Well TranswellCorning7200154Culture insert
Chambered CoverglassThermoFisher Scientific1554098-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveThermoFisher Scientific354240Cell adhesive
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences50980487
Triton X-100Alfa AesarA16046
BSAThermoFisher ScientificBP1600-100
NucBlueThermoFisher ScientificR37605DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)NikonInverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25NikonConfocal microscope
NIS Elements- Basic ResearchNikonmanual imaging analysis software
HistogelThermoFisher ScientificHG-4000-012
Disposable Base MoldsThermoFisher Scientific41-740
Lionheart FXBioTekBTLFXAutomated image system
Lionheart CoverBioTekBT1450009Environmental Control Lid
Humidity ChamberBioTekBT1450006Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2BioTekBT1210013Gas controller
Microplate/Slide Stage InsertBioTekBT1450527Slide holder
Gen5 Imaging Prime SoftwareBioTekBTGEN5IPRIMAutomated imaging analysis software
4x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320515
10x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320516
LED CubeBioTekBT1225007
Filter Cube (DAPI)BioTekBT1225100DAPI
CFTRinh-172Selleck ChemicalsS7139
ForskolinSigmaF6886
IBMXSigmaI5879
Expansion Media
DMEMThermoFisher Scientific11965
F12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765
Fetal Bovine SerumThermoFisher Scientific 16140-071
Penicillin/StreptomycinThermoFisher Scientific 15-140-122
Cholera ToxinSigma C8052
Epidermal Growth Factor (EGF)ThermoFisher Scientific PHG0314
Hydrocortisone (HC)Sigma H0888
InsulinSigma I9278
AdenineSigma A2786
Y-27632Stemgent 04-0012-02
Antibiotic Media
CeftazidimeAlfa Aesar J66460-03
TobramycinAlfa Aesar J67340
VancomycinAlfa Aesar J67251
Amphotericin BSigma A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1)ThermoFisher Scientific 11330-32
Ultroser-GPall 15950-017
Fetal Clone IIHyclone SH30066.03
Bovine Brain ExtractLonza CC-4098
InsulinSigma I-9278
HydrocortisoneSigma H-0888
TriiodothyronineSigma T-6397
TransferrinSigma T-0665
EthanolamineSigma E-0135
EpinephrineSigmaE-4250
O-PhosphorylethanolamineSigmaP-0503
Retinoic AcidSigmaR-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibodyR&D SystemsMAB1660Dilution: 100x
ZO-1 antibodyThermo FisherMA3-39100-A647Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibodySigmaHPA008246Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulinSigmaT7451Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibodyAbcamAb11315Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA21202Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594InvitrogenA21207Dilution: 2000x

참고문헌

  1. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  2. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).
  3. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
  4. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
  5. Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
  6. Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
  7. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  8. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  9. Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
  10. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
  11. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  12. Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
  13. Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
  14. Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112(2013).
  16. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  17. Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
  18. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  19. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  20. Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  23. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
  24. Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  25. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3(2017).
  26. Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
  27. Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
  28. Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
  29. Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
  30. Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
  31. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473(2013).
  32. Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253(2014).
  33. McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062(2020).
  34. Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
  35. Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
  36. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  37. Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
  38. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  39. Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
  40. McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
  41. Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).

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