Culture et imagerie des organoïdes épithéliaux nasaux humains

Résumé

Un protocole détaillé est présenté ici pour décrire un modèle organoïde in vitro à partir de cellules épithéliales nasales humaines. Le protocole propose des options pour les mesures nécessitant un équipement de laboratoire standard, avec des possibilités supplémentaires pour l’équipement et les logiciels spécialisés.

Résumé

Un traitement individualisé pour les patients atteints de mucoviscidose (FK) peut être réalisé avec un modèle de maladie in vitro pour comprendre l’activité de base du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (CFTR) et la restauration à partir de composés de petites molécules. Notre groupe s’est récemment concentré sur l’établissement d’un modèle organoïde bien différencié directement dérivé des cellules épithéliales nasales humaines primaires (HNE). L’histologie des organoïdes sectionnés, la coloration immunofluorescente à monture entière et l’imagerie (à l’aide de la microscopie confocale, de la microscopie immunofluorescente et du champ lumineux) sont essentielles pour caractériser les organoïdes et confirmer la différenciation épithéliale en préparation des essais fonctionnels. De plus, les organoïdes HNE produisent des lumens de différentes tailles qui sont en corrélation avec l’activité CFTR, en distinguant les organoïdes CF et non CF. Dans ce manuscrit, la méthodologie de culture des organoïdes HNE est décrite en détail, en se concentrant sur l’évaluation de la différenciation à l’aide des modalités d’imagerie, y compris la mesure de la zone lumineuse de base (une méthode de mesure de l’activité CFTR dans les organoïdes que tout laboratoire avec un microscope peut utiliser) ainsi que l’approche automatisée développée pour un test fonctionnel (qui nécessite un équipement plus spécialisé).

Introduction

Introduction à la technique
Les tests basés sur la culture ex vivo sont un outil de plus en plus utilisé pour la médecine de précision et l’étude de la physiopathologie des maladies. La culture épithéliale nasale humaine primaire (HNE) a été utilisée dans de nombreuses études sur la fibrose kystique 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 <....

Protocole

Des échantillons de HNE ont été prélevés à l’hôpital Children’s of Alabama. Toutes les procédures et méthodes décrites ici ont été approuvées par l’IRB University of Alabama à Birmingham (UAB IRB #151030001). Pour faciliter l’expansion et améliorer la fonction des cellules épithéliales nasales humaines (HNE), les méthodes de culture actuelles sont adaptées de la méthode de culture bien connue de l’interface air-liquide (ALI)^28,34. Les HNE ont d’abord été prélevés par biopsie au pinceau comme décrit précédemment^12,14, la seule différence étant l’utilisa....

Résultats

L’expansion des HNE est essentielle à une culture organoïde florissante. Les HNE d’une collecte d’échantillons réussie devraient s’étendre à plus de 70% de confluence vers 10 jours. Un exemple d’échantillons réussis et infructueux est illustré à la figure 1A et à la figure 1B, respectivement. Les cellules doivent être jetées si elles ne peuvent pas atteindre 70% de confluence 14 jours après la co-culture avec des cellules.......

Discussion

Ce manuscrit fournit des méthodologies détaillées pour l’imagerie complète en direct et fixe des organoïdes épithéliaux des voies respiratoires dérivés de la biopsie par brosse HNE. Il décrit les tests fonctionnels qui peuvent déterminer l’activité CFTR chez un individu. Les HNE fournissent un tissu primaire peu invasif pour une variété d’applications. Les techniques d’expansion proposées ici peuvent être utilisées pour modéliser les maladies des voies respiratoires, y compris les organoïdes. L.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nasal brush	Medical Packaging CYB1	CYB-1	Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette Tips	ThermoFisher Scientific	02-707-141	Large bore pipette tips
Accutase	ThermoFisher Scientific	A1110501	Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTA	Gibco	25300-054
Trypsin inhibitor from soybean	Sigma	T6522	Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrix	Corning	356255	Extracellular matrix (EM)
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81506	15-well slide
24-Well Transwell	Corning	7200154	Culture insert
Chambered Coverglass	ThermoFisher Scientific	155409	8-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive	ThermoFisher Scientific	354240	Cell adhesive
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50980487
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
BSA	ThermoFisher Scientific	BP1600-100
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)	Nikon		Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25	Nikon		Confocal microscope
NIS Elements- Basic Research	Nikon		manual imaging analysis software
Histogel	ThermoFisher Scientific	HG-4000-012
Disposable Base Molds	ThermoFisher Scientific	41-740
Lionheart FX	BioTek	BTLFX	Automated image system
Lionheart Cover	BioTek	BT1450009	Environmental Control Lid
Humidity Chamber	BioTek	BT1450006	Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2	BioTek	BT1210013	Gas controller
Microplate/Slide Stage Insert	BioTek	BT1450527	Slide holder
Gen5 Imaging Prime Software	BioTek	BTGEN5IPRIM	Automated imaging analysis software
4x Phase Contrast Objective	BioTek	BT1320515
10x Phase Contrast Objective	BioTek	BT1320516
LED Cube	BioTek	BT1225007
Filter Cube (DAPI)	BioTek	BT1225100	DAPI
CFTRinh-172	Selleck Chemicals	S7139
Forskolin	Sigma	F6886
IBMX	Sigma	I5879
Expansion Media
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965
F12 Nutrient mix	ThermoFisher Scientific	11765
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	16140-071
Penicillin/Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15-140-122
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Epidermal Growth Factor (EGF)	ThermoFisher Scientific	PHG0314
Hydrocortisone (HC)	Sigma	H0888
Insulin	Sigma	I9278
Adenine	Sigma	A2786
Y-27632	Stemgent	04-0012-02
Antibiotic Media
Ceftazidime	Alfa Aesar	J66460-03
Tobramycin	Alfa Aesar	J67340
Vancomycin	Alfa Aesar	J67251
Amphotericin B	Sigma	A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1)	ThermoFisher Scientific	11330-32
Ultroser-G	Pall	15950-017
Fetal Clone II	Hyclone	SH30066.03
Bovine Brain Extract	Lonza	CC-4098
Insulin	Sigma	I-9278
Hydrocortisone	Sigma	H-0888
Triiodothyronine	Sigma	T-6397
Transferrin	Sigma	T-0665
Ethanolamine	Sigma	E-0135
Epinephrine	Sigma	E-4250
O-Phosphorylethanolamine	Sigma	P-0503
Retinoic Acid	Sigma	R-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibody	R&D Systems	MAB1660	Dilution: 100x
ZO-1 antibody	Thermo Fisher	MA3-39100-A647	Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibody	Sigma	HPA008246	Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulin	Sigma	T7451	Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibody	Abcam	Ab11315	Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21202	Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594	Invitrogen	A21207	Dilution: 2000x