JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada insan burun epitel hücrelerinden in vitro organoid modeli tanımlamak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Protokol, standart laboratuvar ekipmanı gerektiren ölçümler için seçeneklere ve özel ekipman ve yazılımlar için ek olanaklara sahiptir.

Özet

Kistik fibrozis (KF) hastaları için bireyselleştirilmiş tedavi, küçük moleküllü bileşiklerden temel Kistik Fibrozis Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini ve restorasyonunu anlamak için in vitro bir hastalık modeli ile sağlanabilir. Grubumuz son zamanlarda doğrudan birincil insan burun epitel hücrelerinden (HNE) türetilen iyi diferansiye bir organoid model oluşturmaya odaklandı. Kesitli organoidlerin histolojisi, tam montajlı immünofloresan boyama ve görüntüleme (konfokal mikroskopi, immünofloresan mikroskopi ve parlak alan kullanılarak), organoidleri karakterize etmek ve fonksiyonel testlere hazırlanırken epitel farklılaşmasını doğrulamak için gereklidir. Ayrıca, HNE organoidleri, CF ve CF olmayan organoidler arasında ayrım yaparak, CFTR aktivitesi ile ilişkili farklı boyutlarda lümenler üretir. Bu makalede, HNE organoidlerinin kültürlenmesi için metodoloji, bazal lümen alanının ölçümü (mikroskoplu herhangi bir laboratuvarın kullanabileceği organoidlerde CFTR aktivitesi ölçümü yöntemi) ve fonksiyonel bir tahlil için geliştirilmiş otomatik yaklaşım (daha özel ekipman gerektiren) dahil olmak üzere görüntüleme modaliteleri kullanılarak farklılaşmanın değerlendirilmesine odaklanarak ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Giriş

Tekniğe giriş
Ex vivo kültür temelli tahliller, hassas tıp ve hastalık patofizyolojisinin incelenmesi için giderek daha fazla kullanılan bir araçtır. Primer insan nazal epitel (HNE) hücre kültürü, kistik fibroz 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ile ilgili çok sayıda çalışmada kullanılmıştır. , birden fazla organda epitel hücre fonksiyonunu etkileyen otozomal resesif geçişli bir hastalıktır. HNE kültürü, prospektif olarak elde edilebilen yenilenebilir bir hava yolu epitelisi kaynağı sağlar ve Kistik Fibroz Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) aktivitesini test etmek için elektrofizyolojik ve biyokimyasal nitelikleri özetler. HNE hücreleri, yaygın viral solunum yolu çubuklarına benzer şekilde minimal yan etki14 ile örneklenebilir. HNE fırça biyopsilerinden türetilen kistik fibroz çalışması için bir model tanımlayan araştırma çalışması yakın zamanda yayınlanmıştır11,13. Primer HNE 2,3 ve bağırsak dokusu 15,16,17,18,19 kullanan diğer modellere benzer olmakla birlikte, bu modelin farklılaşmasının ve görüntülenmesinin ayrıntılı karakterizasyonu, KF araştırmalarında kullanılmak ve diğer hava yolu hastalıklarının çalışmalarına yardımcı olmak için burada açıklanmıştır 13 . Organoid model, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları gibi sınırsız değildir, ancak koşullu yeniden programlama (ışınlanmış ve inaktive edilmiş besleyici fibroblastlar ve Rho-kinaz inhibitörleri kullanılarak) ile daha kök hücre benzeri bir durumagenişletilebilir 20,21,22,23. HNE fırça biyopsilerinin bu yöntem kullanılarak işlenmesi, birden fazla uygulamada kullanılmak üzere çok sayıda epitel hücresinin daha yüksek verimde olmasını sağlarken, yine de tam olarak ayırt etme yeteneğini korur. Bu protokol besleyici hücreler kullanılarak geliştirilmiş olsa da, besleyici hücre teknolojisinden kaçınmak isteyen araştırmacılar tarafından başka metodolojiler de kullanılabilir14,24.

Tekniğin pulmoner biyolojideki önemi
Epitel hücrelerinin hücre zarında düzenli, işleyen CFTR'nin yokluğunun akciğerlerde, pankreasta, karaciğerde, bağırsakta veya diğer dokularda nasıl işlev bozukluğuna neden olduğunu anlamak için önemli bir çalışma yapılmıştır. Disfonksiyonel epitel iyon transportu, özellikle klorür ve bikarbonat, epitel astar sıvılarının hacminin azalmasına ve mukoza sekresyonlarında değişikliklere neden olarak mukoza stazı ve tıkanıklığına neden olur. Primer siliyer diskinezi gibi diğer hava yolu hastalıklarında, değişmiş siliyer hareket mukosiliyer klirensi bozar ve mukoza stazı ve obstrüksiyona yol açar25. Bu nedenle, mevcut HNE organoid modeli, araştırmacının deneysel tasarımına ve kaynaklarına bağlı olarak çeşitli uygulamalar için geliştirilmiştir. Bu, canlı hücre boyaları kullanarak canlı hücre görüntülemeyi içerir; morfolojiyi karakterize etmek için sabitleme ve bölümleme; intraluminal yapıların bozulmasını önlemek için antikorlarla immünofloresan boyama ve tam montajlı konfokal görüntüleme; siliyer atım sıklığı ve mukosiliyer transportun kantitatif ölçümleri için parlak alan görüntüleme ve mikro-optik koherens tomografi13. Diğer araştırmacılara genişlemeyi kolaylaştırmak için, ticari olarak temin edilebilen reaktifler ve malzemeler kültürleme için kullanılmıştır. Ortak mikroskop teknikleri ve daha özel ekipman kullanan fonksiyonel bir tahlil geliştirilmiştir. Genel olarak, mevcut model CFTR aktivitesini başlangıçta veya terapötiklere yanıt olarak değerlendirmek için tasarlanmış olsa da, bu protokolde açıklanan teknikler epitel hücre fonksiyonunu içeren diğer hastalıklara, özellikle epitel hücre sıvısı taşınımına uygulanabilir.

Diğer metodolojilerle karşılaştırma
Son zamanlarda bu organoid modelin yararlılığı, hastaların organoidlerinin in vitro CFTR modülatör yanıtlarını klinik yanıtlarıyla ilişkilendirerek geliştirilmiştir11. Özellikle, mevcut modelin aynı hastalarda CFTR fonksiyonunu değerlendirmek için mevcut altın standart olan kısa devre akım tepkilerine paralel olduğu da gösterilmiştir. Kısa devre akımı, şişme tahlilinden farklıdır, çünkü birincisi, iyon taşıma26 yoluyla CFTR fonksiyonunu ölçer. Buna karşılık, bu tahlil sıvı taşınması ile daha aşağı yönlü bir etkiyi ölçer ve CFTR27,28,29,30,31,32'nin genel işlevi hakkında ek bilgi sağlar. Kısa devre akım ölçümleri, CFTR klorür kanal aktivitesini belirlemek için yaygın ve güvenilir bir yöntem olmaya devam etmiştir 1,33. Bu elektrofizyolojik analizler özel, pahalı ekipman gerektirir, her deneysel kopya için organoid testten çok daha fazla hücre gerektirir, kolayca otomatikleştirilemez ve daha yüksek verim uygulamaları için ölçeklendirmeye uygun değildir. Bağırsak epitelinden türetilen başka bir organoid model, daha mükemmel replikatif yetenek gibi ek avantajlara sahiptir 15,16,17,18, ancak ne bir hava yolu dokusundan türetilir ne de evrensel olarak mevcuttur. HNE fırçalamaları, ucuz sitoloji fırçaları ile sedasyona gerek kalmadan ve minimum risk altında elde edilir. Fırçalama yaptırmak bir klinisyen gerektirmez ve eğitimli araştırma koordinatörleri ve diğer araştırma personeli tarafından yapılabilir14. HNE organoid modeli, primer hücre kültürü yeteneklerine sahip herhangi bir laboratuvar tarafından kültürlenebilir ve bazı uygulamalar standart mikroskopi teknikleri ile gerçekleştirilebilir. Toplamda, bu avantajlar, aksi takdirde bazı laboratuvarlarda kullanılamayan hava yolu epitel fonksiyonunu değerlendirmek için teknolojiye ek erişim sağlar. Ayrıca, HNE organoidleri, bağırsak organoidlerinin yapamayacağı primer siliyer diskinezi25 veya viral enfeksiyon gibi hava yolunu etkileyen diğer hastalık durumlarını incelemek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

HNE örnekleri Alabama Çocuk Hastanesi'nde toplandı. Burada açıklanan tüm prosedürler ve yöntemler Birmingham'daki IRB Alabama Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (UAB IRB #151030001). İnsan burun epitel hücrelerinin (HNE) genişlemesini kolaylaştırmak ve işlevini iyileştirmek için, mevcut kültürleme yöntemleri, iyi bilinen hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür yöntemi 28,34'ten uyarlanmıştır. HNE'ler başlangıçta daha önce tarif edildiği gibi fırça biyopsisi ile toplandı12,14, tek fark bir sitoloji fırçasının kullanılmasıydı. Tüm numune işleme adımları ve hücre kültürü biyogüvenlik kabininde gerçekleştirildi.

1. Hücre kültürü ve nazal epitel hücrelerinin genişlemesi

  1. Fırçaladıktan sonra, burun biyopsisi örneğini buz üzerinde 15 mL'lik bir konik tüpte 8 mL RPMI ortamında saklayın ve 4 saat içinde (en fazla 24 saat) laboratuvara aktarın.
  2. Burun fırçası biyopsisini, sitoloji fırçasını 1 mL büyük delikli pipet ucundan (ucu kesin) fırça dokudan temizlenene kadar birkaç kez geçirerek 15 mL'lik bir konik tüp içinde 8 mL RPMI ortamına ayırın.
  3. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj edin, süpernatanı çıkarın ve ardından hücre peletini 3 mL hücre ayrılma çözeltisi içinde yeniden askıya alın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve sindirmek için 16 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  4. Hücreleri iki kez yıkamak için 5 mL genleşme ortamı kullanın (Tablo 1). Daha sonra, hücreleri birlikte kültürlemek ve 7-14 gün boyunca genleşme ortamında genişlemek için ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastları22 (% 50 -% 60 birleşim) ile önceden tohumlanmış bir T75 şişesine hücreler ekleyin (uygun koloni için Şekil 1'e bakınız). Kullanmadan önce, ışınlanmış 3T3 fibroblastları, epitel hücresi genişlemesini olumsuz yönde etkileyecek şekilde çoğalmadıklarından emin olmak için test edin.
    NOT: Nazal epitel hücre birleşimi 14 gün içinde% 70'e ulaşmazsa hücreleri atın.
  5. KF'li hastalardan türetilen hücreler için, kültürün ilk 3 günü boyunca hücrelerin dezenfeksiyonu için genleşme ortamına dört antibiyotik (100 μg / mL tobramisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B, 100 μg / mL seftazidim, 100 μg / mL vankomisin, bakınız Malzeme Tablosu) uygulayın ve daha sonra medyayı her 2 günde bir değiştiren antibiyotiksiz genleşme ortamı ile değiştirin.
    NOT: Bu sınırlı antibiyotik kullanımı, bakteriyel kolonizasyona bağlı kültür kaybını azaltmayı ve ek antibiyotikler çıkarıldıktan sonra proliferasyonu teşvik etmeyi amaçlamaktadır. Bu antibiyotikler, gerekirse hassasiyetlerle hastanın spesifik mikrobiyoloji sonuçlarına göre uyarlanabilir.
  6. Hücreler yaklaşık% 80 birleşime ulaştığında çift tripsinizasyon yöntemi22'yi kullanarak ortak kültürden HNE'leri toplayın. Bu yöntem, ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastlarının şişeden çıkarılmasını ve sonraki organoid tohumlamayı kirletmemelerini sağlar.
    1. Hücreleri 1x DPBS ile yıkayın ve daha sonra ışınlanmış ve inaktive edilmiş 3T3 fibroblastını kültürden çıkarmak için 37 ° C'de 4 dakika boyunca T75 şişesine 1.5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin.
    2. Kalan 3T3 fibroblastlarını iyice yıkamak için T75 şişesini 1x DPBS ile iki kez durulayın; HNE'leri ayırmak için T75 şişesine 37 °C'de 10 dakika boyunca 1,5 mL% 0,05 tripsin-EDTA ekleyin.
    3. Tripsini soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile nötralize edin (bakınız Malzeme Tablosu) 1: 1 oranında. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın ve ardından süpernatanı çıkarın. Hücreleri 5 mL genleşme ortamı ile bir kez yıkadıktan sonra, hücreler organoidleri büyütmek için tohumlamaya hazırdır.
      NOT: Pasaj numarası üç olan HNE'lerin daha sonraki deneyler için kullanılması önerilir.

2. Slaytlarda ve kültür eklerinde organoidlerin büyümesi ve farklılaşması

  1. Organoid kültür hücre dışı matrisini (ECM) gece boyunca 4 ° C'de çözün. Pipet uçlarını 4 °C'ye kadar soğutun ve 4 °C'de gece boyunca 15 delikli anjiyogenez slaytları (bkz.
    NOT: ECM, hücre hasadının yapılması gerekmeden önceki gece 4 ° C'ye konulmalıdır.
  2. Kızakları buz üzerinde 5 μL soğuk% 100 ECM ile kaplayın (15 delikli kızağın her bir kuyucuğuna soğuk pipet ucu ile 5 μL soğuk% 100 ECM) ve ardından konsolidasyon için en az 30 dakika boyunca 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.
  3. Bir hemositometre kullanarak ko-kültürden toplanan HNE'leri sayın ve hücreleri, buz üzerinde farklılaşma ortamı (Tablo 2) ile seyreltilmiş% 20 ECM ile toplam 500 hücre / μL'ye seyreltin. Daha sonra, soğuk hücre / ECM karışımının 5 μL'sini ECM ile kaplanmış slaytların her bir kuyucuğuna tohumlayın.
  4. Hücre/ECM karışımını konsolide etmek için slaytları derhal 37 °C'de 1 saat boyunca bir kültür inkübatörüne aktarın.
  5. 15 kuyucuklu anjiyogenez slaytlarının her bir kuyucuğundaki hücreleri 50 μL farklılaşma ortamı ile besleyin. Organoidler daha fazla deney için hazır olana kadar medyayı her gün değiştirin.
    NOT: Organoidler genellikle 1-2 gün sonra görselleştirilebilir. Slaytların her bir kuyucuğunda yaygın olarak oluşan 20-90 organoid vardır. Organoidler tipik olarak ECM'de 40-60 gün boyunca hayatta kalabilir ve 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde tutulduğunda her gün beslenir.
  6. Kültürdeki organoidler, aşağıda belirtilen adımlara göre, belirli uygulamalar için (histoloji veya immünofloresan için bölümleme gibi) daha fazla miktarda ( bkz. Malzeme Tablosu) ekler.
    1. Kültür eklerinde organoidleri büyütmek için, organoid kültür ECM'sini, pipet uçlarını ve kesici uçları adım 2.1-2.2'de belirtildiği gibi hazırlayın. Kesici uçları 100 μL soğuk% 100 ECM ile kaplayın.
    2. Kesici uçtaki ECM kaplamanın üzerine 60 μL hücre/ECM karışımı (farklılaşma ortamında %20 ECM ile 500 hücre/μL) tohum.
      NOT: Kesici uçlarda organoid yapmak için diğer tüm adımlar, slaytlarda uygulananlarla aynıdır, adım 2.4-2.5.
    3. Kesici ucun alt kısmına 600 μL farklılaştırma ortamı ekleyin. Organoidler deneyler için kullanılana kadar, tipik olarak 2-3 hafta boyunca medyayı her alternatif günde bir değiştirin.

3. Tam montajlı immünofloresan için organoidlerin hazırlanması ve izolasyonu

  1. Organoidlerin izolasyonu ve sabitlenmesi
    1. 8 delikli cam tabanlı hazne kızaklarına hücre yapıştırıcısı ile ön işlem yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız) Referans35'i takip eden 30 dakika boyunca. Çözeltiyi attıktan sonra, kuyucukları 30 dakika boyunca havayla kurulayın.
    2. Organoidleri hasat etmek için, ortamı ECM'nin üstünden çıkarın ve ardından buz üzerindeki 15 delikli slaytların her bir kuyucuğuna 50 μL soğuk 1x PBS ekleyin (ECM hacmi ile 1: 1).
    3. Büyük delikli pipet ucunun 200 μL'sini kullanarak pipeti 3-5 kez yukarı ve aşağı doğru çevirin ve ardından çözeltiyi 8 delikli hazneli kızakların bir kuyusunun ortasına dağıtın.
    4. İnce uçlu bir pipetle fazla sıvıyı derhal kuyucuklardan çıkarın. Ardından, cam tabana yapışan organoidi arttırmak için hazneyi 40 dakika boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
    5. 1x PBS ile iki kez nazikçe yıkadıktan sonra, organoidleri oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca her bir oyuğa 300 μL% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
    6. 1x PBS ile iki kez yıkayın ve organoidleri 2 haftaya kadar immün boyama için 4 ° C'de 1x PBS'de saklayın.
  2. İmmünofloresan boyama
    1. Otomatik floresansı azaltmak için, RT'deki slaytların her bir kuyucuğuna 1x PBS'de 250 μL'lik 50 mM NH4Cl'yi 30 dakika boyunca ekleyin ve 20 rpm'de bir çalkalayıcıda hafifçe sallayın.
    2. 1x PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, RT'de 30 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100 ile hücreleri geçirgen hale getirirken, 20 rpm'de hafifçe sallayın.
    3. 1x PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, RT'de 1 saat boyunca her bir oyuğa %5 BSA ve 1x PBS'de %0,1 Triton X-100 dahil olmak üzere 300 μL blokaj çözeltisi ekleyin.
    4. Yıkamayı takiben, uygun kuyucuklara birincil antikor ve ardından ikincil antikorlar ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). 1x PBS'de% 2 BSA ve% 0.3 Triton X-100'de birincil ve ikincil antikor çözeltileri hazırlayın. Tüm birincil antikorları 2 gün boyunca 4 ° C'de ve tüm ikincil antikorları 1 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Son konsantrasyonlar, deney için istenen proteine bağlıdır. Lütfen üreticinin veri sayfasındaki stok konsantrasyonunu kontrol edin. Ardından, Malzeme Tablosunda kullanılan seyreltmelere dayanarak nihai konsantrasyonları hesaplayın.
    5. Kuluçkadan sonra, kuyucukları 1x PBS ile iyice yıkayın ve nükleer boyama için her bir kuyucuğa% 2 BSA ve% 0.3 Triton X-100'de DAPI ekleyin.
    6. Organoidleri konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak, 20-60x yağ daldırma hedefi ile görüntüleyin ( bkz. Görüntünün üst ve alt sınırlarını ayarlamak için Z-yığını modunu kullanın ve konfokal yazılım tarafından belirlenen önerilen optimum Z-adım boyutunu kullanın.
      NOT: Aşağıdaki dört konfokal lazer uyarma dalga boyu kullanılmıştır: 408.7 nm, 489.1 nm, 561.7 nm ve 637.9 nm.

4. Histolojik kesitleme için organoidlerin hazırlanması ve izolasyonu

  1. Histolojik çalışmalar için organoidleri toplamak için, medyayı kültürden çıkarın ve buz üzerindeki slaytların her bir kuyucuğuna 50 μL soğuk 1x PBS ekleyin.
  2. 200 μL büyük delikli pipet ucu kullanarak üç ila beş kez yukarı ve aşağı pipet, 15 delikli sürgü veya kültür uçlarındaki tüm çözeltileri buz üzerinde 15 mL'lik konik bir tüpte birleştirin. Ek soğuk 1x PBS ekleyerek tüpteki toplam çözelti hacmini 10 mL'ye ayarlayın.
  3. Tüpü 4 ° C'de, 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın; Süpernatantı aspire edin ve 200 μL'lik büyük delikli pipet ucu kullanarak organoid pelet ile karıştırmak için 60 μL sıcak histojel ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Süspansiyonu hemen bir histoloji kalıbına aktarın. Histojelin oda sıcaklığında konsolidasyonundan sonra, kalıp bloğunu 4 ° C'de gece boyunca sabitlemek için% 4 paraformaldehit içine koyun.
  5. Parafine gömüldükten sonra, histojel bloğunu 5 μm enine kesitlere (örneğin bir mikrotomla) kesin, bölümleri cam slaytlara sabitleyin ve hematoksilin ve eozin (H & E) veya immünofloresan etiketli antikorlar kullanarak lekeleyin. Parlak alan mikroskobu veya ters epi-floresan mikroskobu kullanarak görüntü çekin (bkz.

5. Canlı organoidlerin görüntülenmesi

NOT: Aşağıdaki adımlar otomatik bir görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Farklı görüntüleme sistemlerinin, kendi üreticilerinin talimatlarını izleyerek bu adımları uyarlamaları gerekir. Kullanılan ekipmandan bağımsız olarak, canlı organoidlerin görüntülenmesi, eşlik eden bir CO2 gaz kontrolörü ile sıcaklık kontrollü ve nemlendirilmiş bir çevre odası gerektirir.

  1. İşlevsel bir şişme testi36 gerçekleştirmeden önce organoidlerin farklılaşmasını izlemek için, tüm slayt görüntülerini aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi herhangi bir parlak alan mikroskobu veya otomatik bir görüntüleme sistemi ile manuel olarak yakalayın.
    1. Otomatik görüntüleme sistemine ve CO2/O2 gaz kontrolörüne giden gücü açın ve sistemin otomatik kalibrasyonu tamamlamasına izin verin (~30 dakika).
    2. Tamamlandıktan sonra, görüntüleme sistemi sıcaklığını 37 °C'ye ayarlayın; nemlendirme haznesine 15 mL steril su ekleyin, CO2 valflerini açın, kapakları kapatın ve görüntüleme sisteminin görüntülemeden önce en az 30 dakika boyunca ön inkübe etmesine izin verin.
    3. Görüntüleme için bir protokol ayarlamak üzere otomatik görüntüleme yazılımını açın ve ham deneysel verilerin kaydedileceği konumu seçin.
      NOT: Görüntüleme sistemine özgü örnek bir protokol dosyası (Ek Dosya 1), organoid farklılaşmasını izlemek için organoidlerin otomatik görüntülenmesi için bir şablon olarak sağlanmıştır.
    4. Çevresel ayarlar yerine getirildikten sonra, kapaklı iki adede kadar 15 delikli kızağı, otomatik görüntü sisteminin slayt tutucu ekindeki çevre odasına derhal aktarın (bkz.
    5. Görüntülenecek kuyuları seçin ve istenen kuyucukların görüntülenmesini tamamlamak için görüntülemeye başlayın.
      NOT: Önerilen temel ayarlar şunlardır: 4x ve 10x hava hedefi, parlak alan kanalı, tüm kuyu alanını kapsayacak şekilde 4x objektif için 2 x 2 montaj, 10x objektif için 4 x 4 montaj. Z-yığını ayarları: üç ila altı Z-yığını dilimi, Z-adım boyutu = 50-100 μm, otomatik netleme noktasının altında bir ila iki dilim ve yukarıda üç ila beş dilim.
  2. Forskolin kaynaklı şişlik (FIS) testinde kullanılmak üzere canlı organoidleri görüntülemek için, sıcaklık ve CO2 kontrolüne izin veren çevre kontrollü bir görüntüleme odası ile donatılmış otomatik bir aşamaya sahip bir mikroskop kullanın.
    1. Adım 5.1.1-5.1.4 ile başlayın, adım 5.1.3'teki protokol dosyasını, FIS testi gerçekleştirmek için özel ayarları içeren örnek protokol dosyasında (Ek Dosya 2) sağlanan dosyayla değiştirin.
    2. Her denemeden önce, her slayt için en az üç kuyu (en sol, orta ve en sağ) değerlendirerek pozlama ayarlarını yapın. Hedefin tüm kuyular için kuyunun merkezinde olmasını sağlamak için X ve Y koordinat ofsetlerini uygulayın.
      NOT: Önerilen temel ayarlar şunlardır: 4x hava hedefi, Kanal 1 = Parlak Alan, Kanal 2 = DAPI, 2 x 2 montaj (dört görüntü döşemesi). Z-yığını ayarları: üç ila dört Z-yığını dilimi, Z-adım boyutu = 50-100 μm, otomatik netleme noktasının bir dilim altında ve yukarıda iki ila üç dilim. Görüntü alma süresi: 20 dakikalık aralıklarla 8 saat (Toplam okuma sayısı = 25; Okuma 1, T = 0'dır).
    3. Tüm ayarlar uygun şekilde seçildikten sonra, her iki slayt için de görüntülenecek kuyucukları seçin veya tümünü seçin ve ekipmanın talimatlarına göre çalıştırmaya başlayın.
    4. Çalıştırdıktan sonra denemeyi kaydedin, görüntüleme yazılımını kapatın ve görüntüleme sistemini kapatın37.

6. Temel lümen ölçümleri

NOT: Bu, manuel görüntüleme analiz yazılımı kullanılarak yapılır (bkz. Benzer bir metodoloji, açık kaynaklı bir yazılım38 veya bir görüntü üzerindeki bir bölgenin alanını ölçebilen herhangi bir yazılım kullanılarak takip edilebilir.

  1. Yazılımda, ekranın alt kısmına sağ tıklayarak Otomatik Ölçüm Panelini açın, Ölçüm'ü ve ardından Otomatik Ölçüm Sonuçları'nı seçin. Ölçülen her ilgi alanının (ROI) alanı burada görünecektir.
  2. Yazılımda organoid görüntüyü açın ve görünür lümenli 5-10 organoid seçin.
    NOT: Lümen, organoidin ortasında, organoidin geri kalanından gözle görülür şekilde farklı renkte dairesel bir alan olacaktır (Şekil 2A).
  3. Poligon YG ölçüm özelliğini kullanarak, menüyü açmak için resme sağ tıklayın ve organoidin toplam yüzey alanını (TSA) elde etmek üzere tam organoidi özetlemek için Poligonal YG'yi seçin. Ardından aynı özelliği kullanarak, lümen alanını (LA) ana hatlarıyla belirtin (Şekil 2B).
  4. Kuyuda kalan organoidler ve tahlildeki tüm kuyucuklar için tekrarlayın.
  5. Verileri excel'e aktarın. LA'yı TSA'ya bölün ve Temel Lümen Oranı (BLR) 11,13'ü elde etmek için numunedeki tüm organoidlerin ortalamasını alın.
    NOT: Tipik olarak, CF olmayan organoidlerin ~% 87'si 0.6'nın üzerinde bir BL'ye sahip olacak ve% 97'si 0.5'in üzerinde olacakken, CF organoidlerinin sadece% 14'ü 0.6'nın üzerinde bir BBR'ye sahip olacak ve% 31'i 0.5'in üzerinde olacaktır.

7. HNE organoidlerinin ön tedavisi ve otomatik görüntülenmesi

NOT: Tüm ön işlem adımları temiz bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir. Otomatik görüntüleme sistemini ve adım 7.1'den önce tahlili kaydetmek için yazılımı önceden ayarlayın. DAPI ile inkübasyon isteğe bağlıdır, ancak parlak alan görüntülerinin kalitesi tehlikeye girerse arıza emniyetli olarak önerilir. Bu durumda, bunun yerine DAPI kanalı (377 nm) analiz edilebilir.

  1. Organoidleri, 100 μM CFTRinh-172 içeren veya içermeyen DAPI içeren 50 μL farklılaşma ortamı içeren 15 kuyucuklu bir kuyucukta 15 kuyucuklu bir kuyucukta 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde önceden inkübe edin. Organoidler inkübe ederken, Ek Dosya 2'yi takip eden bir şişme testi özel protokolü kullanarak adım 5.2.1'i gerçekleştirin.
  2. Ön inkübasyon ortamını, aspirasyonlu bir cam Pasteur pipet kullanarak çıkarın. Her bir kuyucuğa toplam 50 μL farklılaşma ortamı hacmi için 10 μM forskolin ve 100 μM IBMX (stimülasyon kokteylleri) ekleyin (bkz.
    NOT: Kuyucuklara kabarcık girmediğinden emin olun. Görüntülerdeki kabarcıklar otomatik analizi etkiler.
  3. Gecikmeden, 5.2.2 ila 5.2.4 arasındaki adımları izleyerek FIS görüntüleme protokolünü başlatın. Her kuyu boşluğunda her 20 dakikada bir, toplam çalışma süresi 8 saat olan görüntüler elde edin.

8. HNE organoidleri üzerinde forskolin kaynaklı şişlik testinin otomatik analizi

  1. Otomatik görüntüleme analizi yazılımını açın, daha önce adım 7.3'ten kaydedilen denemeyi bulun ve denemenin görüntülerini getirin.
  2. Değerlendirilecek kap penceresini seçin ve dikilmiş ve z-yansıtılan işlenmiş görüntüleri içeren seçeneği belirleyin. Bu adım, maskeleme değerlendirmesi ve ölçümleri için görüntüleme çerçevesindeki tüm organoidlerle birlikte tüm kuyunun bir resmini sağlamalıdır.
  3. Değerlendirilecek kuyu görüntüsünü seçin. Analiz Et'i seçin. Otomatik ölçümlere dahil edilen tüm görüntüler için uygun maskelemeyi sağlamak üzere diğer görüntüler için bu işlemi tekrarlayın. Ayar parametrelerini kaydedin.
  4. Analiz ayarlarını tamamladıktan sonra değişiklikleri uygulayın. Yazılım, ayarlara göre ölçümleri değiştirecektir.
    NOT: İlk görüntü ön işleme tamamlandıktan sonra, tutarlı maskeleme sağlamak için kalite kontrol (QC) önlemleri alınmalıdır. Bunlar, organoidlerin görüntüleme çerçevesi içinde olduğundan, kabarcıkların veya döküntülerin uygunsuz şekilde maskelenmediğinden emin olmak için tüm kuyucukların manuel olarak gözden geçirilmesini ve maskelemenin parlak alan ve DAPI kanallarında kontrol edilmesini içerir.
  5. Özet analiz için verileri dışa aktarın (grafik ve istatistiksel analiz dahil).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

HNE'lerin genişlemesi, gelişen bir organoid kültür için gereklidir. Başarılı bir numune koleksiyonundan elde edilen HNE'ler, 10 gün içinde %70'in üzerinde bir birleşime kadar genişlemelidir. Başarılı ve başarısız örneklere bir örnek sırasıyla Şekil 1A ve Şekil 1B'de gösterilmiştir. Hücreler, ışınlanmış 3T3 hücrelerle ko-kültürden 14 gün sonra% 70 birleşmeye ulaşamazlarsa atılmalıdır. Kirlenmiş herhangi ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda, HNE fırça biyopsisinden türetilen hava yolu epitel organoidlerinin kapsamlı canlı ve sabit görüntülenmesi için ayrıntılı metodolojiler sunulmaktadır. Bir bireyde CFTR aktivitesini belirleyebilen fonksiyonel testleri tanımlar. HNE'ler, çeşitli uygulamalar için minimal invaziv, birincil doku sağlar. Burada sunulan genişleme teknikleri, organoidler de dahil olmak üzere hava yolu hastalıklarını modellemek için kullanılabilir. Organoidler, hassas terapötik yaklaşımlar için ve zaman iç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

JSG, benzer bir modeli tanımlayan Kuzey Carolina Üniversitesi'nden bir patent başvurusu 20170242033 mucit olarak listelenmiştir. UNC'nin lisanslı teknolojisi telif hakkı ürettiğinde, mucitler gelirden pay alırlar. Aksi takdirde, yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler. Fon sağlayıcıların, çalışmanın tasarımında, verilerin toplanmasında, analizinde veya yorumlanmasında, makalenin yazımında veya sonuçların yayınlanması kararında hiçbir rolü yoktu.

Teşekkürler

Bu protokolü geliştirmek için HNE fırça biyopsileri bağışlayan tüm katılımcıların katkılarını minnetle kabul ediyoruz. Latona Kersh ve Çocuk Araştırma Birimi personeline, çalışma gönüllüsü işe alımını ve örnek koleksiyonlarını koordine ettikleri için teşekkür ederiz. Teknik yardım için laboratuvarımızdaki eski stajyerler olan Lily Deng, Johnathan Bailey ve Stephen Mackay'a teşekkür ederiz. Zhong Liu ve Rui Zhao'ya teknik yardımları için teşekkür ederiz. UAB'deki CF Araştırma Merkezi Direktörü Steven M. Rowe, bu çalışmanın mümkün olmayacağı liderlik ve kaynaklar sağlar. Ayrıca, enstrüman eğitimi konusundaki yardımı için Biotek'ten Sarah Guadiana'ya, UAB Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Tesisi'nde konfokal mikroskopi yardımı için Robert Grabski'ye ve UAB Histoloji Çekirdeği'nde histolojik yardım için Dezhi Wang'a teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir. Hibe K23HL143167 (JSG'ye), Kistik Fibroz Vakfı (CFF) Hibe GUIMBE18A0-Q (JSG'ye), Gregory Fleming James Kistik Fibrozis Merkezi [NIH Grants R35HL135816 ve DK072482 ve CFF Birmingham'daki Alabama Üniversitesi (UAB) Araştırma ve Geliştirme Programı (Rowe19RO)] ve UAB Klinik ve Translasyonel Bilimler Merkezi (NIH Grant UL1TR001417).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Nasal brushMedical Packaging CYB1CYB-1Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette TipsThermoFisher Scientific02-707-141Large bore pipette tips
AccutaseThermoFisher ScientificA1110501Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTAGibco25300-054
Trypsin inhibitor from soybeanSigmaT6522Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrixCorning356255Extracellular matrix (EM)
µ-Slide AngiogenesisIbidi8150615-well slide
24-Well TranswellCorning7200154Culture insert
Chambered CoverglassThermoFisher Scientific1554098-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveThermoFisher Scientific354240Cell adhesive
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences50980487
Triton X-100Alfa AesarA16046
BSAThermoFisher ScientificBP1600-100
NucBlueThermoFisher ScientificR37605DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)NikonInverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25NikonConfocal microscope
NIS Elements- Basic ResearchNikonmanual imaging analysis software
HistogelThermoFisher ScientificHG-4000-012
Disposable Base MoldsThermoFisher Scientific41-740
Lionheart FXBioTekBTLFXAutomated image system
Lionheart CoverBioTekBT1450009Environmental Control Lid
Humidity ChamberBioTekBT1450006Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2BioTekBT1210013Gas controller
Microplate/Slide Stage InsertBioTekBT1450527Slide holder
Gen5 Imaging Prime SoftwareBioTekBTGEN5IPRIMAutomated imaging analysis software
4x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320515
10x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320516
LED CubeBioTekBT1225007
Filter Cube (DAPI)BioTekBT1225100DAPI
CFTRinh-172Selleck ChemicalsS7139
ForskolinSigmaF6886
IBMXSigmaI5879
Expansion Media
DMEMThermoFisher Scientific11965
F12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765
Fetal Bovine SerumThermoFisher Scientific 16140-071
Penicillin/StreptomycinThermoFisher Scientific 15-140-122
Cholera ToxinSigma C8052
Epidermal Growth Factor (EGF)ThermoFisher Scientific PHG0314
Hydrocortisone (HC)Sigma H0888
InsulinSigma I9278
AdenineSigma A2786
Y-27632Stemgent 04-0012-02
Antibiotic Media
CeftazidimeAlfa Aesar J66460-03
TobramycinAlfa Aesar J67340
VancomycinAlfa Aesar J67251
Amphotericin BSigma A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1)ThermoFisher Scientific 11330-32
Ultroser-GPall 15950-017
Fetal Clone IIHyclone SH30066.03
Bovine Brain ExtractLonza CC-4098
InsulinSigma I-9278
HydrocortisoneSigma H-0888
TriiodothyronineSigma T-6397
TransferrinSigma T-0665
EthanolamineSigma E-0135
EpinephrineSigmaE-4250
O-PhosphorylethanolamineSigmaP-0503
Retinoic AcidSigmaR-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibodyR&D SystemsMAB1660Dilution: 100x
ZO-1 antibodyThermo FisherMA3-39100-A647Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibodySigmaHPA008246Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulinSigmaT7451Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibodyAbcamAb11315Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA21202Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594InvitrogenA21207Dilution: 2000x

Referanslar

  1. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  2. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).
  3. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
  4. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
  5. Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
  6. Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
  7. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  8. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  9. Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
  10. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
  11. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  12. Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
  13. Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
  14. Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112(2013).
  16. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  17. Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
  18. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  19. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  20. Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  23. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
  24. Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  25. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3(2017).
  26. Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
  27. Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
  28. Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
  29. Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
  30. Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
  31. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473(2013).
  32. Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253(2014).
  33. McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062(2020).
  34. Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
  35. Corning Inc. CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , Discovery Labware, Inc. Bedford, MA. (2013).
  36. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  37. Biotek Instruments, Incorporated. Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
  38. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  39. Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
  40. McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
  41. Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır