JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен подробный протокол для описания органоидной модели in vitro из эпителиальных клеток носа человека. Протокол имеет опции для измерений, требующих стандартного лабораторного оборудования, с дополнительными возможностями для специализированного оборудования и программного обеспечения.

Аннотация

Индивидуализированная терапия для пациентов с муковисцидозом (МВ) может быть достигнута с помощью модели заболевания in vitro для понимания исходной активности регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR) и восстановления из низкомолекулярных соединений. Наша группа недавно сосредоточилась на создании хорошо дифференцированной органоидной модели, непосредственно полученной из первичных эпителиальных клеток носа человека (HNE). Гистология секционированных органоидов, полноразмерное иммунофлуоресцентное окрашивание и визуализация (с использованием конфокальной микроскопии, иммунофлуоресцентной микроскопии и яркого поля) необходимы для характеристики органоидов и подтверждения эпителиальной дифференцировки при подготовке к функциональным анализам. Кроме того, органоиды HNE производят просветы различных размеров, которые коррелируют с активностью CFTR, различая органоиды CF и без CF. В данной рукописи подробно описана методология культивирования органоидов HNE с акцентом на оценку дифференциации с использованием методов визуализации, включая измерение исходной площади просвета (метод измерения активности CFTR в органоидах, который может использовать любая лаборатория с микроскопом), а также разработанный автоматизированный подход к функциональному анализу (который требует более специализированного оборудования).

Введение

Введение в технику
Анализы ex vivo на основе культуры являются все более используемым инструментом для точной медицины и изучения патофизиологии заболеваний. Первичная культура клеток эпителия носа человека (HNE) использовалась в многочисленных исследованиях муковисцидоза 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , аутосомно-рецессивное заболевание, которое влияет на функцию эпителиальных клеток в нескольких органах. Культура HNE обеспечивает возобновляемый источник эпителия дыхательных путей, который может быть получен перспективно и воспроизводит электрофизиологические и биохимические качества для проверки активности регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR). Клетки HNE могут быть отобраны с минимальными побочными эффектами14, аналогичными обычным вирусным респираторным тампонам. Исследовательская работа, описывающая модель исследования муковисцидоза, полученная из биопсии щетки HNE, была недавно опубликована11,13. Подобно другим моделям, использующим первичную HNE 2,3 и кишечную ткань 15,16,17,18,19, подробная характеристика дифференцировки и визуализации этой модели описаны здесь для использования в исследованиях муковисцидоза и для оказания помощи в исследованиях других заболеваний дыхательных путей13 . Органоидная модель не является неограниченной, как увековеченные клеточные линии, но может быть расширена путем условного перепрограммирования (с использованием облученных и инактивированных фидерных фидерных фидеров и ингибиторов рокиназы) до более похожего на стволовые клетки состояния 20,21,22,23. Обработка биопсии щеток HNE с использованием этого метода дает большое количество эпителиальных клеток для использования в нескольких приложениях с более высокой пропускной способностью, сохраняя при этом способность к полной дифференцировке. Хотя этот протокол был разработан с использованием фидерных клеток, другие методологии могут быть использованы исследователями, желающими избежать технологии фидерных клеток14,24.

Важность методики для биологии легких
Значительное исследование было посвящено пониманию того, как отсутствие регулярного, функционирующего CFTR в клеточной мембране эпителиальных клеток приводит к дисфункции в легких, поджелудочной железе, печени, кишечнике или других тканях. Дисфункциональный транспорт ионов эпителия, особенно хлорида и бикарбоната, приводит к уменьшению объема эпителиальных выстилающих жидкостей и изменениям в слизистых выделениях, что приводит к застою и обструкции слизистой оболочки. При других заболеваниях дыхательных путей, таких как первичная цилиарная дискинезия, измененное цилиарное движение ухудшает слизистый клиренс и приводит к застою слизистой и обструкции25. Поэтому текущая органоидная модель HNE была разработана для различных применений, в зависимости от экспериментального дизайна и ресурсов исследователя. Это включает в себя визуализацию живых клеток с использованием пятен живых клеток; фиксация и сечение для характеристики морфологии; иммунофлуоресцентное окрашивание антителами и конфокальная визуализация цельного крепления во избежание нарушения внутрипросветных структур; и визуализация яркого поля и микрооптическая когерентная томография для количественных измерений частоты ресничного биения и мукоцилиарного транспорта13. Чтобы облегчить распространение на других исследователей, для культивирования использовались коммерчески доступные реагенты и расходные материалы. Был разработан функциональный анализ, в котором использовались общие методы микроскопа и более специализированное оборудование. В целом, хотя настоящая модель была разработана для оценки активности CFTR на исходном уровне или в ответ на терапию, методы, описанные в этом протоколе, могут быть применены к другим заболеваниям, связанным с функцией эпителиальных клеток, особенно к переносу эпителиальной клеточной жидкости.

Сравнение с другими методологиями
Недавно была разработана полезность этой органоидной модели путем корреляции in vitro CFTR модуляторных реакций органоидов пациентов с их клиническим ответом11. Примечательно, что также показано, что настоящая модель параллельна токам короткого замыкания, текущему золотому стандарту оценки функции CFTR, у тех же пациентов. Ток короткого замыкания отличается от анализа набухания, потому что первый измеряет функцию CFTR через транспорт ионов26. В отличие от этого, этот анализ измеряет более нисходящий эффект с переносом жидкости, предоставляя дополнительную информацию об общей функции CFTR 27,28,29,30,31,32. Измерения тока короткого замыкания по-прежнему являются распространенным и надежным методом определения активностиканала хлорида CFTR 1,33. Эти электрофизиологические анализы требуют специализированного, дорогостоящего оборудования, требуют во много раз больше клеток для каждой экспериментальной репликации, чем органоидный анализ, не могут быть легко автоматизированы и не поддаются масштабированию для приложений с более высокой пропускной способностью. Другая органоидная модель, полученная из кишечного эпителия, имеет дополнительные преимущества 15,16,17,18, такие как более отличная репликативная способность, но не получена из ткани дыхательных путей и не является универсально доступной. Щетки HNE получают недорогими цитологическими щетками без необходимости седации и с минимальным риском. Получение чистки зубов не требует клинициста и может быть выполнено обученными координаторами исследований и другим исследовательским персоналом14. Органоидная модель HNE может быть культивирована любой лабораторией с возможностями первичной клеточной культуры, и некоторые из применений могут быть выполнены стандартными методами микроскопии. В целом, эти преимущества обеспечивают дополнительный доступ к технологии оценки функции эпителия дыхательных путей, которая в противном случае могла бы быть недоступна для некоторых лабораторий. Кроме того, органоиды HNE могут быть использованы для изучения других болезненных состояний, которые влияют на дыхательные пути, таких как первичная цилиарная дискинезия25 или вирусная инфекция, которую кишечные органоиды не могут.

протокол

Образцы HNE были собраны в детской больнице Алабамы. Все процедуры и методы, описанные здесь, были одобрены IRB Университетом Алабамы в Бирмингеме (UAB IRB #151030001). Для облегчения расширения и улучшения функции эпителиальных клеток носа человека (HNEs) настоящие методы культивирования адаптированы из хорошо известного метода культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ALI) 28,34. Первоначально ГНЭ были собраны с помощью биопсии щетки, какописано ранее 12,14, с единственным отличием в использовании цитологической щетки. Все этапы обработки образцов и культивирования клеток выполнялись в шкафу биобезопасности.

1. Клеточная культура и расширение эпителиальных клеток носа

  1. После чистки щеткой храните образец биопсии носа в 8 мл среды RPMI в конической пробирке объемом 15 мл на льду и переносите его в лабораторию в течение 4 ч (не более 24 ч).
  2. Диссоциируйте биопсию носовой кисти на 8 мл среды RPMI в конической трубке объемом 15 мл, пропуская цитологическую щетку через кончик пипетки с большим отверстием 1 мл (отрезанный кончик) несколько раз, пока щетка не очистится от ткани.
  3. Центрифугируют клетки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °С, удаляют надосадочный материал, а затем повторно суспендируют клеточную гранулу в 3 мл раствора для отсоединения клеток (см. Таблицу материалов) и инкубируют при комнатной температуре в течение 16 мин для переваривания.
  4. Используйте 5 мл расширительной среды (таблица 1) для промывки ячеек дважды. Затем добавляют клетки в колбу T75, предварительно засеянную облученными и инактивированными 3T3 фибробластами22 (50%-60% слияние), чтобы совместно культивировать клетки и расширяться в расширительной среде в течение 7-14 дней (см. Рисунок 1 для соответствующей колонии). Перед использованием протестируйте облученные фибробласты 3T3, чтобы убедиться, что они не могут размножаться, что негативно повлияет на расширение эпителиальных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбросьте клетки, если слияние эпителиальных клеток носа не достигает 70% в течение 14 дней.
  5. Для клеток, полученных от пациентов с муковисцидозом, вводят четыре антибиотика (100 мкг/мл тобрамицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина В, 100 мкг/мл цефтазидима, 100 мкг/мл ванкомицина, см. Таблицу материалов) в расширительную среду для дезинфекции клеток в течение первых 3 дней культивирования, а затем заменяют среду свободными от антибиотиков расширительными средами, изменяя среду каждые 2 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограниченное использование антибиотиков предназначено для уменьшения потери культуры из-за бактериальной колонизации, одновременно поощряя пролиферацию после удаления дополнительных антибиотиков. Эти антибиотики могут быть адаптированы к конкретным результатам микробиологии пациента, с чувствительностью, если это необходимо.
  6. Собирают HNEs из совместной культуры с использованием метода двойной трипсинизации22 , как только клетки достигают приблизительно 80% слияния. Этот метод гарантирует, что облученные и инактивированные фибробласты 3T3 удаляются из колбы, и они не загрязняют последующее органоидное посев.
    1. Промыть клетки 1x DPBS, а затем добавить 1,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу T75 в течение 4 мин при 37 °C для удаления облученного и инактивированного фибробласта 3T3 из культуры.
    2. Дважды промойте колбу T75 1x DPBS, чтобы тщательно смыть оставшиеся фибробласты 3T3; добавить 1,5 мл 0,05% трипсина-ЭДТА в колбу T75 в течение 10 мин при 37 °C для отделения ГНЭ.
    3. Нейтрализуют трипсин ингибитором трипсина сои (см. Таблицу материалов) в соотношении 1:1. Центрифугируют клетки при 500 х г в течение 5 мин, а затем удаляют супернатант. После промывки клеток 5 мл расширительной среды один раз, клетки готовы к посеву для выращивания органоидов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ХНП с проходным номером три рекомендуется использовать для дальнейших экспериментов.

2. Рост и дифференциация органоидов в слайдах и культуральных вставках

  1. Разморозить органоидную культуру внеклеточного матрикса (ECM) в течение ночи при 4 °C. Прохладные наконечники пипетки до 4 °C и 15-луночные слайды ангиогенеза (см. Таблицу материалов) в течение ночи при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ECM должен быть поставлен при 4 °C в ночь перед тем, как необходимо провести сбор клеток.
  2. Покройте слайды 5 мкл холодного 100% ECM на льду (пипетка 5 мкл холодного 100% ECM с холодным наконечником пипетки в каждую лунку 15-луночного слайда), а затем поместите их в инкубатор клеточной культуры при 37 °C на срок не менее 30 мин для консолидации.
  3. Подсчитайте ГНП, собранные из кокультуры, с помощью гемоцитометра и разбавьте клетки до 500 клеток/мкл в общем количестве с 20% ECM, разбавленным дифференцировочными средами (таблица 2) на льду. Затем посыпайте 5 мкл смеси холодной клетки/ECM в каждую лунку слайдов, покрытых ECM.
  4. Немедленно переложите слайды в инкубатор культуры при 37 °C в течение 1 ч для консолидации смеси клетка/ECM.
  5. Подкармливайте клетки в каждой лунке 15-луночного ангиогенеза с 50 мкл дифференцировочной среды. Меняйте среду через день, пока органоиды не будут готовы к дальнейшим экспериментам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды обычно можно визуализировать через 1-2 дня. В каждом колодце горок обычно образуется 20-90 органоидов. Органоиды обычно могут выживать в течение 40-60 дней в ECM с кормлением через день при хранении в увлажненном инкубаторе при 37 ° C.
  6. Культивируйте органоиды в культуральных вставках (см. Таблицу материалов) для большего количества для конкретных применений (таких как секционирование для гистологии или иммунофлуоресценции) в соответствии с этапами, упомянутыми ниже.
    1. Чтобы вырастить органоиды в культуральных вставках, подготовьте органоидную культуру ECM, наконечники пипеток и вкладыши, как указано в шагах 2.1-2.2. Покройте вкладыши 100 мкл холодного 100% ECM.
    2. Посейте 60 мкл смеси cell/ECM (500 клеток/мкл с 20% ECM в дифференцировочной среде) поверх покрытия ECM во вставке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все остальные этапы изготовления органоидов во вставках такие же, как и на слайдах, этапы 2.4-2.5.
    3. Добавить 600 мкл дифференциаторной среды в нижнюю часть вкладыша. Меняйте среду каждый альтернативный день, пока органоиды не будут использоваться для экспериментов, обычно 2-3 недели.

3. Подготовка и выделение органоидов для цельной иммунофлуоресценции

  1. Выделение и фиксация органоидов
    1. Предварительно обработайте 8-луночные слайды камеры со стеклянным дном клеточным клеем (см. Таблицу материалов) в течение 30 мин после ссылки35. После выбрасывания раствора высушите лунки на воздухе в течение 30 мин.
    2. Чтобы извлечь органоиды, удалите среду из верхней части ECM, а затем добавьте 50 мкл холодного 1x PBS в каждую лунку 15-луночных слайдов на льду (1: 1 с объемом ECM).
    3. Пипетка вверх и вниз 3-5 раз, используя 200 мкл наконечника пипетки с большим отверстием, а затем дозируйте раствор на центр колодца 8-луночной камеры слайдов.
    4. Немедленно удалите лишнюю жидкость из скважин с помощью тонкоконечной пипетки. Затем поместите затвор камеры в инкубатор при температуре 37 °C в течение 40 минут, чтобы усилить органоид, прилипший к стеклянному дну.
    5. После осторожной промывки 1x PBS дважды зафиксируйте органоиды с 300 мкл 4% параформальдегида в каждой лунке в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
    6. Дважды промыть 1x PBS и хранить органоиды в 1x PBS при 4 °C для иммуноокрашения в течение 2 недель.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание
    1. Чтобы уменьшить автофлуоресценцию, добавьте 250 мкл 50 мМ NH4Cl в 1x PBS в каждую лунку слайдов на RT в течение 30 минут, осторожно встряхивая шейкер на 20 оборотах.
    2. После промывки 1x PBS дважды проницайте клетки 0,1% Triton X-100 в течение 30 мин при RT, осторожно встряхивая при этом 20 об/мин.
    3. После промывки 1x PBS дважды добавляют 300 мкл блокирующего раствора, включая 5% BSA и 0,1% Triton X-100 в 1x PBS, в каждую лунку в течение 1 ч при RT.
    4. После промывки добавляют первичные антитела в соответствующие лунки, а затем вторичные антитела (см. Таблицу материалов). Готовят растворы первичных и вторичных антител в 2% BSA и 0,3% Triton X-100 в 1x PBS. Инкубировать все первичные антитела при 4 °C в течение 2 дней и все вторичные антитела при 4 °C в течение 1 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные концентрации зависят от белка, желаемого для эксперимента. Пожалуйста, проверьте концентрацию запасов в техническом описании производителя. Затем рассчитайте конечные концентрации на основе разбавлений, используемых в Таблице материалов.
    5. После инкубации тщательно промыть скважины 1x PBS и добавить DAPI в 2% BSA и 0,3% Triton X-100 в каждую скважину для ядерного окрашивания.
    6. Изобразите органоиды с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа с 20-60-кратным масляным погружением (см. Таблицу материалов). Используйте режим Z-стека для установки верхней и нижней границ изображения и используйте рекомендуемый оптимальный размер Z-шага, определенный конфокальным программным обеспечением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Были использованы следующие четыре длины волн конфокального лазерного возбуждения: 408,7 нм, 489,1 нм, 561,7 нм и 637,9 нм.

4. Подготовка и выделение органоидов для гистологического сечения

  1. Чтобы извлечь органоиды для гистологических исследований, удалите среду из культуры и добавьте 50 мкл холодного 1x PBS в каждую лунку горок на льду.
  2. Пипетка вверх и вниз три-пять раз, используя наконечник пипетки с большим отверстием объемом 200 мкл, объедините все растворы из 15-луночных слайдов или культуральных вставок в коническую трубку объемом 15 мл на льду. Отрегулируйте общий объем раствора в пробирке до 10 мл, добавив дополнительный холодный 1x PBS.
  3. Центрифугировать трубку при 4 °C, 300 х г в течение 5 мин; аспирировать супернатант и добавить 60 мкл теплого гистогеля (см. Таблицу материалов) для смешивания с органоидной гранулой, используя 200 мкл кончика пипетки с большим отверстием.
  4. Немедленно переведите суспензию в гистологическую форму. После консолидации гистогеля при комнатной температуре поместите блок формы в 4% параформальдегид для фиксации на ночь при 4 °C.
  5. После встраивания в парафин разрежьте блок гистогена на 5 мкм поперечных сечений (например, с помощью микротома), зафиксируйте участки на стеклянных слайдах и окрашивайте с помощью гематоксилина и эозина (H & E) или иммунофлуоресцентных антител. Делайте снимки с помощью ярко-полевого микроскопа или инвертированного эпифлуоресцентного микроскопа (см. Таблицу материалов).

5. Визуализация живых органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы выполняются с использованием автоматизированной системы визуализации (см. Таблицу материалов). Различные системы визуализации должны адаптировать эти шаги в соответствии с инструкциями конкретного производителя. Независимо от используемого оборудования, для визуализации живых органоидов требуется камера окружающей среды с контролируемой температурой и увлажненная камера с сопровождаемым газовым контроллером CO2 .

  1. Чтобы контролировать дифференциацию органоидов перед выполнением функционального анализа набухания36, захватите все слайдовые изображения вручную с помощью любого микроскопа яркого поля или с помощью автоматизированной системы визуализации, как подробно описано ниже.
    1. Включите питание автоматизированной системы визуализации и газового контроллера CO2/O2 и позвольте системе завершить автоматическую калибровку (~30 мин).
    2. После завершения установите температуру системы визуализации на уровне 37 °C; добавьте 15 мл стерильной воды в резервуар для увлажнения, откройте клапаны CO2 , закройте крышки и дайте системе визуализации предварительно инкубироваться в течение как минимум 30 минут перед визуализацией.
    3. Откройте автоматизированное программное обеспечение для создания изображений, чтобы настроить протокол для визуализации и выбрать место для сохранения необработанных экспериментальных данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пример файла протокола (Дополнительный файл 1), специфичный для системы визуализации, был предоставлен в качестве шаблона для автоматизированной визуализации органоидов для мониторинга дифференцировки органоидов.
    4. После того, как условия окружающей среды будут выполнены, немедленно перенесите до двух 15-луночных слайдов с крышками в экологическую камеру во вставке держателя слайдов автоматизированной системы изображения (см. Таблицу материалов).
    5. Выберите скважины для получения изображения и начните визуализацию для полной визуализации желаемых скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные рекомендуемые настройки: 4x и 10x воздушный объектив, ярко-полевой канал, 2 x 2 монтажа для 4x объектива для покрытия всей площади скважины, 4 x 4 монтажа для 10x объектива. Настройки Z-стека: от трех до шести фрагментов Z-стека, размер Z-шага = 50-100 мкм, от одного до двух срезов ниже точки автофокусировки и от трех до пяти фрагментов выше.
  2. Чтобы получить изображение живых органоидов для использования в анализе набухания, вызванного форсколином (FIS), используйте микроскоп с автоматизированной ступенью, оснащенной камерой визуализации с экологически контролируемым контролем, которая позволяет контролировать температуру и CO2 .
    1. Начните с шагов 5.1.1-5.1.4, замените файл протокола на шаге 5.1.3 файлом, приведенным в примере файла протокола (Дополнительный файл 2), содержащим настройки, специфичные для выполнения анализа FIS.
    2. Перед каждым экспериментом настраивайте параметры экспозиции, оценивая по крайней мере три скважины для каждого слайда (крайний левый, средний и крайний правый). Примените смещения координат X и Y, чтобы гарантировать, что цель будет находиться в центре скважины для всех скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основные рекомендуемые настройки: 4x воздушный объектив, канал 1 = яркое поле, канал 2 = DAPI, монтаж 2 x 2 (четыре плитки изображения). Настройки Z-стека: три-четыре Среза Z-стека, размер Z-шага = 50-100 мкм, один срез ниже точки автофокусировки и два-три среза выше. Время получения изображения: 8 ч с интервалами 20 мин (Всего считывает = 25; Чтение 1 равно T = 0).
    3. После того, как все настройки выбраны соответствующим образом, выберите скважины для изображения для обоих слайдов или выберите все и начните запуск в соответствии с инструкциями оборудования.
    4. После запуска сохраните эксперимент, закройте программное обеспечение для обработки изображений и завершите работу системы обработки изображений37.

6. Измерение базового светового потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается с помощью программного обеспечения для ручного анализа изображений (см. Таблицу материалов). Аналогичная методология может быть использована с использованием программного обеспечения38 с открытым исходным кодом или любого программного обеспечения, которое может измерять площадь области на изображении.

  1. В программном обеспечении откройте Панель автоматических измерений , щелкнув правой кнопкой мыши нижнюю часть экрана, выберите Измерение, а затем Автоматизированные результаты измерений. Там появится область измерения каждого интересующего региона (ROI).
  2. Откройте органоидное изображение в программном обеспечении и выберите 5-10 органоидов с видимыми просветами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Люмены будут представлять собой круглую область в середине органоида, которая заметно отличается по цвету от остальной части органоида (рисунок 2A).
  3. Используя функцию измерения ROI полигона, щелкните правой кнопкой мыши на изображении, чтобы открыть меню, и выберите Polygonal ROI , чтобы очертить весь органоид для получения общей площади поверхности органоида (TSA). Затем, используя тот же признак, наметьте область просвета (LA) (рисунок 2B).
  4. Повторите для оставшихся органоидов в лунке и всех лунок в анализе.
  5. Экспортируйте данные в Excel. Разделите LA на TSA и усредните все органоиды из образца, чтобы получить базовый коэффициент просвета (BLR)11,13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, ~ 87% органоидов без МУКОВисцидоза будут иметь BLR более 0,6, а 97% будут более 0,5, в то время как только 14% органоидов CF будут иметь BLR более 0,6, а 31% будет более 0,5.

7. Предварительная обработка и автоматизированная визуализация органоидов HNE

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы предварительной обработки проводятся в чистом кабинете биобезопасности. Предварительно настройте автоматизированную систему визуализации и программное обеспечение для записи анализа перед шагом 7.1. Инкубация с DAPI является необязательной, но рекомендуется как отказоустойчивая, если качество ярких полевых изображений нарушено. В этом случае можно проанализировать канал DAPI (377 нм).

  1. Предварительно инкубируют органоиды в лунке из 15-луночных слайдов с 50 мкл дифференцировочных сред, содержащих DAPI со 100 мкМ CFTRinh-172 или без них (см. Таблицу материалов) в инкубаторе с температурой 37 °C в течение 1 ч. Пока органоиды инкубируются, выполните шаг 5.2.1, используя пользовательский протокол анализа набухания после дополнительного файла 2.
  2. Удалите прединкубационную среду с помощью стеклянной пипетки Пастера с аспирацией. Добавьте 10 мкМ форсколина и 100 мкМ IBMX (стимулирующие коктейли) (см. Таблицу материалов) для общего объема дифференцирующих сред 50 мкл в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в скважины не вводятся пузырьки. Пузырьки на изображениях повлияют на автоматизированный анализ.
  3. Безотлагательно запустите протокол визуализации FIS после шагов 5.2.2-5.2.4. Получайте изображения каждые 20 минут в каждой скважине, с общим временем работы 8 часов.

8. Автоматизированный анализ форсколин-индуцированного анализа набухания на органоидах HNE

  1. Откройте программное обеспечение для автоматизированного анализа изображений, найдите эксперимент, ранее сохраненный из шага 7.3, и отобразите изображения эксперимента.
  2. Выберите окно сосуда для оценки и выберите параметр, содержащий обработанные изображения, которые были сшиты и z-проецированы. Этот шаг должен обеспечить картину всей скважины со всеми органоидами в рамках визуализации для маскировки оценки и измерений.
  3. Выберите изображение скважины для оценки. Выберите Анализ. Повторите этот процесс для других изображений, чтобы обеспечить соответствующую маскировку для всех изображений, включенных в автоматизированные измерения. Сохраните параметры настройки.
  4. После завершения анализа настроек примените изменения. Программное обеспечение будет изменять измерения на основе настроек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения первоначальной предварительной обработки изображения должны быть выполнены меры контроля качества (QC) для обеспечения последовательной маскировки. К ним относятся ручной обзор всех скважин, чтобы убедиться, что органоиды находятся в рамках визуализации, пузырьки или мусор не маскируются ненадлежащим образом, и проверка маскировки в ярком поле и каналах DAPI.
  5. Экспортируйте данные для суммарного анализа (включая график и статистический анализ).

Результаты

Расширение HNEs имеет важное значение для процветающей органоидной культуры. ГНП от успешного отбора проб должны расширяться до более чем 70% слияния примерно через 10 дней. Пример успешных и неудачных выборок показан на рисунке 1A и рисунке 1B соотв?...

Обсуждение

Эта рукопись содержит подробные методологии для всесторонней живой и фиксированной визуализации эпителиальных органоидов дыхательных путей, полученных из биопсии кисти HNE. Он описывает функциональные анализы, которые могут определить активность CFTR у человека. HNE обеспечивают минима?...

Раскрытие информации

JSG указан как изобретатель в патентной заявке 20170242033 из Университета Северной Каролины, которая описывает аналогичную модель. Когда лицензированная технология от UNC приносит роялти, изобретатели получают долю выручки. В противном случае авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, в сборе, анализе или интерпретации данных, в написании рукописи или в принятии решения о публикации результатов.

Благодарности

Мы с благодарностью признаем вклад всех участников, которые пожертвовали биопсию щетки HNE для разработки этого протокола. Мы благодарим Латону Керш и сотрудников Детского исследовательского отдела за координацию набора добровольцев и сбор образцов. Мы благодарим Лили Денг, Джонатана Бейли и Стивена Маккея, бывших стажеров нашей лаборатории, за техническую помощь. Мы благодарим Чжун Лю и Жуй Чжао за их техническую помощь. Стивен М. Роу, директор Исследовательского центра CF в UAB, обеспечивает лидерство и ресурсы, без которых эта работа была бы невозможна. Мы также хотели бы поблагодарить Сару Гвадиану из Biotek за помощь в обучении инструментам, Роберта Грабски за помощь в конфокальной микроскопии в Центре визуализации высокого разрешения UAB и Дежи Ванга за гистологическую помощь в UAB Histology Core. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH). Грант K23HL143167 (для JSG), Грант Фонда муковисцидоза (CFF) GUIMBE18A0-Q (для JSG), Центр муковисцидоза Грегори Флеминга Джеймса [гранты NIH R35HL135816 и DK072482 и Программа исследований и разработок CFF Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB) (Rowe19RO)] и Центр клинических и трансляционных наук UAB (грант NIH UL1TR001417).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Nasal brushMedical Packaging CYB1CYB-1Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette TipsThermoFisher Scientific02-707-141Large bore pipette tips
AccutaseThermoFisher ScientificA1110501Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTAGibco25300-054
Trypsin inhibitor from soybeanSigmaT6522Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrixCorning356255Extracellular matrix (EM)
µ-Slide AngiogenesisIbidi8150615-well slide
24-Well TranswellCorning7200154Culture insert
Chambered CoverglassThermoFisher Scientific1554098-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue AdhesiveThermoFisher Scientific354240Cell adhesive
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences50980487
Triton X-100Alfa AesarA16046
BSAThermoFisher ScientificBP1600-100
NucBlueThermoFisher ScientificR37605DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope)NikonInverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25NikonConfocal microscope
NIS Elements- Basic ResearchNikonmanual imaging analysis software
HistogelThermoFisher ScientificHG-4000-012
Disposable Base MoldsThermoFisher Scientific41-740
Lionheart FXBioTekBTLFXAutomated image system
Lionheart CoverBioTekBT1450009Environmental Control Lid
Humidity ChamberBioTekBT1450006Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2BioTekBT1210013Gas controller
Microplate/Slide Stage InsertBioTekBT1450527Slide holder
Gen5 Imaging Prime SoftwareBioTekBTGEN5IPRIMAutomated imaging analysis software
4x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320515
10x Phase Contrast ObjectiveBioTekBT1320516
LED CubeBioTekBT1225007
Filter Cube (DAPI)BioTekBT1225100DAPI
CFTRinh-172Selleck ChemicalsS7139
ForskolinSigmaF6886
IBMXSigmaI5879
Expansion Media
DMEMThermoFisher Scientific11965
F12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765
Fetal Bovine SerumThermoFisher Scientific 16140-071
Penicillin/StreptomycinThermoFisher Scientific 15-140-122
Cholera ToxinSigma C8052
Epidermal Growth Factor (EGF)ThermoFisher Scientific PHG0314
Hydrocortisone (HC)Sigma H0888
InsulinSigma I9278
AdenineSigma A2786
Y-27632Stemgent 04-0012-02
Antibiotic Media
CeftazidimeAlfa Aesar J66460-03
TobramycinAlfa Aesar J67340
VancomycinAlfa Aesar J67251
Amphotericin BSigma A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1)ThermoFisher Scientific 11330-32
Ultroser-GPall 15950-017
Fetal Clone IIHyclone SH30066.03
Bovine Brain ExtractLonza CC-4098
InsulinSigma I-9278
HydrocortisoneSigma H-0888
TriiodothyronineSigma T-6397
TransferrinSigma T-0665
EthanolamineSigma E-0135
EpinephrineSigmaE-4250
O-PhosphorylethanolamineSigmaP-0503
Retinoic AcidSigmaR-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibodyR&D SystemsMAB1660Dilution: 100x
ZO-1 antibodyThermo FisherMA3-39100-A647Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibodySigmaHPA008246Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulinSigmaT7451Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibodyAbcamAb11315Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488InvitrogenA21202Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594InvitrogenA21207Dilution: 2000x

Ссылки

  1. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  2. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  3. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
  4. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
  5. Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
  6. Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
  7. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  8. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  9. Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
  10. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
  11. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  12. Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
  13. Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
  14. Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  16. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  17. Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
  18. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  19. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  20. Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  23. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
  24. Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  25. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
  26. Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
  27. Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
  28. Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
  29. Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
  30. Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
  31. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
  32. Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
  33. McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
  34. Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
  35. Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
  36. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  37. Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator's Manual. , (2016).
  38. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  39. Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
  40. McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
  41. Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены