Hibridación de fluorescencia in situ interfásica de frotis de médula ósea de mieloma múltiple

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para mejorar el éxito de la detección de hibridación de fluorescencia in situ interfásica en frotis de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple.

Resumen

La detección de hibridación fluorescente in situ (FISH) es un método indispensable en la estratificación del riesgo genético en el mieloma múltiple (MM), que es una de las neoplasias hematológicas malignas más comunes. La característica identificativa de MM son las células plasmáticas malignas acumuladas en la médula ósea. Los informes FISH para MM se centran principalmente en células plasmáticas clonales purificadas o identificadas, en lugar de todas las células nucleadas, mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ o λ. Los núcleos de interfase de la médula ósea generalmente se obtienen de células frescas de la médula ósea. Sin embargo, el enriquecimiento satisfactorio de las muestras de células plasmáticas requiere grandes cantidades de médula ósea fresca anticoagulada con heparina, que no se puede obtener en el caso de una extracción difícil de la médula ósea o un grifo seco de médula ósea. Aquí, establecemos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH en frotis de médula ósea teñidos o no manchados. Los frotis de médula ósea son más fáciles de obtener que las muestras de médula ósea anticoaguladas.

Introducción

El mieloma múltiple (MM) es una enfermedad maligna de células plasmáticas (PC) con una fuerte heterogeneidad biológica y grandes diferencias individuales en la eficacia clínica, con períodos de supervivencia que van desde meses hasta décadas. Las características citogenéticas son importantes indicadores pronósticos de la MM. El sistema de estratificación del riesgo y los tratamientos individualizados basados en características genéticas se han convertido en temas de intenso interés en la investigación clínica sobre ^MM1. Las aberraciones de los PC probados en un panel de hibridación fluorescente in situ (FISH) de médula ósea (BM) incluyen del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) ganancia/amplificación y deleción 1p (CDKN2C).

La citogenética metafásica estándar debe incluirse en la evaluación inicial de los pacientes con MM. Aunque el cariotipo convencional con banda G ofrece el beneficio de un análisis cromosómico completo, el bajo rendimiento de este método conduce a muchos resultados falsos ^negativos2. Tradicionalmente, las PC han sido vistas como en gran medida incapaces de dividirse porque son los productos de la etapa final de la diferenciación de linfocitos B. Esto dificulta la obtención de imágenes divididas. La mejora del análisis citogenético en MM con cultivos a largo plazo (6 días) y la estimulación de cultivos por citoquinas pueden ser un método prometedor para identificar anomalías citogenéticas en pacientes con MM recién ^{diagnosticados3}. Sin embargo, incluso cuando el tiempo de cultivo se prolongó a 6 días, las anomalías citogenéticas se informaron con precisión en el 30%-50% de los pacientes con ^MM4. Además, la MM se caracteriza por aberraciones citogenéticas complejas que reflejan su heterogeneidad pronóstica. Sin embargo, la resolución de la tecnología tradicional de bandas cromosómicas es baja, lo que puede conducir fácilmente a la detección errónea de anomalías cromosómicas en MM.

La interfase FISH, preferiblemente después de la clasificación o marcado de PC basada en perlas magnéticas CD138 positivas con cadena ligera de inmunoglobulina citoplasmática κ/λ, es indispensable en el análisis de ^MM5,6. Se recomienda encarecidamente una muestra seleccionada CD138 positiva para el rendimiento optimizado de las células tumorales. Sin embargo, la cuantificación precisa de las aberraciones citogenéticas requiere al menos 4 ml de BM anticoagulado para la clasificación de PC. Además, las combinaciones de clasificación de perlas inmunomagnéticas CD138 con FISH o inmunoglobulina de cadena ligera citoplasmática κ/λ con pruebas FISH (cIg-FISH) aumentan numerosos costos experimentales y consumen mucho tiempo.

Por lo general, la relación de PC se evalúa primero a partir del examen morfológico de frotis de BM teñido o secciones de biopsia de ^BM7,8. Las muestras BM de la más alta calidad (primeras muestras de aspirado de médula) se utilizan para pruebas morfológicas, mientras que las enviadas para FISH u otra detección son a menudo las muestras de aspirado secundario con altas proporciones de dilución con sangre periférica.

Ya en la década de 1990, múltiples estudios demostraron que los frotis de BM se pueden usar directamente para los exámenes intersticiales de FISH, lo que ha demostrado ser un método confiable y ^repetible9. Un elegante estudio basado en la morfología celular y la citoquímica de la esterasa combinado con FISH de sangre periférica y frotis de BM confirmó su gran importancia clínica para dilucidar anomalías cromosómicas en pacientes con leucemia granulocítica y ^{linfocítica10}.

Aquí, proporcionamos un método novedoso para mejorar el éxito de la detección de FISH interfásico en pacientes con MM.

Protocolo

Este estudio se realizó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (No. 2019065). Los especímenes fueron recolectados de un paciente mm en el Departamento de Hematología del Hospital Zhongnan de la Universidad de Wuhan (China).

1. Preparación de los frotis de BM

1. Coloque los primeros 0,2 ml de solución de BM en un portaobjetos de vidrio desechable limpio.
2. Extienda las manchas de BM a un grosor uniforme con colas afiladas retirando rápidamente el BM. Luego, secar naturalmente.
3. Cubra las películas BM con 1 ml de solución Wright-Giemsa durante aproximadamente 10 s a temperatura ambiente.
4. Agregue 1 ml de tampón de fosfato a las diapositivas.
   NOTA: Tenga cuidado de evitar que la solución de tinte se seque o fluya de los portaobjetos.
5. Mezcle la solución de tinte suavemente y manténgala durante 15 minutos a temperatura ambiente.
6. Enjuague los toboganes con agua limpia y séquelos al aire a temperatura ambiente.
7. Utilice la microscopía de luz directa para detectar equipos malignos. Los PC deben estar bien dispersos.

2. Preprocesamiento fish de los frotis BM

1. Cubra el área hibridada con solución fijadora durante 10 minutos para decolorar y arreglar las PC.
   1. Para preparar una solución fijadora fresca, mezcle metanol con ácido acético glacial en una proporción de volumen de 3: 1.
2. Enjuague el portaobjetos con agua desionizada (_dH2O) y séquelo al aire a temperatura ambiente.
3. Precaliente un frasco que contenga 2 tampones SSC a 56 °C en un baño de agua. Diluya el búfer recién a 20 veces SSC antes de usarlo.
   1. Para preparar 20x SSC, mezcle bien 176 g de cloruro de sodio y 88 g de citrato de sodio con 800 ml de _dH2O. Mida el pH y ajuste a pH 5.3 ± 0.2. Luego, agregue _dH2O para llevar el volumen final a 1 L.
4. Lave el frotis de BM preparado en el tampón SSC 2x precalentado durante 10 minutos, seguido de sumergirlo en agua desionizada a temperatura ambiente.
5. Deshidratar el frotis en un gradiente de etanol (70%, 85% y 100% etanol, cada uno durante 1 min). Seque al aire el frotis durante 10 min.

3. BM untar FISH y lavado

NOTA: Todos los pasos se realizaron en una habitación oscura para evitar el enfriamiento de la fluorescencia.

1. Añadir la mezcla de sonda TP53/centrómero del cromosoma 17 (CEP17) al área de hibridación y cubrirla con un coverlip. Presione suavemente con pinzas de punta fina para eliminar las burbujas de aire de debajo.
2. Selle todos los lados de la cubierta con cemento de goma para garantizar una buena estanqueidad.
3. Después de la solidificación del cemento de goma, coloque la corredera en una máquina automática FISH. Realizar la desnaturalización a 78 °C durante 5 min, seguida de hibridación a 37 °C durante la noche.
4. Recoja la diapositiva de la máquina FISH. Use pinzas puntiagudas finas para quitar el cemento de goma suavemente.
5. Sumerja la corredera en 2x SSC a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 o 2 minutos para lavar la cubierta.
6. Lave el tobogán en un búfer NP-40 0.4x SSC / 0.3% 68 ° C precalentado en un baño de agua durante 2 min.
   1. Prepare la solución 0.4x SSC/0.3% NP-40 mezclando a fondo 20 mL de 20x SSC (pH 5.3) con 950 mL de _dH2O. Luego, agregue 3 ml de NP-40 y mezcle bien hasta que se disuelva por completo. Mida el pH y ajuste a 7.0-7.5 con NaOH. Luego, agregue _dH2O para llevar el volumen final de la solución total a 1 L.
7. Lave los toboganes con 2x SSC en un baño de agua de 37 °C durante 1 min. Coloque en posición vertical en la oscuridad para que se seque completamente durante 10 minutos.
8. Añadir 10 μL de DAPI al área hibridada y cubrir con una cubierta.

4. Análisis e imágenes fish

1. Vea la diapositiva hibridada utilizando un conjunto de filtros adecuado en un microscopio de fluorescencia.
2. Utilice un filtro óptico de fluoróforo azul monocromático para observar la intensidad de fluorescencia del núcleo celular. Tome imágenes del núcleo celular bajo un conjunto de filtros DAPI.
3. Use una sonda de centrómero cromosómico para mostrar cuántos cromosomas contiene una célula. Etiquete CEP17 con fluorescencia verde. Utilice un filtro óptico de fluoróforo verde de espectro para observar la ubicación de CEP17. Tome una imagen de señales CEP17 debajo del conjunto de filtros verdes.
4. Etiquete el gen TP53 con fluorescencia naranja. Utilice un filtro óptico de fluoróforo naranja de espectro para observar TP53. Tome una imagen de señales TP53 debajo de este conjunto.
5. Combine estas tres imágenes y examínelas en busca de anomalías numéricas.
   NOTA: En una célula interfase normal, se observan dos señales naranjas y dos verdes dentro de un núcleo con fluorescencia azul, lo que indica un par de cromosomas 17 normales (Figura 1).

Resultados

En la evaluación morfológica inicial de un paciente MM recién diagnosticado, se encontró que el 15% de los PC en un frotis de BM tenían núcleos más grandes y oscuros junto con mayores cantidades de citoplasma que los PC normales (Figura 2A). El primer tubo de BM anticoagulante de heparina detectado por la técnica del inmunofenotipo reveló solo el 2,3% de los PC aberrantes monoclonales. La clasificación inmunomagnética de perlas CD138 en combinación con FISH o la técnica cIg-FISH...

Discusión

La aplicación de FISH a la estratificación del riesgo genético en MM es esencial. La parte crítica de los informes fish no son todas las células nucleadas, sino los PC clonales específicamente purificados o identificados mediante la clasificación con perlas magnéticas anti-CD138 o el marcado con inmunoglobulina citoplasmática de cadena ligera κ o λ. Se encontró que la interfase FISH después de la clasificación de PC o cIg-FISH era significativa en el diagnóstico de MM debido a la proporción relativamente ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic FISH machine	Leica  Corporation	S500-24	FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI	Abbott Molecular Inc.	06J49-001	DAPI Counterstain
FISH Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	FISH Analysis Software
FISH Probe	Abbott Molecular Inc.	05N56-020	Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Fixed volume pipette	Eppendorf China Ltd.	M33768H	10  microliter
Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	BX53	Forward Fluorescence Microscope
Karyotype Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	Karyotype Analysis Software
Light Microscope	Olympus  Corporation	BX41	Forward Light Microscope
NP-40	Abbott Molecular Inc.	07J05-001	NP-40
Plastic staining dyeing rack	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-501	24 slides
Plastic staining dyeing tank	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-516	24 slides
Rubber Cement	Marabu GmbH & Co. KG	FixoGum	Rubber Cement
SSC	Abbott Molecular Inc.	02J10-032	20×SSC
Water bath	Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Multiple Temperature Water bath