Ibridazione in situ a fluorescenza interfase di strisci di midollo osseo di mieloma multiplo

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per migliorare il successo del rilevamento dell'ibridazione in situ a fluorescenza interfase su strisci di midollo osseo da pazienti con mieloma multiplo.

Abstract

Il rilevamento dell'ibridazione fluorescente in situ (FISH) è un metodo indispensabile nella stratificazione del rischio genetico nel mieloma multiplo (MM), che è una delle neoplasie ematologiche più comuni. La caratteristica identificativa del MM è l'accumulo di plasmacellule maligne nel midollo osseo. I rapporti FISH per MM si concentrano principalmente sulle plasmacellule clonali purificate o identificate, piuttosto che su tutte le cellule nucleate, ordinando con perline magnetiche anti-CD138 o marcando con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. I nuclei interfasici del midollo osseo sono solitamente ottenuti da cellule fresche del midollo osseo. Tuttavia, un arricchimento soddisfacente dei campioni di plasmacellule richiede grandi quantità di eparina fresca anticoagulato, che non può essere ottenuta in caso di estrazione difficile del midollo osseo o di un rubinetto secco del midollo osseo. Qui, stabiliamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH su strisci di midollo osseo macchiati o non macchiati. Gli strisci di midollo osseo sono più facili da ottenere rispetto ai campioni di midollo osseo anticoagulato.

Introduzione

Il mieloma multiplo (MM) è una malattia maligna delle plasmacellule (PC) con forte eterogeneità biologica e grandi differenze individuali nell'efficacia clinica, con periodi di sopravvivenza che vanno da mesi a decenni. Le caratteristiche citogenetiche sono importanti indicatori prognostici del MM. Il sistema di stratificazione del rischio e i trattamenti individualizzati basati su caratteristiche genetiche sono diventati argomenti di intenso interesse nella ricerca clinica sulla ^MM1. Le aberrazioni dei PC testati in un pannello di ibridazione fluorescente in situ (FISH) di midollo osseo (BM) includono del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification e 1p (CDKN2C) deletion.

La citogenetica standard delle metafasi deve essere inclusa nella valutazione iniziale dei pazienti con MM. Sebbene il cariotipo convenzionale a banda G offra il vantaggio di un'analisi dell'intero cromosoma, la bassa resa di questo metodo porta a molti risultati falsi ^negativi2. Tradizionalmente, i PC sono stati visti come in gran parte incapaci di scissione perché sono i prodotti allo stadio terminale della differenziazione dei linfociti B. Ciò rende difficile ottenere immagini divise. Una migliore analisi citogenetica nel MM con colture a lungo termine (6 giorni) e la stimolazione delle colture da parte delle citochine possono essere un metodo promettente per identificare le anomalie citogenetiche nei pazienti con MM di nuova ^diagnosi3. Anche quando il tempo di coltura è stato prolungato a 6 giorni, tuttavia, le anomalie citogenetiche sono state accuratamente riportate nel 30%-50% dei pazienti con ^MM4. Inoltre, il MM è caratterizzato da aberrazioni citogenetiche complesse che riflettono la sua eterogeneità prognostica. Tuttavia, la risoluzione della tradizionale tecnologia di banding cromosomico è bassa, il che può facilmente portare alla mancata rilevazione di anomalie cromosomiche nel MM.

La FISH interfase, preferibilmente dopo smistamento o marcatura con PC a base di perline magnetiche CD138-positive con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ/λ, è indispensabile nell'analisi di ^MM5,6. Un campione selezionato CD138-positivo è fortemente raccomandato per la resa ottimizzata delle cellule tumorali. Tuttavia, una quantificazione accurata delle aberrazioni citogenetiche richiede almeno 4 ml di BM anticoagulato per lo smistamento del PC. Inoltre, le combinazioni di SMistamento immunomagnetico delle perline CD138 con FISH o immunoglobuline citoplasmatiche a catena leggera κ/λ con test FISH (cIg-FISH) aumentano numerosi costi sperimentali e richiedono molto tempo.

Di solito, il rapporto PC viene prima valutato dall'esame morfologico di strisci bm colorati o sezioni di biopsia ^BM7,8. I campioni di BM di altissima qualità (campioni di primo aspirato di midollo) vengono utilizzati per i test morfologici, mentre quelli inviati per FISH o altra rilevazione sono spesso i campioni di aspirato secondario con alti rapporti di diluizione con sangue periferico.

Già nel 1990, diversi studi hanno dimostrato che gli strisci BM possono essere utilizzati direttamente per gli esami FISH interstiziali, che ha dimostrato di essere un metodo affidabile e ^ripetibile9. Un elegante studio basato sulla morfologia cellulare e sulla citochimica dell'esterasi combinato con FISH di sangue periferico e strisci bm ha confermato il suo grande significato clinico per chiarire le anomalie cromosomiche in pazienti con leucemia granulocitica e ^{linfocitica10}.

Qui forniamo un nuovo metodo per migliorare il successo del rilevamento FISH interfase nei pazienti con MM.

Protocollo

Questo studio è stato condotto secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Zhongnan dell'Università di Wuhan (n. 2019065). I campioni sono stati raccolti da un paziente di MM nel Dipartimento di Ematologia, Zhongnan Hospital dell'Università di Wuhan (Cina).

1. Preparazione degli strisci BM

1. Posizionare i primi 0,2 ml di soluzione bm su un vetrino monouso pulito.
2. Distribuire le strisce BM a spessore uniforme con code affilate rimuovendo rapidamente il BM. Quindi, asciugare naturalmente.
3. Coprire i film BM con 1 mL di soluzione Wright-Giemsa per circa 10 s a temperatura ambiente.
4. Aggiungere 1 mL di tampone fosfato ai vetrini.
   NOTA: Fare attenzione a evitare che la soluzione colorante si secchi o scorra via dai vetrini.
5. Mescolare delicatamente la soluzione colorante e mantenerla per 15 minuti a temperatura ambiente.
6. Risciacquare i vetrini con acqua pulita e asciugarli all'aria a temperatura ambiente.
7. Utilizzare la microscopia a luce diretta per rilevare PC maligni. I PC dovrebbero essere ben dispersi.

2. PRE-elaborazione FISH degli strisci BM

1. Coprire l'area ibridata con una soluzione fissativa per 10 minuti per scolorire e fissare i PC.
   1. Per preparare una soluzione fissativa fresca, mescolare metanolo con acido acetico glaciale in un rapporto di volume di 3: 1.
2. Risciacquare il vetrino con acqua deionizzata (_dH2O) e asciugarlo all'aria a temperatura ambiente.
3. Preriscaldare un barattolo contenente 2 tamponi SSC a 56 °C a bagnomaria. Diluire nuovamente il buffer a 20x SSC prima dell'uso.
   1. Per preparare 20x SSC, mescolare accuratamente 176 g di cloruro di sodio e 88 g di citrato di sodio con 800 mL di _dH2O. Misurare il pH e regolare a pH 5,3 ± 0,2. Quindi, aggiungere _dH2O per portare il volume finale a 1 L.
4. Lavare lo striscio BM preparato nel tampone SSC 2x preriscaldato per 10 minuti, quindi immergerlo in acqua deionizzata a temperatura ambiente.
5. Disidratare lo striscio in un gradiente di etanolo (70%, 85% e 100% di etanolo, ciascuno per 1 minuto). Asciugare all'aria lo striscio per 10 minuti.

3. BM striscio FISH e lavaggio

NOTA: tutti i passaggi sono stati eseguiti in una stanza buia per evitare la tempra della fluorescenza.

1. Aggiungere la miscela di sonda TP53/centromero del cromosoma 17 (CEP17) all'area di ibridazione e coprirla con un coverslip. Premere delicatamente con una pinzetta a punta fine per rimuovere le bolle d'aria da sotto.
2. Sigillare tutti i lati del coperchio con cemento di gomma per garantire una buona tenuta.
3. Dopo la solidificazione del cemento di gomma, posizionare il vetrino su una macchina FISH automatica. Eseguire la denaturazione a 78 °C per 5 minuti, seguita dall'ibridazione a 37 °C durante la notte.
4. Prelevare lo scivolo dalla macchina FISH. Utilizzare pinzette a punta fine per rimuovere delicatamente il cemento di gomma.
5. Immergere la diapositiva in 2x SSC a temperatura ambiente per circa 1 o 2 minuti per lavare via il coperchio.
6. Lavare il vetrino in tampone 68 °C preriscaldato 0,4x SSC/0,3% NP-40 a bagnomaria per 2 min.
   1. Preparare 0,4x SSC/0,3% NP-40 soluzione mescolando accuratamente 20 mL di 20x SSC (pH 5,3) con 950 mL di _dH2O. Quindi, aggiungere 3 ml di NP-40 e mescolare accuratamente fino a completa dissoluzione. Misurare il pH e regolare a 7,0-7,5 con NaOH. Quindi, aggiungere _dH2O per portare il volume finale della soluzione totale a 1 L.
7. Lavare i vetrini con 2x SSC a bagnomaria a 37 °C per 1 min. Mettere in posizione verticale al buio per asciugare accuratamente per 10 minuti.
8. Aggiungere 10 μL di DAPI all'area ibridata e coprire con un coverslip.

4. Analisi e imaging FISH

1. Visualizza il vetrino ibridato utilizzando un filtro adatto impostato su un microscopio a fluorescenza.
2. Utilizzare un filtro ottico monocromatico blu fluoroforo per osservare l'intensità di fluorescenza del nucleo cellulare. Acquisire immagini del nucleo cellulare in un set di filtri DAPI.
3. Utilizzare una sonda centromerale cromosomica per mostrare quanti cromosomi contiene una cellula. Etichetta CEP17 con fluorescenza verde. Utilizzare un filtro ottico a fluoroforo verde spettro per osservare la posizione di CEP17. Scatta un'immagine dei segnali CEP17 sotto il set di filtri verdi.
4. Etichettare il gene TP53 con fluorescenza arancione. Utilizzare un filtro ottico al fluoroforo arancione a spettro per osservare TP53. Scatta un'immagine dei segnali TP53 sotto questo set.
5. Unisci queste tre immagini ed esaminale per verificare la presenza di anomalie numeriche.
   NOTA: In una normale cellula interfase, due segnali arancioni e due verdi sono osservati all'interno di un nucleo con fluorescenza blu, indicando una coppia di cromosoma 17 normale (Figura 1).

Risultati

Nella valutazione morfologica iniziale di un paziente con MM di nuova diagnosi, il 15% dei PC in uno striscio di BM è risultato avere nuclei più grandi e più scuri insieme a quantità maggiori di citoplasma rispetto ai normali PC (Figura 2A). Il primo tubo di BM anticoagulato di eparina rilevato con la tecnica dell'immunofenotipo ha rivelato solo il 2,3% dei PC monoclonali aberranti. Lo smistamento immunomagnetico delle perline CD138 in combinazione con FISH o la tecnica cIg-FISH è essen...

Discussione

L'applicazione della FISH alla stratificazione del rischio genetico nel MM è essenziale. La parte critica dei rapporti FISH non sono tutte le cellule nucleate, ma i PC clonali specificamente purificati o identificati mediante smistamento con perline magnetiche anti-CD138 o marcatura con catena leggera di immunoglobuline citoplasmatiche κ o λ. Interphase FISH dopo LO SMISTAMENTO PC o cIg-FISH è risultato significativo nella diagnosi di MM a causa della percentuale relativamente inferiore di PC nel BM. Tuttavia, questi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic FISH machine	Leica  Corporation	S500-24	FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI	Abbott Molecular Inc.	06J49-001	DAPI Counterstain
FISH Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	FISH Analysis Software
FISH Probe	Abbott Molecular Inc.	05N56-020	Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Fixed volume pipette	Eppendorf China Ltd.	M33768H	10  microliter
Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	BX53	Forward Fluorescence Microscope
Karyotype Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	Karyotype Analysis Software
Light Microscope	Olympus  Corporation	BX41	Forward Light Microscope
NP-40	Abbott Molecular Inc.	07J05-001	NP-40
Plastic staining dyeing rack	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-501	24 slides
Plastic staining dyeing tank	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-516	24 slides
Rubber Cement	Marabu GmbH & Co. KG	FixoGum	Rubber Cement
SSC	Abbott Molecular Inc.	02J10-032	20×SSC
Water bath	Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Multiple Temperature Water bath