פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור ההצלחה של פלואורסצנטיות בין פאזית בזיהוי הכלאה במקום על מריחות מח עצם מחולי מיאלומה נפוצים.

Abstract

פלואורסצנטיות בזיהוי הכלאה במקום (FISH) היא שיטה הכרחית בריבוד סיכונים גנטיים במיאלומה נפוצה (MM), שהיא אחת ממאירות המטולוגיות הנפוצות ביותר. המאפיין המזהה של MM מצטבר תאי פלזמה ממאירים במח העצם. דוחות דגים עבור MM מתמקדים בעיקר בתאי פלזמה קלונליים מטוהרים או מזוהים, ולא בכל התאים הגרעינים, על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. גרעינים אינטרפאזי מח עצם מתקבלים בדרך כלל מתאי מח עצם טריים. עם זאת, העשרה משביעת רצון של דגימות תאי פלזמה דורשת כמויות גדולות של מח עצם טרי נגד מח עצם, אשר לא ניתן להשיג במקרה של מיצוי מח עצם קשה או ברז יבש מח עצם. בזאת, אנו מקימים שיטה חדשנית כדי לשפר את ההצלחה של זיהוי דגים על כתמי מח עצם מוכתמים או לא מוכתמים. כתמי מח עצם קלים יותר להשגה מאשר דגימות מח עצם נוגדות קרישה.

Introduction

מיאלומה נפוצה (MM) היא מחלת תאי פלזמה ממאירים (PC) עם הטרוגניות ביולוגית חזקה והבדלים אישיים גדולים ביעילות קלינית, עם תקופות הישרדות הנעות בין חודשים לעשורים. מאפיינים ציטוגנטיים הם אינדיקטורים פרוגנוסטיים חשובים של MM. מערכת ריבוד הסיכון וטיפולים מותאמים אישית המבוססים על מאפיינים גנטיים הפכו לנושאים בעלי עניין רב במחקר קליני על ^MM1. הסטיות של מחשבים שנבדקו בפלואורסצנטיות בלוח היברידיזציה של סיטו (FISH) של מח העצם (BM) כוללות דל 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t (14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) רווח/הגברה, ומחיקת 1p (CDKN2C).

ציטוגנטיקה מטפאזה סטנדרטית צריכה להיכלל בהערכה הראשונית של חולי MM. למרות kryotyping רגיל G-פס מציע את היתרון של ניתוח כרומוזום שלם, התשואה הנמוכה של שיטה זו מובילה לתוצאות שליליות כוזבות ^רבות2. באופן מסורתי, מחשבים נתפסו כבלתי מסוגלים במידה רבה לפיצול מכיוון שהם המוצרים הסופיים של בידול לימפוציטים B. הדבר מקשה על השגת תמונות מפוצלות. ניתוח ציטוגנטי משופר ב- MM עם תרביות לטווח ארוך (6 ימים) וגירוי של תרבויות על ידי ציטוקינים עשוי להיות שיטה מבטיחה לזיהוי חריגות ציטוגנטיות בחולי MM שאובחנו ^{לאחרונה3}. גם כאשר זמן התרבות היה ממושך עד 6 ימים, עם זאת, חריגות ציטוגנטיות דווחו במדויק ב 30%-50% של חולי ^MM4. יתר על כן, MM מאופיין בסטיות ציטוגנטיות מורכבות המשקפות את ההטרוגניות הפרוגנוסטית שלו. עם זאת, הרזולוציה של טכנולוגיית פסים כרומוזום מסורתית היא נמוכה, אשר עלול בקלות להוביל לזיהוי חסר של חריגות כרומוזומלי ב- MM.

דג אינטרפאזה, רצוי לאחר CD138-חיובי חרוז מגנטי מבוסס מיון מחשב או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין cytoplasmic κ/λ, הוא הכרחי בניתוח של ^MM5,6. מדגם נבחר CD138 חיובי מומלץ מאוד עבור התשואה הממוטבת של תאים סרטניים. עם זאת, כמות מדויקת של סטיות ציטוגנטיות דורשת לפחות 4 מ"ל של BM אנטי-קולוגי למיון מחשב. בנוסף, השילובים של מיון חרוזים אימונומגנטיים CD138 עם FISH או אימונוגלובולין שרשרת אור ציטופלסמית κ /λ עם בדיקות דגים (cIg-FISH) להגדיל עלויות ניסיוניות רבות והם גוזלים זמן רב.

בדרך כלל, יחס המחשב מוערך תחילה מהבדיקה המורפולוגית של מריחות BM מוכתמות או מקטעי ביופסיה ^BM7,8. דגימות BM באיכות הגבוהה ביותר (דגימות שאיפה של מח ראשון) משמשות לבדיקות מורפולוגיות, ואילו אלה שנשלחו לדוג או לגילוי אחר הן לעתים קרובות דגימות שאיפה משניות עם יחס גבוה של דילול עם דם היקפי.

כבר בשנות ה-90 של המאה ה-20, מחקרים רבים הראו כי מריחות BM יכולות לשמש ישירות לבדיקות דגים ביניים, שהוכיחו את עצמן כשיטה אמינה וניתן לחזור ^עליהן9. מחקר אלגנטי המבוסס על מורפולוגיה של תאים וציטוכימיה אסטראז בשילוב עם FISH של דם היקפי וכתמי BM אישר את המשמעות הקלינית הגדולה שלו להבהרת חריגות כרומוזומליות בחולים עם לוקמיה גרנולוציטית ^{ולימפוציטית10}.

להלן, אנו מספקים שיטה חדשנית לשיפור ההצלחה של זיהוי דגים interphase בחולי MM.

Protocol

מחקר זה נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה של בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (מס ' 2019065). הדגימות נאספו מחולה MM במחלקה להמטולוגיה, בית החולים דז'ונגנן של אוניברסיטת ווהאן (סין).

1. הכנת מריחות BM

1. מניחים את פתרון ה-0.2 מ"ל הראשון של BM על מגלשת זכוכית חד פעמית נקייה.
2. מורחים את כתמי BM לעובי אחיד עם זנבות חדים על ידי הסרה מהירה של ה- BM. לאחר מכן, יבש באופן טבעי.
3. לכסות את סרטי BM עם 1 מ"ל של פתרון רייט-Giemsa עבור כ 10 שניות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף 1 מ"ל של מאגר פוספט לשקופיות.
   הערה: יש להקפיד למנוע מתמיסת הצבע להתייבש או לזרום מהמגלשות.
5. מערבבים את תמיסת הצבע בעדינות ושומרים עליה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שוטפים את המגלשות במים נקיים ומייבשים אותן באוויר בטמפרטורת החדר.
7. השתמש במיקרוסקופיה של אור קדמי כדי לזהות מחשבים ממאירים. המחשבים צריכים להיות מפוזרים היטב.

2. דגים טרום עיבוד של כתמי BM

1. לכסות את האזור ההיברידי עם פתרון קבוע במשך 10 דקות כדי לשנות צבע ולתקן את המחשבים.
   1. להכנת פתרון קבוע טרי, יש לערבב מתנול עם חומצה אצטית קרחונית ביחס נפח של 3:1.
2. שטפו את המגלשה במים שעברו דה-יוניזציה (_dH2O) וייבשו אותה באוויר בטמפרטורת החדר.
3. מחממים צנצנת המכילה 2x SSC חוצץ עד 56 °C (56 °F) באמבט מים. יש לדלל את המאגר ל-20x SSC לפני השימוש.
   1. כדי להכין 20x SSC, לערבב ביסודיות 176 גרם של נתרן כלורי ו 88 גרם של נתרן ציטראט עם 800 מ"ל של _dH2O. למדוד את ה- pH ולהתאים ל- pH 5.3 ± 0.2. לאחר מכן, הוסף _dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי ל- 1 L.
4. לשטוף את משטח BM מוכן במאגר 2x SSC שחומם מראש במשך 10 דקות, ואחריו לטבול אותו לתוך מים deionized בטמפרטורת החדר.
5. מייבשים את המריחה בשיפוע אתנול (70%, 85%, ו-100% אתנול, כל אחד למשך דקה אחת). מייבשים את ההמרחה במשך 10 דקות.

3. BM למרוח דגים ושטיפה

הערה: כל השלבים בוצעו בחדר חשוך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.

1. הוסף את תערובת הבדיקה TP53/centromere של כרומוזום 17 (CEP17) לאזור ההיברידיות וכסה אותה בהחלקת כיסוי. לחץ בעדינות עם פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר בועות אוויר מלמטה.
2. לאטום את כל הצדדים של כיסוי כיסוי עם מלט גומי כדי להבטיח הידוק טוב.
3. לאחר התגבשות של מלט הגומי, מניחים את השקופית על מכונת FISH אוטומטית. בצע denaturation ב 78 °C (78 °F) במשך 5 דקות, ואחריו הכלאה ב 37 °C (50 °F) לילה.
4. תרים את השקופית ממכונת הדגים. השתמש פינצטה מחודדת עדינה כדי להסיר את מלט הגומי בעדינות.
5. יש לטבול את המגלשה ב-2x SSC בטמפרטורת החדר למשך כדקה או שתיים כדי לשטוף את המכסה.
6. לשטוף את השקופית ב 68 °C (68 °C) מחומם מראש 0.4x SSC / 0.3% NP-40 חוצץ באמבט מים במשך 2 דקות.
   1. הכן פתרון 0.4x SSC/0.3% NP-40 על ידי ערבוב יסודי של 20 מ"ל של 20x SSC (pH 5.3) עם 950 מ"ל של _dH2O. לאחר מכן, מוסיפים 3 מ"ל של NP-40 ומערבבים היטב עד להמסה מלאה. מדוד את ה- pH והתאם ל- 7.0-7.5 עם NaOH. לאחר מכן, הוסף _dH2O כדי להביא את אמצעי האחסון הסופי של הפתרון הכולל ל- 1 L.
7. לשטוף את השקופיות עם 2x SSC באמבט מים 37 °C (37 °F) במשך 1 דקות. מוגדר זקוף בחושך להתייבש ביסודיות במשך 10 דקות.
8. הוסף 10 μL של DAPI לאזור ההיברידי וכסה עם כיסוי.

4. ניתוח הדגים והדמיה

1. הצג את השקופית ההיברידית באמצעות ערכת מסננים מתאימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
2. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כחול מונוכרומטי כדי לבחון את עוצמת הפלואורסצנטיות של גרעין התא. קח תמונות גרעין תא תחת ערכת מסננים של DAPI.
3. השתמש בבדיקת צנטרומר כרומוזום כדי להראות כמה כרומוזומים תא מכיל. תווית CEP17 עם פלואורסצנטיות ירוקה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור ירוק ספקטרום כדי לבחון את המיקום של CEP17. צלמו תמונת אותות CEP17 מתחת לערכת המסננים הירוקה.
4. סמן את הגן TP53 בפלואורסצנטיות כתומה. השתמש במסנן אופטי פלואורופור כתום ספקטרום כדי לצפות TP53. קח תמונת אותות TP53 מתחת לערכה זו.
5. מזג את שלוש התמונות הללו ובחן אותן לאיתור חריגות מספריות.
   הערה: בתא בין-פאזי רגיל, שני אותות כתומים ושני אותות ירוקים נצפים בתוך גרעין עם פלואורסצנטיות כחולה, המציינים זוג אחד של כרומוזום 17 רגיל (איור 1).

תוצאות

בהערכה המורפולוגית הראשונית של חולה MM שאובחן לאחרונה, 15% מהמחשבים במריחת BM נמצאו בעלי גרעינים גדולים וכהים יותר יחד עם כמויות גדולות יותר של ציטופלסמה ממחשבים רגילים (איור 2A). הצינור הראשון של BM אנטי-קרישה הפרין שזוהה על ידי טכניקת אימונופנוטיפ חשף רק 2.3% מהמחשבים החריגים ח?...

Discussion

היישום של דגים לריבוד סיכון גנטי ב- MM הוא חיוני. החלק הקריטי של דוחות FISH הוא לא כל התאים הגרעינים, אבל מחשבים קלונליים מטוהרים או מזוהים במיוחד על ידי מיון עם חרוזים מגנטיים נגד CD138 או סימון עם שרשרת אור אימונוגלובולין ציטופלסמית κ או λ. אינטרפאזה FISH לאחר מיון מחשב או cIg-FISH נמצאה משמעותית באב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic FISH machine	Leica  Corporation	S500-24	FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI	Abbott Molecular Inc.	06J49-001	DAPI Counterstain
FISH Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	FISH Analysis Software
FISH Probe	Abbott Molecular Inc.	05N56-020	Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Fixed volume pipette	Eppendorf China Ltd.	M33768H	10  microliter
Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	BX53	Forward Fluorescence Microscope
Karyotype Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	Karyotype Analysis Software
Light Microscope	Olympus  Corporation	BX41	Forward Light Microscope
NP-40	Abbott Molecular Inc.	07J05-001	NP-40
Plastic staining dyeing rack	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-501	24 slides
Plastic staining dyeing tank	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-516	24 slides
Rubber Cement	Marabu GmbH & Co. KG	FixoGum	Rubber Cement
SSC	Abbott Molecular Inc.	02J10-032	20×SSC
Water bath	Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Multiple Temperature Water bath