Fluorescence interphasique hybridation in situ des frottis de moelle osseuse du myélome multiple

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour améliorer le succès de la détection de l’hybridation in situ par fluorescence interphasique sur les frottis de moelle osseuse de patients atteints de myélome multiple.

Résumé

La détection de l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) est une méthode indispensable dans la stratification du risque génétique dans le myélome multiple (MM), qui est l’une des tumeurs malignes hématologiques les plus courantes. La caractéristique d’identification du MM est l’accumulation de plasmocytes malins dans la moelle osseuse. Les rapports FISH pour MM se concentrent principalement sur les plasmocytes clonaux purifiés ou identifiés, plutôt que sur toutes les cellules nucléées, en triant avec des billes magnétiques anti-CD138 ou en marquant avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. Les noyaux interphasiques de la moelle osseuse sont généralement obtenus à partir de cellules fraîches de la moelle osseuse. Cependant, un enrichissement satisfaisant des échantillons de plasmocytes nécessite de grandes quantités de moelle osseuse fraîche anti-coagulée à l’héparine, ce qui ne peut être obtenu en cas d’extraction difficile de la moelle osseuse ou d’un robinet sec de moelle osseuse. Ici, nous établissons une nouvelle méthode pour améliorer le succès de la détection de FISH sur les frottis de moelle osseuse colorés ou non colorés. Les frottis de moelle osseuse sont plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulés.

Introduction

Le myélome multiple (MM) est une maladie maligne à plasmocytes (PC) avec une forte hétérogénéité biologique et de grandes différences individuelles dans l’efficacité clinique, avec des périodes de survie allant de mois à des décennies. Les caractéristiques cytogénétiques sont des indicateurs pronostiques importants de la MM. Le système de stratification des risques et les traitements individualisés basés sur les caractéristiques génétiques sont devenus des sujets d’intérêt intense dans la recherche clinique sur le ^MM1. Les aberrations des PC testés dans un panel d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) de moelle osseuse (BM) compre....

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (n° 2019065). Les échantillons ont été prélevés sur un patient MM du département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan (Chine).

1. Préparation des frottis BM

1. Placez les premiers 0,2 mL de solution BM sur une lame de verre jetable propre.
2. Étalez les frottis BM à une épaisseur uniforme avec des queues pointues en retirant rapidement le BM. Ensuite, séchez naturellement.
3. Couvrir les films BM avec 1 mL de solution ....

Résultats

Lors de l’évaluation morphologique initiale d’un patient atteint de MM nouvellement diagnostiqué, 15 % des PC d’un frottis de BM présentaient des noyaux plus gros et plus sombres ainsi que de plus grandes quantités de cytoplasme que les PC normaux (Figure 2A). Le premier tube de BM anti-coagulé à l’héparine détecté par la technique de l’immunophénotype n’a révélé que 2,3% des PC aberrants monoclonaux. Le tri immunomagnétique des billes CD138 en combinaison avec FISH.......

Discussion

L’application de FISH à la stratification des risques génétiques dans le MM est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les PC clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une chaîne légère d’immunoglobuline cytoplasmique κ ou λ. L’interphase FISH après le tri PC ou cIg-FISH s’est avérée significative dans le diagnostic de MM en raison de la proportion relativement plus faible.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
automatic FISH machine	Leica  Corporation	S500-24	FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPI	Abbott Molecular Inc.	06J49-001	DAPI Counterstain
FISH Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	FISH Analysis Software
FISH Probe	Abbott Molecular Inc.	05N56-020	Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Fixed volume pipette	Eppendorf China Ltd.	M33768H	10  microliter
Fluorescence Microscope	Olympus Corporation	BX53	Forward Fluorescence Microscope
Karyotype Analysis Software	IMSTAR  Corporation	IMSTAR	Karyotype Analysis Software
Light Microscope	Olympus  Corporation	BX41	Forward Light Microscope
NP-40	Abbott Molecular Inc.	07J05-001	NP-40
Plastic staining dyeing rack	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-501	24 slides
Plastic staining dyeing tank	Guangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.	RSJ-516	24 slides
Rubber Cement	Marabu GmbH & Co. KG	FixoGum	Rubber Cement
SSC	Abbott Molecular Inc.	02J10-032	20×SSC
Water bath	Shanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.	DK-8D	Multiple Temperature Water bath