Modelo de lesión por puñalada del Tectum óptico adulto utilizando pez cebra y medaka para el análisis comparativo de la capacidad regenerativa

Resumen

Se describe un modelo mecánico de lesión cerebral en el pez cebra adulto para investigar los mecanismos moleculares que regulan su alta capacidad regenerativa. El método explica crear una lesión por arma blanca en el tectum óptico de múltiples especies de peces pequeños para evaluar las respuestas regenerativas utilizando inmunotinción fluorescente.

Resumen

Mientras que el pez cebra tiene una capacidad superior para regenerar su sistema nervioso central (SNC), la medaka tiene una menor capacidad regenerativa del SNC. Se desarrolló un modelo de lesión cerebral en el tectum óptico adulto de pez cebra y medaka y se realizaron análisis histológicos y moleculares comparativos para dilucidar los mecanismos moleculares que regulan la alta capacidad regenerativa de este tejido en estas especies de peces. Aquí se presenta un modelo de lesión por arma blanca para el tectum óptico adulto utilizando una aguja y análisis histológicos para la proliferación y diferenciación de las células madre neurales (NSC). Se insertó manualmente una aguja en la región central del tectum óptico, y luego los peces fueron perfundidos intracárdicamente y sus cerebros fueron disecados. Estos tejidos se crioseccionaron y evaluaron mediante inmunotinción contra los marcadores apropiados de proliferación y diferenciación de NSC. Este modelo de lesión tectum proporciona resultados robustos y reproducibles tanto en pez cebra como en medaka, lo que permite comparar las respuestas NSC después de la lesión. Este método está disponible para teleósteos pequeños, incluidos el pez cebra, la medaka y el killi africano, y nos permite comparar su capacidad regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.

Introducción

El pez cebra (Danio rerio) tiene una mayor capacidad para regenerar su sistema nervioso central (SNC) en comparación con otros mamíferos ^1,2,3. Recientemente, para comprender mejor los mecanismos moleculares subyacentes a esta mayor capacidad regenerativa, se han realizado análisis comparativos de la regeneración tisular utilizando tecnología de secuenciación de próxima generación ^4,5,6. Las estructuras cerebrales en el pez cebra y tetrápodos son bastante diferentes ^7,8,9. Esto significa que se han desarrollado varios modelos de lesión cerebral utilizando peces pequeños con estructuras cerebrales y características biológicas similares para facilitar la investigación de los mecanismos moleculares subyacentes que contribuyen a esta mayor capacidad regenerativa.

Además, la medaka (Oryzias latipes) es un animal de laboratorio popular con una baja capacidad de regeneración cardíaca y neuronal^10,11,12,13 en comparación con el pez cebra. El pez cebra y la medaka tienen estructuras cerebrales y nichos similares para las células madre neurales adultas (NSC)^14,15,16,17. En el pez cebra y la medaka, el tectum óptico incluye dos tipos de NSC, células madre neuroepiteliales y células gliales radiales (CGR)^15,18. Previamente se desarrolló una herida por arma blanca para el tectum óptico del pez cebra adulto, y este modelo fue utilizado para investigar los mecanismos moleculares que regulan la regeneración cerebral en estos animales 19,20,21,22,23. Este modelo de lesión por herida de puñalada de pez cebra adulto joven indujo neurogénesis regenerativa a partir de CGR 19,24,25. Esta herida por arma blanca en el tectum óptico es un método robusto y reproducible 13,19,20,21,22,23,24,25. Cuando se aplicó el mismo modelo de lesión a la medaka adulta, la baja capacidad neurogénica de las CGR en el tectum óptico de la medaka se reveló a través del análisis comparativo de la proliferación y diferenciación de las CGR después de la lesión¹³.

Los modelos de lesión por arma blanca en el tectum óptico también se han desarrollado en modelos de mummichog²⁶, pero los detalles de la lesión del tectum no han sido bien documentados en comparación con la lesión telencefálica²⁷. La lesión por arma blanca en el tectum óptico utilizando pez cebra y medaka permite investigar las respuestas celulares diferenciales y la expresión génica entre especies con capacidad regenerativa diferencial. Este protocolo describe cómo realizar una lesión por arma blanca en el tectum óptico con una aguja de inyección. Este método se puede aplicar a peces pequeños como el pez cebra y la medaka. Aquí se explican los procesos de preparación de muestras para análisis histológico y análisis de proliferación y diferenciación celular mediante inmunohistoquímica fluorescente y criosecciones.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada. El pez cebra y la medaka se mantuvieron de acuerdo con los procedimientos estándar²⁸.

1. Herida por arma blanca en el tectum óptico adulto

1. Prepare una solución madre de tricaína al 0,4% (p/v) para la anestesia. Para una solución madre de 100 ml, disuelva 400 mg de metanosulfonato de tricaína (ver Tabla de materiales) en 90 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.0 usando tampón Tris HCl 1 M (pH 9.0). Una vez ajustado el pH, añadir agua hasta 100 ml, luego hacer alícuotas apropiadas y almacenarlas a -20 °C.
2. Para anestesiar el pez cebra adulto o medaka, preparar una solución de tricaína al 0,02 % (p/v) diluyendo la solución madre de tricaína al 0,4 % con agua de instalación para peces.
3. Anestesiar el pescado con solución de tricaína al 0,02%; Se anestesian cuando no se mueven o responden al tacto (1-2 min).
4. Coloque el pescado anestesiado en una bandeja de espuma de poliestireno (consulte la Tabla de materiales) y fije el pescado en posición vertical entre dos agujas de 30 G insertadas verticalmente en la espuma de poliestireno.
5. Sostenga el cuerpo del pez para evitar que la cabeza del pez se mueva e inserte verticalmente una aguja de 30 G a través del cráneo en la región medial de uno de los hemisferios del tectum óptico (Figura 1A, B). La profundidad de inserción es de ~0,75 mm, casi igual a la mitad de la longitud del bisel de 30 G. Esta profundidad de inserción induce lesión cerebral en el pez cebra y medaka debido al tamaño corporal similar de estos peces.
   NOTA: Medaka tiene escamas en el cráneo. Rasque y retire las escamas con la aguja de 30 G para inducir de manera eficiente y precisa la lesión de la herida por arma blanca (Figura 1C).
6. Transfiera los peces heridos a una pecera con agua fresca de la instalación de peces y mueva el tanque al sistema de cría de peces una vez que se hayan recuperado completamente de la anestesia.
   NOTA: Los peces se recuperarán y comenzarán a moverse libremente en pocos minutos.
7. Para el análisis de linaje después de la lesión, prepare agua de instalación de pescado fresco que contenga 5 mM de bromodeoxiuridina (BrdU) (ver Tabla de materiales) y luego incube el pescado con esta solución de BrdU de 5 mM durante un período de tiempo predeterminado^13,19 (según lo determinado por un diseño experimental). Luego diseccione estos peces según el paso 2 y evalúe la incorporación de BrdU y la identidad del linaje celular según corresponda.
   NOTA: Este paso es un paso opcional para el análisis del linaje celular. Para detectar señales BrdU, realice la recuperación de antígenos como se muestra en el paso 4.3.

2. Disección cerebral

1. Prepare una solución de tricaína al 0,02%, una bandeja de espuma de poliestireno para la disección y una jeringa de 10 ml que contenga solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) con un tubo de extensión y agujas de 30 G (consulte la Tabla de materiales) para la perfusión intracárdica.
2. Anestesiar a los peces heridos en puntos de tiempo seleccionados.
3. Coloque toallas de papel en la bandeja de espuma de poliestireno y coloque el pescado anestesiado en las toallas de papel.
4. Mantenga el cuerpo del pez en su lugar insertando verticalmente dos agujas de 30 G a cada lado de la aleta anal (Figura 2A).
5. Haga una incisión ventral desde el ano hasta el corazón (Figura 2B) y mantenga el corazón visible insertando otras dos agujas de 30 G a cada lado de este órgano (Figura 2C).
   NOTA: El corazón está cubierto por la capa epitelial plateada de la hipodermis tanto en el pez cebra como en la medaka (Figura 2C).
6. Retire suavemente la capa epitelial plateada con la punta de los fórceps (Figura 2D).
7. Inserte la aguja de 30 G en el ventrículo, manteniendo el bisel hacia arriba, y haga una incisión en la aurícula con los fórceps (Figura 2E). Presione cuidadosamente la jeringa para empujar el PBS 1x y confirmar que la aurícula enjuagó la sangre.
   NOTA: Para evitar que la aguja penetre en el ventrículo, inserte cuidadosamente la aguja en la profundidad del medio bisel y, a continuación, ajuste la profundidad de inserción. Si la perfusión está bien hecha, las branquias se vuelven blancas (Figura 2F, G).
8. Detenga la perfusión después de drenar la sangre y las branquias se vuelvan blancas.
9. Retire las agujas que fijan el cuerpo del pez en su lugar y fije el lado ventral del pez hacia abajo (Figura 2H). Cortar la médula espinal y extraer el cráneo del tectum óptico y del telencéfalo (Figura 2I). Luego, corte los nervios ópticos y diseccione el cerebro con cuidado.
   NOTA: Tenga cuidado con los nervios ópticos durante la disección porque los nervios están conectados al tectum. Cuando se tira del nervio óptico, el tectum óptico se puede separar del cerebro. Si la extracción de sangre no es completa, el cerebro se ve de color rosa claro (el cerebro derecho en la Figura 2J).
10. Transfiera los cerebros en tubos de 1,5 ml con 1 ml de paraformaldehído al 4 % en 1x PBS y fíjelos durante la noche a 4 °C.

3. Preparación de secciones congeladas

1. Lave los cerebros fijos tres veces en 1x PBS durante 5 minutos cada una.
2. Para crioproteger los cerebros, transferirlos a tubos de 1,5 ml con 1 ml de sacarosa al 30 % (p/v) en 1x PBS e incubarlos durante la noche a 4 °C. Preparar el compuesto de incrustación (mezcla 2:1 de compuesto OCT y sacarosa al 30%, ver Tabla de materiales) combinando 30 ml de OCT y 15 ml de sacarosa al 30 %. Conservar a 4 °C.
   NOTA: Para eliminar las burbujas del compuesto mezclado, centrifugar los tubos de 50 ml a 10,000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente o colocar los tubos en posición vertical durante la noche.
3. Incubar un bloque de aluminio durante la noche a -80 °C para enfriar el criomold (ver Tabla de materiales) inmediatamente después de que el cerebro diseccionado se incruste en el criomold con el compuesto de incrustación.
   NOTA: El nitrógeno líquido también se puede utilizar para enfriar el bloque de aluminio. En ese caso, el bloque de aluminio debe colocarse en una caja de espuma de poliestireno llena de suficiente nitrógeno líquido para cubrir el bloque de aluminio justo antes de incrustar. Después de confirmar la sublimación de nitrógeno líquido, coloque el criomold en el bloque de aluminio preenfriado. Es mejor confirmar cuántos criomoldes se pueden colocar en el bloque de aluminio a la vez. Es aconsejable utilizar nitrógeno líquido o un bloque preenfriado adicional para garantizar suficiente espacio para enfriar todas las muestras rápidamente.
4. Coloque el bloque de aluminio preenfriado en una caja de espuma de poliestireno. Use una caja de espuma de poliestireno con tapa para evitar que el bloque de aluminio se caliente.
5. Para las secciones coronales, incruste el cerebro en un criomold y ajuste la orientación usando fórceps bajo el microscopio (Figura 3A).
6. Coloque el criomold en el bloque de aluminio preenfriado en la caja de espuma de poliestireno y permita que el compuesto OCT se congele (Figura 3B). Cuando el compuesto OCT comienza a congelarse, se vuelve blanco.
7. Aplique un pequeño círculo de OCT compuesto en un disco de muestra y monte el criobloque para unir el criobloque al disco de muestra.
8. Coloque el disco de la muestra en el criostato y congele completamente el compuesto OCT.
9. Coloque el disco de la muestra en la cabeza de la muestra en el criostato.
10. Establezca la orientación del criobloque y recorte la OCT para eliminar cualquier región adicional.
    NOTA: Ajuste la orientación del plano de corte mientras corta el telencéfalo. La cuchilla está equipada con un criostato. Es posible ajustar la orientación del plano de corte cambiando el ángulo de la cabeza de la muestra.
11. Corte secciones seriadas de 14 μm de espesor a través de todo el tectum óptico utilizando un criostato. Conservar los portaobjetos a -25 °C.
    NOTA: El almacenamiento a largo plazo debe estar a -80 °C.

4. Inmunotinción fluorescente

1. El vidrio seco se desliza en una rejilla deslizante durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Lave las diapositivas en 1x PBS durante 30 minutos en RT. Si se va a realizar inmunotinción con anticuerpos anti-PCNA o BrdU, continúe con el paso 4.2 o el paso 4.3.
2. Prepare 500 ml de citrato de sodio de 10 mM en un vaso de precipitados de 500 ml y caliente el tampón de citrato a 85 °C en un agitador magnético de placa caliente, luego coloque los portaobjetos en una rejilla de tinción de portaobjetos e incube la rejilla en el tampón de citrato a 85 °C durante 30 min. Para evitar la ebullición, mantenga la temperatura alrededor de 85 ° C. Después de la recuperación del antígeno, lavar los portaobjetos tres veces en Tritón al 0,1 % en 1x PBS (PBSTr), y cada lavado dura 5 minutos a RT.
   NOTA: Este paso es un paso opcional para la recuperación del antígeno nuclear celular proliferante (PCNA).
3. Preparar una solución de HCl 2 N diluyendo 12 N HCl en agua destilada. Usando un bloqueador de líquidos (consulte la Tabla de materiales), dibuje una línea como barrera hidrofóbica para mantener la solución de HCl 2 N alrededor de las secciones.
   1. Coloque los portaobjetos en bandejas de inmunotinción y aplique 200-300 μL de la solución de HCl 2N. Incubar las bandejas a 37 °C durante 30 min. Después de la recuperación del antígeno, lavar tres veces en PBSTr al 0,1 % y cada lavado dura 5 minutos a RT.
      NOTA: Este paso es un paso opcional para la recuperación del antígeno BrdU.
4. Absorba y retire la solución restante con toallas de papel. Luego, use un bloqueador de líquidos para dibujar una barrera hidrofóbica para mantener la solución de anticuerpos alrededor de las secciones según sea necesario.
5. Coloque los portaobjetos en bandejas y aplique 200-300 μL de solución de bloqueo, 3% (v/v) de suero de caballo en PBSTr) a cada portaobjetos, e incube los portaobjetos durante 1 h en RT.
6. Lave las secciones con PBSTr durante 5 minutos en RT y repita tres veces.
7. Prepare los anticuerpos primarios (ver Tabla de materiales) usando la solución bloqueante (200-300 μL de solución de anticuerpos para cada portaobjetos). Retire el PBSTr restante con toallas de papel y coloque los portaobjetos en las bandejas de inmunotinción. Aplicar la solución de anticuerpos primarios a cada portaobjetos e incubar las bandejas durante la noche a 4 °C.
8. Lave las secciones con PBSTr durante 5 minutos en RT y repita tres veces.
9. Prepare una solución de anticuerpos secundarios fluorescentes (ver Tabla de materiales) utilizando el tampón de bloqueo (1:500). Retire el PBSTr restante con toallas de papel y coloque los portaobjetos en las bandejas de inmunotinción. Aplique la solución de anticuerpos secundarios a cada portaobjetos y bandejas de sombra con papel de aluminio. Incubar durante 1-2 h en RT.
10. Lave las secciones con PBSTr durante 5 minutos a RT tres veces sin exponerlas a la luz.
11. Preparar la solución de Hoechst (dilución 1:500 en 1x PBS, ver Tabla de materiales) para la tinción nuclear. Retire el PBSTr restante con toallas de papel y coloque los portaobjetos en las bandejas de inmunotinción. Aplique la solución Hoechst a cada portaobjetos y cubra las bandejas con papel de aluminio. Incubar durante 30 min en RT.
12. Lave las secciones con 1x PBS durante 10 minutos en RT sin exponerlas a la luz.
13. Absorba y retire el 1x PBS restante con toallas de papel y monte las secciones en portaobjetos utilizando un medio de montaje soluble en agua (consulte la Tabla de materiales) para la inmunotinción fluorescente. Coloque lentamente un cubreobjetos de 24 x 45 mm en las secciones. Conservar a 4 °C, sin exponer los portaobjetos a la luz.
14. Observe y obtenga imágenes de las secciones bajo microscopía fluorescente o microscopía confocal.

Resultados

La lesión de la herida por arma blanca en el tectum óptico mediante la inserción de agujas en el hemisferio derecho (Figura 1, Figura 4A y Figura 5A) induce varias respuestas celulares, incluida la proliferación de células gliales radiales (CGR) y la generación de neuronas recién nacidas. Del mismo modo, las poblaciones envejecidas de pez cebra y medaka se utilizaron para contrarrestar cualquier efecto del envejecimiento en l...

Discusión

Aquí se describe un conjunto de métodos que se pueden utilizar para inducir lesiones por heridas de arma blanca en el tectum óptico utilizando una aguja para facilitar la evaluación de la proliferación y diferenciación de RGC después de una lesión cerebral. Las heridas de arma blanca mediadas por agujas son un método simple y eficientemente implementado que se puede aplicar a muchas muestras experimentales utilizando un conjunto estándar de herramientas. Se han desarrollado modelos de lesiones por puñaladas pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250