Modello di lesione da coltellata del tectum ottico adulto utilizzando zebrafish e medaka per l'analisi comparativa della capacità rigenerativa

Riepilogo

Viene descritto un modello di lesione cerebrale meccanica nel pesce zebra adulto per studiare i meccanismi molecolari che regolano la loro elevata capacità rigenerativa. Il metodo spiega di creare una ferita da taglio nel tectum ottico di più specie di piccoli pesci per valutare le risposte rigenerative utilizzando l'immunocolorazione fluorescente.

Abstract

Mentre i pesci zebra hanno una capacità superiore di rigenerare il loro sistema nervoso centrale (SNC), il medaka ha una capacità rigenerativa del SNC inferiore. È stato sviluppato un modello di lesione cerebrale nel tectum ottico adulto di zebrafish e medaka e sono state eseguite analisi istologiche e molecolari comparative per chiarire i meccanismi molecolari che regolano l'elevata capacità rigenerativa di questo tessuto in queste specie di pesci. Qui viene presentato un modello di lesione da coltellata per il tectum ottico adulto utilizzando un ago e analisi istologiche per la proliferazione e la differenziazione delle cellule staminali neurali (NSC). Un ago è stato inserito manualmente nella regione centrale del tectum ottico, quindi i pesci sono stati perfusi intracardicamente e i loro cervelli sono stati sezionati. Questi tessuti sono stati quindi criosezionati e valutati utilizzando immunocolorazione contro i marcatori di proliferazione e differenziazione NSC appropriati. Questo modello di lesione del tectum fornisce risultati robusti e riproducibili sia nel pesce zebra che nel medaka, consentendo di confrontare le risposte NSC dopo l'infortunio. Questo metodo è disponibile per piccoli teleostei, tra cui zebrafish, medaka e killifish africani, e ci consente di confrontare la loro capacità rigenerativa e studiare meccanismi molecolari unici.

Introduzione

Il pesce zebra (Danio rerio) ha una maggiore capacità di rigenerare il sistema nervoso centrale (SNC) rispetto ad altri mammiferi ^1,2,3. Recentemente, per comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base di questa maggiore capacità rigenerativa, sono state eseguite analisi comparative della rigenerazione tissutale utilizzando la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione ^4,5,6. Le strutture cerebrali nei pesci zebra e nei tetrapodi sono molto diverse ^7,8,9. Ciò significa che sono stati sviluppati diversi modelli di lesioni cerebrali che utilizzano piccoli pesci con strutture cerebrali e caratteristiche biologiche simili per facilitare lo studio dei meccanismi molecolari sottostanti che contribuiscono a questa maggiore capacità rigenerativa.

Inoltre, medaka (Oryzias latipes) è un animale da laboratorio popolare con una bassa capacità di rigenerazione cardiaca e neuronale^10,11,12,13 rispetto al pesce zebra. Zebrafish e medaka hanno strutture cerebrali e nicchie simili per le cellule staminali neurali adulte (NSC)^14,15,16,17. Nel pesce zebra e nel medaka, il tectum ottico comprende due tipi di CSN, cellule staminali simil-neuroepiteliali e cellule gliali radiali (RGC)^15,18. In precedenza era stata sviluppata una lesione da coltellata per il tectum ottico del pesce zebra adulto, e questo modello è stato utilizzato per studiare i meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione cerebrale in questi animali 19,20,21,22,23. Questo modello di lesione da ferita da pugnalata di zebrafish giovane adulto ha indotto neurogenesi rigenerativa da RGC 19,24,25. Questa ferita da taglio nel tectum ottico è un metodo robusto e riproducibile 13,19,20,21,22,23,24,25. Quando lo stesso modello di lesione è stato applicato al medaka adulto, la bassa capacità neurogena degli RGC nel tectum ottico medaka è stata rivelata attraverso l'analisi comparativa della proliferazione e differenziazione degli RGC dopo la lesione¹³.

I modelli di lesione da taglio nel tectum ottico sono stati sviluppati anche nei modelli di mummichog²⁶, ma i dettagli della lesione del tectum non sono stati ben documentati rispetto alla lesione telencefalica²⁷. La lesione da coltellata nel tectum ottico utilizzando zebrafish e medaka consente lo studio delle risposte cellulari differenziali e dell'espressione genica tra specie con capacità rigenerativa differenziale. Questo protocollo descrive come eseguire una ferita da taglio nel tectum ottico usando un ago per iniezione. Questo metodo può essere applicato a piccoli pesci come zebrafish e medaka. I processi per la preparazione del campione per l'analisi istologica e l'analisi della proliferazione e differenziazione cellulare mediante immunoistochimica fluorescente e criosezioni sono spiegati qui.

Protocollo

Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso il National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebrafish e medaka sono stati mantenuti secondo procedure standard²⁸.

1. Ferita da taglio nel tectum ottico adulto

1. Preparare una soluzione madre di tricaina allo 0,4% (p/v) per l'anestesia. Per una soluzione madre da 100 ml, sciogliere 400 mg di tricaina metansolfonato (vedere Tabella dei materiali) in 90 mL di acqua distillata e regolare il pH a 7,0 utilizzando tampone Tris HCl 1 M (pH 9,0). Una volta regolato il pH, aggiungere acqua fino a 100 ml, quindi fare aliquote appropriate e conservarle a -20 °C.
2. Per anestetizzare il pesce zebra adulto o il medaka, preparare una soluzione di tricaina allo 0,02 % (p/v) diluendo la soluzione di brodo di tricaina allo 0,4 % con acqua di impianto per pesci.
3. Anestetizzare il pesce con una soluzione di tricaina allo 0,02%; Diventano anestetizzati quando non si muovono o rispondono al tocco (1-2 min).
4. Posizionare il pesce anestetizzato su un vassoio di polistirolo (vedi Tabella dei materiali) e fissare il pesce in posizione verticale tra due aghi da 30 G inseriti verticalmente nel polistirolo.
5. Tenere il corpo del pesce per evitare che la testa del pesce si muova e inserire verticalmente un ago da 30 G attraverso il cranio nella regione mediale di uno degli emisferi del tectum ottico (Figura 1A,B). La profondità di inserimento è ~0,75 mm, quasi pari alla metà della lunghezza dello smusso da 30 G. Questa profondità di inserimento induce lesioni cerebrali su zebrafish e medaka a causa delle dimensioni corporee simili di questi pesci.
   NOTA: Medaka ha squame sul cranio. Gratta e rimuovi le squame usando l'ago da 30 G per indurre in modo efficiente e preciso la ferita da taglio (Figura 1C).
6. Trasferire il pesce ferito in un acquario con acqua fresca dell'impianto di pesce e spostare l'acquario nel sistema di allevamento dei pesci una volta che si sono completamente ripresi dall'anestesia.
   NOTA: I pesci si riprenderanno e inizieranno a muoversi liberamente in pochi minuti.
7. Per l'analisi del lignaggio dopo la lesione, preparare acqua fresca di impianto per pesci contenente 5 mM di bromodeossiuridina (BrdU) (vedi tabella dei materiali) e quindi incubare il pesce con questa soluzione di BrdU 5 mM per un periodo di tempo predeterminato^13,19 (come determinato da un disegno sperimentale). Quindi sezionare questi pesci come da fase 2 e valutare l'incorporazione di BrdU e l'identità della linea cellulare come appropriato.
   NOTA: questo passaggio è facoltativo per l'analisi della linea cellulare. Per rilevare i segnali BrdU, eseguire il recupero dell'antigene come mostrato al punto 4.3.

2. Dissezione cerebrale

1. Preparare una soluzione di tricaina allo 0,02%, un vassoio di polistirolo per la dissezione e una siringa da 10 ml contenente soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) con un tubo di prolunga e aghi da 30 G (vedere la tabella dei materiali) per la perfusione intracardica.
2. Anestetizzare il pesce ferito in punti temporali selezionati.
3. Posizionare i tovaglioli di carta sul vassoio di polistirolo e posizionare il pesce anestetizzato sugli asciugamani di carta.
4. Tenere il corpo del pesce in posizione inserendo verticalmente due aghi da 30 G su entrambi i lati della pinna anale (Figura 2A).
5. Fare un'incisione ventrale dall'ano al cuore (Figura 2B) e mantenere il cuore visibile inserendo altri due aghi da 30 G su ciascun lato di questo organo (Figura 2C).
   NOTA: Il cuore è coperto dallo strato epiteliale argenteo dell'ipoderma sia nel pesce zebra che nel medaka (Figura 2C).
6. Rimuovere delicatamente lo strato epiteliale d'argento con la punta della pinza (Figura 2D).
7. Inserire l'ago da 30 G nel ventricolo, mantenendo la smussatura verso l'alto, ed effettuare un'incisione nell'atrio usando la pinza (Figura 2E). Premere con cautela sulla siringa per spingere 1x PBS e confermare che l'atrio ha lavato il sangue.
   NOTA: Per evitare che l'ago penetri nel ventricolo, inserire con cautela l'ago alla profondità della mezza smussatura e quindi regolare la profondità di inserimento. Se la perfusione è ben fatta, le branchie diventano bianche (Figura 2F,G).
8. Fermare la perfusione dopo che il sangue è stato drenato e le branchie diventano bianche.
9. Rimuovere gli aghi che fissano il corpo del pesce in posizione e fissare il lato ventrale del pesce verso il basso (Figura 2H). Tagliare il midollo spinale e rimuovere il cranio dal tectum ottico e dal telencefalo (Figura 2I). Quindi, tagliare i nervi ottici e sezionare attentamente il cervello.
   NOTA: Attenzione ai nervi ottici durante la dissezione perché i nervi sono collegati al tetto. Quando il nervo ottico viene tirato, il tectum ottico può essere staccato dal cervello. Se la rimozione del sangue non è completa, il cervello appare rosa chiaro (il cervello destro nella Figura 2J).
10. Trasferire il cervello in provette da 1,5 mL con 1 mL di paraformaldeide al 4% in 1x PBS e fissarle per una notte a 4 °C.

3. Preparazione delle sezioni congelate

1. Lavare i cervelli fissi tre volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuno.
2. Per crioproteggere il cervello, trasferirli in provette da 1,5 ml con 1 mL di saccarosio al 30 % (p/v) in 1x PBS e incubarli per una notte a 4 °C. Preparare il composto incorporante (miscela 2:1 di composto PTOM e 30% di saccarosio, cfr. tabella dei materiali) combinando 30 ml di PTOM e 15 ml di saccarosio al 30 %. Conservare a 4 °C.
   NOTA: Per rimuovere le bolle dal composto miscelato, centrifugare i tubi da 50 ml a 10.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente o posizionare i tubi in posizione verticale durante la notte.
3. Incubare un blocco di alluminio durante la notte a -80 °C per raffreddare il criomold (vedi Tabella dei materiali) immediatamente dopo che il cervello sezionato è incorporato nel criomold con il composto incorporato.
   NOTA: l'azoto liquido può essere utilizzato anche per raffreddare il blocco di alluminio. In tal caso, il blocco di alluminio deve essere collocato in una scatola di polistirolo riempita con azoto liquido sufficiente a coprire il blocco di alluminio appena prima dell'incorporamento. Dopo aver confermato la sublimazione dell'azoto liquido, posizionare il criomold sul blocco di alluminio preraffreddato. È meglio confermare quanti criostampi possono essere posizionati sul blocco di alluminio contemporaneamente. Si consiglia di utilizzare azoto liquido o un blocco preraffreddato aggiuntivo per garantire spazio sufficiente per raffreddare rapidamente tutti i campioni.
4. Metti il blocco di alluminio preraffreddato in una scatola di polistirolo. Utilizzare una scatola di polistirolo con un coperchio per evitare che il blocco di alluminio si riscaldi.
5. Per le sezioni coronali, incorporare il cervello in un criomold e regolare l'orientamento usando una pinza al microscopio (Figura 3A).
6. Posizionare il criomold sul blocco di alluminio preraffreddato nella scatola di polistirolo e lasciare congelare il composto OCT (Figura 3B). Quando il composto OCT inizia a congelare, diventa bianco.
7. Applicare un piccolo cerchio di composto OCT su un disco campione e montare il crioblocco per attaccare il crioblocco al disco del campione.
8. Posizionare il disco del campione nel criostato e congelare completamente il composto OCT.
9. Posizionare il disco del campione sulla testa del campione nel criostato.
10. Impostare l'orientamento del crioblocco e tagliare lo Strumento di personalizzazione di Office per rimuovere eventuali regioni aggiuntive.
    NOTA: regolare l'orientamento del piano di taglio durante il taglio del telencefalo. La lama è dotata di un criostato. È possibile regolare l'orientamento del piano di taglio modificando l'angolo della testa del campione.
11. Tagliare sezioni seriali spesse 14 μm attraverso l'intero tectum ottico utilizzando un criostato. Conservare i vetrini a -25 °C.
    NOTA: la conservazione a lungo termine deve essere a -80 °C.

4. Immunocolorazione fluorescente

1. Vetrini asciutti in un portavetri per 30 minuti a temperatura ambiente (RT). Lavare i vetrini in 1x PBS per 30 minuti su RT. Se è necessario eseguire l'immunocolorazione con anticorpi anti-PCNA o BrdU, procedere al punto 4.2 o al punto 4.3.
2. Preparare 500 mL di citrato di sodio da 10 mM in un becher da 500 mL e riscaldare il tampone citrato a 85 °C su un agitatore magnetico a piastra calda, quindi posizionare i vetrini in uno scaffale di colorazione dei vetrini e incubare il rack nel tampone citrato a 85 °C per 30 minuti. Per evitare l'ebollizione, mantenere la temperatura intorno agli 85 °C. Dopo il recupero dell'antigene, lavare i vetrini tre volte in Triton allo 0,1% in 1x PBS (PBSTr), con ogni lavaggio che richiede 5 minuti a RT.
   NOTA: questo passaggio è facoltativo per il recupero dell'antigene nucleare cellulare proliferante (PCNA).
3. Preparare una soluzione di 2 N HCl diluendo 12 N HCl in acqua distillata. Utilizzando un bloccante liquido (vedere Tabella dei materiali), tracciare una linea come barriera idrofobica per mantenere la soluzione di 2 N HCl attorno alle sezioni.
   1. Posizionare i vetrini su vassoi immunocoloranti e applicare 200-300 μL della soluzione di 2N HCl. Incubare le vaschette a 37 °C per 30 min. Dopo il recupero dell'antigene, lavare tre volte con PBSTr allo 0,1% e ogni lavaggio richiede 5 minuti a RT.
      NOTA: questo passaggio è facoltativo per il recupero dell'antigene BrdU.
4. Assorbire e rimuovere la soluzione rimanente usando carta assorbente. Quindi, utilizzare un bloccante liquido per disegnare una barriera idrofobica per mantenere la soluzione anticorpale intorno alle sezioni, se necessario.
5. Posizionare i vetrini su vassoi e applicare 200-300 μL di soluzione bloccante, siero di cavallo al 3% (v/v) in PBSTr) su ogni vetrino e incubare i vetrini per 1 ora a RT.
6. Lavare le sezioni con PBSTr per 5 minuti a RT e ripetere tre volte.
7. Preparare gli anticorpi primari (vedere Tabella dei materiali) utilizzando la soluzione bloccante (200-300 μL di soluzione anticorpale per ciascun vetrino). Rimuovere il PBSTr rimanente con carta assorbente e posizionare i vetrini sui vassoi immunomacchianti. Applicare la soluzione anticorpale primaria su ogni vetrino e incubare i vassoi per una notte a 4 °C.
8. Lavare le sezioni con PBSTr per 5 minuti a RT e ripetere tre volte.
9. Preparare una soluzione di anticorpi secondari fluorescenti (vedere Tabella dei materiali) utilizzando il tampone bloccante (1:500). Rimuovere il PBSTr rimanente con carta assorbente e posizionare i vetrini sui vassoi immunomacchianti. Applicare la soluzione anticorpale secondaria su ogni vetrino e vassoi ombreggianti con un foglio di alluminio. Incubare per 1-2 ore a RT.
10. Lavare le sezioni con PBSTr per 5 minuti a RT tre volte senza esporle alla luce.
11. Preparare la soluzione di Hoechst (diluizione 1:500 in 1x PBS, vedere Tabella dei materiali) per la colorazione nucleare. Rimuovere il PBSTr rimanente con carta assorbente e posizionare i vetrini sui vassoi immunomacchianti. Applicare la soluzione Hoechst su ogni vetrino e coprire i vassoi con un foglio di alluminio. Incubare per 30 minuti a RT.
12. Lavare le sezioni con 1x PBS per 10 minuti a RT senza esporle alla luce.
13. Assorbire e rimuovere il restante 1x PBS usando tovaglioli di carta e montare le sezioni su vetrini utilizzando un mezzo di montaggio solubile in acqua (vedere Tabella dei materiali) per l'immunocolorazione fluorescente. Posizionare lentamente una slitta di copertura di 24 x 45 mm sulle sezioni. Conservare a 4 °C, senza esporre i vetrini alla luce.
14. Osservare e visualizzare le sezioni al microscopio fluorescente o al microscopio confocale.

Risultati

La lesione della ferita da taglio nel tectum ottico utilizzando l'inserimento dell'ago nell'emisfero destro (Figura 1, Figura 4A e Figura 5A) induce varie risposte cellulari, tra cui la proliferazione delle cellule gliali radiali (RGC) e la generazione di neuroni appena nati. Allo stesso modo, le popolazioni invecchiate di zebrafish e medaka sono state utilizzate per contrastare eventuali effetti dell'invecchiamento nella risposta r...

Discussione

Qui viene descritta una serie di metodi che possono essere utilizzati per indurre lesioni da coltellata nel tectum ottico utilizzando un ago per facilitare la valutazione della proliferazione e della differenziazione RGC dopo lesione cerebrale. Le ferite da taglio mediate da ago sono un metodo semplice ed efficiente che può essere applicato a molti campioni sperimentali utilizzando un set standard di strumenti. Sono stati sviluppati modelli di lesioni da coltellata per diverse regioni del cervello del pesce

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250