Modèle de blessure par arme blanche du tectum optique adulte à l’aide de poisson-zèbre et de Medaka pour l’analyse comparative de la capacité de régénération

Résumé

Un modèle de lésion cérébrale mécanique chez le poisson-zèbre adulte est décrit pour étudier les mécanismes moléculaires régulant leur capacité de régénération élevée. La méthode explique de créer une blessure par arme blanche dans le tectum optique de plusieurs espèces de petits poissons afin d’évaluer les réponses régénératives à l’aide d’immunomarquage fluorescent.

Résumé

Alors que le poisson zèbre a une capacité supérieure à régénérer son système nerveux central (SNC), le médaka a une capacité de régénération du SNC inférieure. Un modèle de lésion cérébrale a été développé dans le tectum optique adulte du poisson zèbre et du médaka et des analyses histologiques et moléculaires comparatives ont été effectuées pour élucider les mécanismes moléculaires régulant la capacité de régénération élevée de ce tissu chez ces espèces de poissons. Ici, un modèle de blessure par arme blanche est présenté pour le tectum optique adulte à l’aide d’une aiguille et d’analyses histologiques pour la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales (CSN). Une aiguille a été insérée manuellement dans la région centrale du tectum optique, puis les poissons ont été perfusés par voie intracardiale, et leur cerveau a été disséqué. Ces tissus ont ensuite été cryosectionnés et évalués à l’aide d’immunomarquage contre les marqueurs appropriés de prolifération et de différenciation des CSN. Ce modèle de lésion tectum fournit des résultats robustes et reproductibles chez le poisson-zèbre et le médaka, ce qui permet de comparer les réponses aux CSN après une blessure. Cette méthode est disponible pour les petits téléostéens, y compris le poisson zèbre, le médaka et le killifish africain, et nous permet de comparer leur capacité de régénération et d’étudier des mécanismes moléculaires uniques.

Introduction

Le poisson zèbre (Danio rerio) a une capacité accrue à régénérer son système nerveux central (SNC) par rapport aux autres mammifères ^1,2,3. Récemment, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette capacité de régénération accrue, des analyses comparatives de la régénération tissulaire à l’aide de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont été effectuées ^4,5,6. Les structures cérébrales du poisson zèbre et des tétrapodes sont très différentes ^7,8,9. Cela signifie que plusieurs modèles de lésions cérébrales utilisant de petits poissons ayant des structures cérébrales et des caractéristiques biologiques similaires ont été développés pour faciliter l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents contribuant à cette capacité de régénération accrue.

En outre, le médaka (Oryzias latipes) est un animal de laboratoire populaire avec une faible capacité de régénération cardiaque et neuronale^10,11,12,13 par rapport au poisson zèbre. Le poisson-zèbre et le medaka ont des structures cérébrales et des niches similaires pour les cellules souches neurales adultes (CSN)^14,15,16,17. Chez le poisson-zèbre et le médaka, le tectum optique comprend deux types de CSN, les cellules souches de type neuroépithélial et les cellules gliales radiales (CGR^)15,18. Une blessure par arme blanche pour le tectum optique du poisson-zèbre adulte a déjà été développée, et ce modèle a été utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la régénération cérébrale chez ces animaux 19,20,21,22,23. Ce modèle de blessure par arme blanche chez le poisson zèbre jeune adulte a induit une neurogenèse régénérative à partir des CGR 19,24,25. Cette blessure par arme blanche dans le tectum optique est une méthode robuste et reproductible 13,19,20,21,22,23,24,25. Lorsque le même modèle de blessure a été appliqué au médaka adulte, la faible capacité neurogène des CGR dans le tectum optique medaka a été révélée par l’analyse comparative de la prolifération et de la différenciation des CGR après une blessure¹³.

Des modèles de blessures par arme blanche dans le tectum optique ont également été développés dans les modèles de porc mummichog²⁶, mais les détails de la lésion tectum n’ont pas été bien documentés par rapport aux lésions télencéphaliques²⁷. La blessure par arme blanche dans le tectum optique à l’aide de poisson zèbre et de médaka permet d’étudier les réponses cellulaires différentielles et l’expression génique entre les espèces ayant une capacité de régénération différentielle. Ce protocole décrit comment effectuer une blessure par arme blanche dans le tectum optique à l’aide d’une aiguille d’injection. Cette méthode peut être appliquée aux petits poissons comme le poisson zèbre et le medaka. Les processus de préparation des échantillons pour l’analyse histologique et l’analyse de prolifération et de différenciation cellulaire à l’aide de l’immunohistochimie fluorescente et des cryosections sont expliqués ici.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Le poisson zèbre et le médaka ont été entretenus conformément aux procédures standard²⁸.

1. Blessure par arme blanche dans le tectum optique de l’adulte

1. Préparer une solution mère de tricaïne à 0,4 % (p/v) pour l’anesthésie. Pour une solution mère de 100 mL, dissoudre 400 mg de méthanesulfonate de tricaïne (voir le tableau des matières) dans 90 mL d’eau distillée et ajuster le pH à 7,0 à l’aide d’un tampon Tris HCl de 1 M (pH 9,0). Une fois le pH ajusté, ajoutez de l’eau jusqu’à 100 mL, puis faites les aliquotes appropriées et conservez-les à -20 °C.
2. Pour anesthésier le poisson-zèbre adulte ou le medaka, préparer une solution de tricaïne à 0,02 % (p/v) en diluant la solution mère à 0,4 % de tricaïne avec de l’eau de poisson.
3. Anesthésier le poisson avec une solution de tricaïne à 0,02%; Ils deviennent anesthésiés lorsqu’ils ne bougent pas ou ne répondent pas au toucher (1-2 min).
4. Placez le poisson anesthésié sur un plateau en polystyrène expansé (voir le tableau des matériaux) et fixez le poisson à la verticale entre deux aiguilles de 30 G insérées verticalement dans la mousse de polystyrène.
5. Tenez le corps du poisson pour empêcher la tête du poisson de bouger et insérez verticalement une aiguille de 30 G à travers le crâne dans la région médiale de l’un des hémisphères du tectum optique (Figure 1A,B). La profondeur d’insertion est de ~0,75 mm, presque égale à la moitié de la longueur du biseau de 30 G. Cette profondeur d’insertion induit des lésions cérébrales sur le poisson zèbre et le medaka en raison de la taille corporelle similaire de ces poissons.
   REMARQUE: Medaka a des écailles sur le crâne. Grattez et retirez les écailles à l’aide de l’aiguille de 30 G pour induire efficacement et avec précision la blessure par arme blanche (figure 1C).
6. Transférez les poissons blessés dans un aquarium avec de l’eau fraîche de l’installation de poisson et déplacez l’aquarium vers le système d’élevage des poissons une fois qu’ils se sont complètement remis de l’anesthésie.
   REMARQUE: Les poissons se rétabliront et commenceront à se déplacer librement en quelques minutes.
7. Pour l’analyse de la lignée après la blessure, préparer de l’eau de l’installation de poisson frais contenant 5 mM de bromodéoxyuridine (BrdU) (voir le tableau des matériaux), puis incuber le poisson avec cette solution de BrdU de 5 mM pendant une durée prédéterminée^13,19 (déterminée par un plan expérimental). Ensuite, disséquez ces poissons conformément à l’étape 2 et évaluez l’incorporation de BrdU et l’identité de la lignée cellulaire le cas échéant.
   REMARQUE: Cette étape est une étape facultative pour l’analyse de la lignée cellulaire. Pour détecter les signaux BrdU, effectuez la récupération de l’antigène comme indiqué à l’étape 4.3.

2. Dissection cérébrale

1. Préparer une solution de tricaïne à 0,02 %, un plateau en polystyrène expansé pour la dissection et une seringue de 10 mL contenant une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) avec un tube d’extension et des aiguilles de 30 G (voir le tableau des matériaux) pour la perfusion intracardique.
2. Anesthésiez le poisson blessé à des moments choisis.
3. Placez les serviettes en papier sur le plateau en polystyrène expansé et placez le poisson anesthésié sur les essuie-tout.
4. Maintenez le corps du poisson en place en insérant verticalement deux aiguilles de 30 G de chaque côté de la nageoire anale (figure 2A).
5. Faites une incision ventrale de l’anus au cœur (figure 2B) et gardez le cœur visible en insérant deux autres aiguilles de 30 G de chaque côté de cet organe (figure 2C).
   NOTE: Le cœur est recouvert de la couche épithéliale argentée de l’hypoderme chez le poisson zèbre et le médaka (Figure 2C).
6. Retirez délicatement la couche épithéliale argentée avec l’extrémité de la pince (Figure 2D).
7. Insérez l’aiguille de 30 G dans le ventricule en maintenant le biseau vers le haut et faites une incision dans l’oreillette à l’aide de la pince (figure 2E). Appuyez délicatement sur la seringue pour pousser le 1x PBS et confirmer que l’oreillette a rincé le sang.
   REMARQUE: Pour empêcher l’aiguille de pénétrer dans le ventricule, insérez soigneusement l’aiguille à la profondeur du demi-biseau, puis ajustez la profondeur d’insertion. Si la perfusion est bien faite, les branchies deviennent blanches (Figure 2F,G).
8. Arrêtez la perfusion après que le sang est drainé et que les branchies deviennent blanches.
9. Retirez les aiguilles qui fixent le corps du poisson en place et fixez le côté ventral du poisson vers le bas (Figure 2H). Coupez la moelle épinière et retirez le crâne du tectum optique et du télencéphale (Figure 2I). Ensuite, coupez les nerfs optiques et disséquez soigneusement le cerveau.
   REMARQUE: Méfiez-vous des nerfs optiques pendant la dissection car les nerfs sont connectés au tectum. Lorsque le nerf optique est tiré, le tectum optique peut être détaché du cerveau. Si l’extraction de sang n’est pas complète, le cerveau semble rose pâle (le cerveau droit sur la figure 2J).
10. Transférer les cerveaux dans des tubes de 1,5 mL contenant 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS et les fixer pendant la nuit à 4 °C.

3. Préparation des profilés congelés

1. Lavez les cerveaux fixes trois fois dans 1x PBS pendant 5 minutes chacun.
2. Pour cryoprotéger les cerveaux, transférez-les dans des tubes de 1,5 mL avec 1 mL de saccharose à 30 % (p/v) dans 1x PBS et incuberez-les pendant une nuit à 4 °C. Préparer le composé d’enrobage (mélange 2:1 de composé OCT et 30 % de saccharose, voir le tableau des matières) en combinant 30 mL de OCT et 15 mL de saccharose à 30 %. Conserver à 4 °C.
   REMARQUE : Pour retirer les bulles du composé mélangé, centrifuger les tubes de 50 mL à 10 000 x g pendant 2 min à température ambiante ou placer les tubes à la verticale pendant la nuit.
3. Incuber un bloc d’aluminium pendant une nuit à -80 °C afin de refroidir le cryomoule (voir le tableau des matériaux) immédiatement après que le cerveau disséqué est incorporé dans le cryomoule avec le composé d’enrobage.
   REMARQUE: L’azote liquide peut également être utilisé pour refroidir le bloc d’aluminium. Dans ce cas, le bloc d’aluminium doit être placé dans une boîte en polystyrène rempli de suffisamment d’azote liquide pour recouvrir le bloc d’aluminium juste avant l’incorporation. Après avoir confirmé la sublimation à l’azote liquide, placez le cryomoule sur le bloc d’aluminium prérefroidi. Il est préférable de confirmer combien de cryomoules peuvent être placés sur le bloc d’aluminium à la fois. Il est conseillé d’utiliser de l’azote liquide ou un bloc prérefroidi supplémentaire pour assurer suffisamment d’espace pour refroidir rapidement tous les échantillons.
4. Placez le bloc d’aluminium prérefroidi dans une boîte en polystyrène. Utilisez une boîte en polystyrène expansé munie d’un couvercle pour empêcher le bloc d’aluminium de se réchauffer.
5. Pour les coupes coronales, intégrer le cerveau dans un cryomoule et ajuster l’orientation à l’aide de forceps au microscope (Figure 3A).
6. Placez le cryomoule sur le bloc d’aluminium prérefroidi dans la boîte en polystyrène expansé et laissez le composé OCT geler (Figure 3B). Lorsque le composé OCT commence à geler, il devient blanc.
7. Appliquer un petit cercle de composé OCT sur un disque d’échantillon et monter le cryobloc pour attacher le cryobloc au disque de l’échantillon.
8. Placer le disque de l’échantillon dans le cryostat et congeler complètement le composé OCT.
9. Placer le disque de l’échantillon sur la tête de l’échantillon dans le cryostat.
10. Réglez l’orientation du cryobloc et coupez l’OCT pour supprimer toutes les régions supplémentaires.
    NOTE: Ajustez l’orientation du plan de coupe tout en coupant le télencéphale. La lame est équipée d’un cryostat. Il est possible d’ajuster l’orientation du plan de coupe en changeant l’angle de la tête de l’échantillon.
11. Découpez des sections en série de 14 μm d’épaisseur à travers tout le tectum optique à l’aide d’un cryostat. Conserver les lames à -25 °C.
    REMARQUE : Le stockage à long terme doit être à -80 °C.

4. Immunomarquage fluorescent

1. Verre sec glisse dans un support à glissière pendant 30 min à température ambiante (RT). Laver les lames en 1x PBS pendant 30 min à RT. Si une immunocoloration avec des anticorps anti-PCNA ou BrdU doit être effectuée, passez à l’étape 4.2 ou 4.3.
2. Préparer 500 mL de citrate de sodium de 10 mM dans un bécher de 500 mL et chauffer le tampon de citrate à 85 °C sur un agitateur magnétique à plaque chauffante, puis placer les lames dans une grille de coloration à lames et incuber la grille dans la grille à 85 °C pendant 30 min. Pour éviter l’ébullition, maintenez la température autour de 85 °C. Après récupération de l’antigène, laver les lames trois fois dans du Triton à 0,1 % dans 1x PBS (PBSTr), chaque lavage prenant 5 minutes à TA.
   REMARQUE : Cette étape est facultative pour la prolifération de l’antigène nucléaire cellulaire (PCNA).
3. Préparer une solution de HCl 2 N en diluant 12 N HCl dans de l’eau distillée. À l’aide d’un bloqueur de liquide (voir le tableau des matériaux), tracez une ligne comme barrière hydrophobe pour maintenir la solution de HCl 2 N autour des sections.
   1. Placez les lames sur des plateaux d’immunomarquage et appliquez 200-300 μL de la solution de HCl 2N. Incuber les plateaux à 37 °C pendant 30 min. Après récupération de l’antigène, laver trois fois dans du PBSTr à 0,1 %, chaque lavage prenant 5 min à TA.
      REMARQUE: Cette étape est une étape facultative pour la récupération de l’antigène BrdU.
4. Absorber et retirer la solution restante à l’aide de serviettes en papier. Ensuite, utilisez un bloqueur de liquide pour dessiner une barrière hydrophobe afin de maintenir la solution d’anticorps autour des sections si nécessaire.
5. Placez les lames sur des plateaux et appliquez 200-300 μL de solution bloquante, 3% (v/v) de sérum de cheval dans PBSTr) sur chaque lame, et incuber les lames pendant 1 h à TA.
6. Lavez les sections avec PBSTr pendant 5 minutes à TA et répétez trois fois.
7. Préparer les anticorps primaires (voir le tableau des matières) en utilisant la solution bloquante (200-300 μL de solution d’anticorps pour chaque lame). Retirez le PBSTr restant avec des serviettes en papier et placez les lames sur les plateaux d’immunocoloration. Appliquer la solution primaire d’anticorps sur chaque lame et incuber les plateaux pendant une nuit à 4 °C.
8. Lavez les sections avec PBSTr pendant 5 minutes à TA et répétez trois fois.
9. Préparer une solution d’anticorps secondaires fluorescents (voir le tableau des matériaux) à l’aide du tampon de blocage (1:500). Retirez le PBSTr restant avec des serviettes en papier et placez les lames sur les plateaux d’immunocoloration. Appliquez la solution d’anticorps secondaire sur chaque lame et plateau d’ombrage avec du papier d’aluminium. Incuber pendant 1-2 h à TA.
10. Lavez les sections avec PBSTr pendant 5 min à RT trois fois sans les exposer à la lumière.
11. Préparer la solution de Hoechst (dilution 1:500 dans 1x PBS, voir le tableau des matériaux) pour la coloration nucléaire. Retirez le PBSTr restant avec des serviettes en papier et placez les lames sur les plateaux d’immunocoloration. Appliquez la solution Hoechst sur chaque lame et recouvrez les plateaux de papier d’aluminium. Incuber pendant 30 min à RT.
12. Lavez les sections avec 1x PBS pendant 10 min à RT sans les exposer à la lumière.
13. Absorber et retirer les 1x PBS restants à l’aide d’essuie-tout et monter les sections sur des lames à l’aide d’un support de montage soluble dans l’eau (voir le tableau des matériaux) pour l’immunomarquage fluorescent. Placez lentement une glissière de couverture de 24 x 45 mm sur les sections. Conserver à 4 °C, sans exposer les lames à la lumière.
14. Observer et imager les coupes sous microscopie fluorescente ou microscopie confocale.

Résultats

Les blessures causées par un coup de couteau dans le tectum optique à l’aide de l’insertion d’une aiguille dans l’hémisphère droit (figure 1, figure 4A et figure 5A) induisent diverses réponses cellulaires, y compris la prolifération des cellules gliales radiales (CGR) et la génération de neurones nouveau-nés. De même, des populations âgées de poissons-zèbres et de médakas ont été utilisées pour contrer les ...

Discussion

Ici, un ensemble de méthodes est décrit qui peut être utilisé pour induire des blessures par arme blanche dans le tectum optique en utilisant une aiguille pour faciliter l’évaluation de la prolifération et de la différenciation du RGC après une lésion cérébrale. Les coups de couteau médiés par aiguille sont une méthode simple et efficacement mise en œuvre qui peut être appliquée à de nombreux échantillons expérimentaux à l’aide d’un ensemble standard d’outils. Des modèles de blessures par ar...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250