Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

Resumo

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Resumo

Enquanto o peixe-zebra tem uma capacidade superior de regenerar seu sistema nervoso central (SNC), o medaka tem uma menor capacidade regenerativa do SNC. Um modelo de lesão cerebral foi desenvolvido no tecto óptico adulto de zebrafish e medaka e análises histológicas e moleculares comparativas foram realizadas para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a alta capacidade regenerativa deste tecido entre essas espécies de peixes. Aqui é apresentado um modelo de lesão por arma branca para o tecto óptico adulto usando agulha e análises histológicas para proliferação e diferenciação das células-tronco neurais (NSCs). Uma agulha foi inserida manualmente na região central do tecto óptico e, em seguida, os peixes foram perfundidos intracárdicos e seus cérebros dissecados. Esses tecidos foram então criossecados e avaliados por imunomarcação contra os marcadores apropriados de proliferação e diferenciação do NSC. Este modelo de lesão tectum fornece resultados robustos e reprodutíveis tanto em zebrafish quanto em medaka, permitindo comparar as respostas do NSC após a lesão. Este método está disponível para pequenos teleósteos, incluindo zebrafish, medaka e killifish africano, e nos permite comparar sua capacidade regenerativa e investigar mecanismos moleculares únicos.

Introdução

O peixe-zebra (Danio rerio) tem maior capacidade de regeneração do sistema nervoso central (SNC) quando comparado a outros mamíferos ^1,2,3. Recentemente, para melhor compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esse aumento da capacidade regenerativa, análises comparativas da regeneração tecidual utilizando tecnologia de sequenciamento de última geração têm sido^{realizadas4,5,6}. As estruturas cerebrais do peixe-zebra e dos tetrápodes são bastante diferentes ^7,8,9. Isso significa que vários modelos de lesão cerebral usando peixes pequenos com estruturas cerebrais e características biológicas semelhantes foram desenvolvidos para facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes que contribuem para esse aumento da capacidade regenerativa.

Além disso, o medaka (Oryzias latipes) é um animal de laboratório popular com baixa capacidade de regeneração cardíaca e neuronal^10,11,12,13 em comparação com o peixe-zebra. Zebrafish e medaka têm estruturas cerebrais e nichos semelhantes para células-tronco neurais adultas (NSCs)^14,15,16,17. Em zebrafish e medaka, o tecto óptico inclui dois tipos de NSCs, células-tronco neuroepiteliais e células gliais radiais (RGCs)^15,18. Uma lesão por arma branca no tecto óptico de zebrafish adultos foi previamente desenvolvida, e este modelo foi usado para investigar os mecanismos moleculares que regulam a regeneração cerebral nesses animais 19,20,21,22,23. Este modelo de lesão por arma branca induziu neurogênese regenerativa a partir de CGRs 19,24,25. Esta lesão por arma branca no tecto óptico é um método robusto e reprodutível13,19,20,21,22,23,24,25. Quando o mesmo modelo de lesão foi aplicado ao medaka adulto, a baixa capacidade neurogênica dos CGRs no tecto óptico de medaka foi revelada através da análise comparativa da proliferação e diferenciação do CGR após a^lesão13.

Modelos de lesão por arma branca no tecto óptico também foram desenvolvidos em modelos de mummichog²⁶, mas detalhes da lesão tectômica não foram bem documentados quando comparados com lesão telencálica²⁷. A lesão por arma branca no tecto óptico utilizando zebrafish e medaka permite a investigação das respostas celulares diferenciais e expressão gênica entre espécies com capacidade regenerativa diferencial. Este protocolo descreve como realizar uma lesão por arma branca no tecto óptico usando uma agulha de injeção. Este método pode ser aplicado a pequenos peixes como zebrafish e medaka. Os processos de preparação de amostras para análise histológica e análise de proliferação e diferenciação celular usando imunohistoquímica fluorescente e criossecções são explicados aqui.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Industrial Avançada. Zebrafish e medaka foram mantidos de acordo com procedimentos padronizados²⁸.

1. Ferimento por arma branca no tecto óptico adulto

1. Preparar uma solução estoque de tricaína a 0,4% (p/v) para anestesia. Para uma solução-mãe de 100 ml, dissolver 400 mg de metanossulfonato de tricaína (ver Tabela de Materiais) em 90 ml de água destilada e ajustar o pH para 7,0 utilizando um tampão Tris HCl 1 M (pH 9,0). Uma vez ajustado o pH, adicionar água até 100 mL, fazer alíquotas apropriadas e armazená-las a -20 °C.
2. Para anestesiar o peixe-zebra adulto ou medaka, preparar uma solução de tricaína a 0,02 % (p/v) diluindo a solução-mãe de tricaína a 0,4 % com água de instalações para peixes.
3. Anestesiar os peixes com solução de tricaína a 0,02%; Ficam anestesiados quando não se movem ou não respondem ao toque (1-2 min).
4. Coloque o peixe anestesiado em uma bandeja de isopor (ver Tabela de Materiais) e fixe o peixe na vertical entre duas agulhas de 30 G inseridas verticalmente no isopor.
5. Segure o corpo do peixe para evitar que a cabeça do peixe se mova e insira verticalmente uma agulha de 30 G através do crânio na região medial de um dos hemisférios do tecto óptico (Figura 1A,B). A profundidade de inserção é de ~0,75 mm, quase igual à metade do comprimento do bisel de 30 G. Esta profundidade de inserção induz lesão cerebral em zebrafish e medaka devido ao tamanho corporal semelhante desses peixes.
   NOTA: Medaka tem escamas no crânio. Coçar e remover as escamas usando a agulha 30 G para induzir com eficiência e precisão a lesão por arma branca (Figura 1C).
6. Transfira os peixes feridos para um tanque de peixes com água fresca e mova o tanque para o sistema de criação de peixes assim que eles se recuperarem totalmente da anestesia.
   NOTA: Os peixes se recuperarão e começarão a se mover livremente dentro de alguns minutos.
7. Para a análise da linhagem após a lesão, preparar água fresca de instalação de peixes contendo 5 mM de bromodeoxiuridina (BrdU) (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, incubar os peixes com esta solução de 5 mM BrdU por um período de tempo pré-determinado^13,19 (conforme determinado por um planejamento experimental). Em seguida, dissecar esses peixes de acordo com a etapa 2 e avaliar a incorporação de BrdU e a identidade da linhagem celular, conforme apropriado.
   Observação : esta etapa é uma etapa opcional para análise de linhagem celular. Para detectar sinais BrdU, execute a recuperação de antígeno como mostrado na etapa 4.3.

2. Dissecção cerebral

1. Preparar solução de tricaína a 0,02%, uma bandeja de isopor para dissecção e uma seringa de 10 mL contendo solução salina tamponada com fosfato (1x PBS) com um tubo de extensão e agulhas de 30 G (ver Tabela de Materiais) para perfusão intracárdica.
2. Anestesiar os peixes feridos em pontos de tempo selecionados.
3. Coloque papel toalha na bandeja de isopor e coloque o peixe anestesiado sobre o papel toalha.
4. Segure o corpo do peixe no lugar inserindo verticalmente duas agulhas de 30 G em cada lado da nadadeira anal (Figura 2A).
5. Realizar incisão ventral do ânus ao coração (Figura 2B) e manter o coração visível inserindo mais duas agulhas de 30G de cada lado deste órgão (Figura 2C).
   NOTA: O coração é coberto pela camada epitelial prateada da hipoderme, tanto no peixe-zebra quanto no medaka (Figura 2C).
6. Remover suavemente a camada epitelial de prata com a ponta da pinça (Figura 2D).
7. Inserir a agulha 30G no ventrículo, mantendo o bisel para cima, e incidir no átrio com a pinça (Figura 2E). Pressione cuidadosamente a seringa para empurrar o PBS 1x e confirme se o átrio lavou o sangue.
   NOTA: Para evitar que a agulha penetre no ventrículo, insira cuidadosamente a agulha até a profundidade do meio bisel e, em seguida, ajuste a profundidade de inserção. Se a perfusão for bem feita, as brânquias ficam brancas (Figura 2F,G).
8. Pare a perfusão depois que o sangue for drenado e as brânquias ficarem brancas.
9. Retire as agulhas que fixam o corpo do peixe no lugar e fixe o peixe ventralmente para baixo (Figura 2H). Cortar a medula espinhal e remover o crânio do tecto óptico e do telencéfalo (Figura 2I). Em seguida, corte os nervos ópticos e disseque o cérebro cuidadosamente.
   NOTA: Cuidado com os nervos ópticos durante a dissecção, porque os nervos estão conectados ao tecto. Quando o nervo óptico é puxado, o tecto óptico pode ser descolado do cérebro. Se a remoção de sangue não estiver completa, o cérebro parece rosa claro (o cérebro direito na Figura 2J).
10. Transfira os cérebros para tubos de 1,5 ml com 1 ml de paraformaldeído a 4 % em 1x PBS e fixe-os durante a noite a 4 °C.

3. Preparação das secções congeladas

1. Lave os cérebros fixos três vezes em 1x PBS por 5 min cada.
2. Para criar os cérebros, transfira-os para tubos de 1,5 ml com 1 ml de sacarose a 30 % (p/v) em 1x PBS e incube-os durante a noite a 4 °C. Preparar o composto de incorporação (mistura 2:1 de composto OCT e 30% de sacarose, ver Tabela de Materiais) combinando 30 mL de OCT e 15 mL de sacarose a 30%. Conservar a 4 °C.
   NOTA: Para remover as bolhas do composto misturado, centrifugar os tubos de 50 mL a 10.000 x g por 2 min à temperatura ambiente ou colocar os tubos na vertical durante a noite.
3. Incubar um bloco de alumínio durante a noite a -80 °C para arrefecer o criomolde (ver Tabela de Materiais) imediatamente após o cérebro dissecado ser incorporado no criomolde com o composto incorporador.
   NOTA: O nitrogênio líquido também pode ser usado para resfriar o bloco de alumínio. Nesse caso, o bloco de alumínio deve ser colocado em uma caixa de isopor preenchida com nitrogênio líquido suficiente para cobrir o bloco de alumínio pouco antes de incorporar. Após confirmar a sublimação do nitrogênio líquido, coloque o criomold sobre o bloco de alumínio pré-resfriado. É melhor confirmar quantos criomoldes podem ser colocados no bloco de alumínio de uma só vez. É aconselhável usar nitrogênio líquido ou um bloco pré-resfriado adicional para garantir espaço suficiente para resfriar todas as amostras rapidamente.
4. Coloque o bloco de alumínio pré-resfriado em uma caixa de isopor. Use uma caixa de isopor com tampa para evitar que o bloco de alumínio aqueça.
5. Para cortes coronais, incorporar o cérebro em um criomold e ajustar a orientação usando pinça sob o microscópio (Figura 3A).
6. Coloque o criomold sobre o bloco de alumínio pré-resfriado na caixa de isopor e deixe o composto OCT congelar (Figura 3B). Quando o composto OCT começa a congelar, torna-se branco.
7. Aplique um pequeno círculo de composto OCT em um disco de amostra e monte o criobloco para prender o criobloco ao disco da amostra.
8. Coloque o disco da amostra no criostato e congele completamente o composto de OCT.
9. Coloque o disco da amostra na cabeça da amostra no criostato.
10. Defina a orientação do criobloco e corte a OCT para remover quaisquer regiões extras.
    NOTA: Ajuste a orientação do plano de corte durante o corte do telencéfalo. A lâmina é equipada com um criostato. É possível ajustar a orientação do plano de corte alterando o ângulo da cabeça do corpo de prova.
11. Cortar secções seriais de 14 μm de espessura através de todo o tecto óptico utilizando um criostato. Conservar as lâminas a -25 °C.
    NOTA: O armazenamento a longo prazo deve ser a -80 °C.

4. Imunomarcação fluorescente

1. Lâminas de vidro seco em um rack deslizante por 30 min à temperatura ambiente (RT). Lave as lâminas em 1x PBS por 30 min no RT. Se a imunomarcação com anticorpos anti-PCNA ou BrdU for realizada, prossiga para a etapa 4.2 ou etapa 4.3.
2. Preparar 500 ml de citrato de sódio 10 mM num copo de 500 ml e aquecer o tampão citrato a 85 °C num agitador magnético de placa quente, em seguida, colocar as lâminas num suporte de coloração de lâminas e incubar o rack no tampão citrato a 85 °C durante 30 minutos. Para evitar a ebulição, mantenha a temperatura em torno de 85 °C. Após a recuperação do antígeno, lavar as lâminas três vezes em Triton a 0,1% em 1x PBS (PBSTr), com cada lavagem levando 5 min em RT.
   NOTA: Esta etapa é uma etapa opcional para a recuperação do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA).
3. Preparar uma solução de HCl 2 N diluindo 12 N HCl em água destilada. Usando um bloqueador de líquidos (ver Tabela de Materiais), desenhe uma linha como uma barreira hidrofóbica para manter a solução de HCl 2 N ao redor das seções.
   1. Coloque as lâminas em bandejas de imunomarcação e aplique 200-300 μL da solução de HCl 2N. Incubar os tabuleiros a 37 °C durante 30 min. Após a recuperação do antigénio, lavar três vezes em PBSTr a 0,1 % com cada lavagem a tomar 5 minutos em RT.
      NOTA: Esta etapa é uma etapa opcional para a recuperação de antígeno BrdU.
4. Absorva e retire a solução restante com papel toalha. Em seguida, use um bloqueador líquido para desenhar uma barreira hidrofóbica para manter a solução de anticorpos ao redor das seções, conforme necessário.
5. Coloque as lâminas em bandejas e aplique 200-300 μL de solução bloqueadora, 3% (v/v) de soro de cavalo em PBSTr) em cada lâmina e incube as lâminas por 1 h no TR.
6. Lave os cortes com PBSTr por 5 min no RT e repita três vezes.
7. Preparar os anticorpos primários (ver Tabela de Materiais) utilizando a solução de bloqueio (200-300 μL de solução de anticorpos para cada lâmina). Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplicar a solução primária de anticorpos em cada lâmina e incubar tabuleiros durante a noite a 4 °C.
8. Lave os cortes com PBSTr por 5 min no RT e repita três vezes.
9. Preparar a solução de anticorpos secundários fluorescentes (ver Tabela de Materiais) utilizando o tampão de bloqueio (1:500). Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplique a solução de anticorpos secundários em todas as bandejas de lâmina e sombra com papel alumínio. Incubar por 1-2 h no TR.
10. Lave os cortes com PBSTr por 5 min em TR três vezes sem expô-los à luz.
11. Preparar a solução Hoechst (diluição de 1:500 em 1x PBS, ver Tabela de Materiais) para coloração nuclear. Retire o PBSTr restante com papel toalha e coloque as lâminas nas bandejas de imunomarcação. Aplique a solução Hoechst em cada lâmina e cubra as bandejas com papel alumínio. Incubar por 30 min no TR.
12. Lave as seções com 1x PBS por 10 min no RT sem expô-las à luz.
13. Absorva e remova o 1x PBS restante usando papel toalha e monte as seções em lâminas usando um meio de montagem solúvel em água (consulte a Tabela de Materiais) para imunomarcação fluorescente. Coloque lentamente uma tampa de 24 x 45 mm nas seções. Conservar a 4 °C, sem expor as lâminas à luz.
14. Observar e obter imagens dos cortes sob microscopia fluorescente ou microscopia confocal.

Resultados

A lesão por arma branca no tecto óptico com inserção de agulha no hemisfério direito (Figura 1, Figura 4A e Figura 5A) induz várias respostas celulares, incluindo a proliferação de células gliais radiais (CGR) e a geração de neurônios recém-nascidos. Similarmente, populações envelhecidas de zebrafish e medaka foram usadas para neutralizar quaisquer efeitos do envelhecimento na resposta regenerativa. Em seguida, foi re...

Discussão

Descreve-se aqui um conjunto de métodos que podem ser utilizados para induzir lesões por arma branca no tecto óptico, utilizando uma agulha para facilitar a avaliação da proliferação e diferenciação do CGR após lesão cerebral. A facada mediada por agulha é um método simples e eficientemente implementado que pode ser aplicado a muitas amostras experimentais usando um conjunto padrão de ferramentas. Modelos de lesão por arma branca para várias regiões do cérebro do peixe-zebra foram desenvolvidos

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250