Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

Zusammenfassung

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Zusammenfassung

Während Zebrafische eine überlegene Fähigkeit haben, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren, hat Medaka eine geringere ZNS-Regenerationsfähigkeit. Es wurde ein Hirnverletzungsmodell im adulten optischen Tectum von Zebrafischen und Medaka entwickelt und vergleichende histologische und molekulare Analysen wurden durchgeführt, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die hohe Regenerationsfähigkeit dieses Gewebes bei diesen Fischarten regulieren. Hier wird ein Stichwundenmodell für das adulte optische Tectum unter Verwendung einer Nadel und histologischer Analysen zur Proliferation und Differenzierung der neuralen Stammzellen (NSCs) vorgestellt. Eine Nadel wurde manuell in den zentralen Bereich des optischen Tectums eingeführt, und dann wurden die Fische intrakardial perfundiert und ihre Gehirne wurden seziert. Diese Gewebe wurden dann kryosektioniert und mittels Immunfärbung gegen die entsprechenden NSC-Proliferations- und Differenzierungsmarker bewertet. Dieses Tectum-Verletzungsmodell liefert robuste und reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka, so dass die NSC-Reaktionen nach einer Verletzung verglichen werden können. Diese Methode ist für kleine Teleosten wie Zebrafische, Medaka und afrikanische Killifische verfügbar und ermöglicht es uns, ihre Regenerationsfähigkeit zu vergleichen und einzigartige molekulare Mechanismen zu untersuchen.

Einleitung

Zebrafische (Danio rerio) haben im Vergleich zu anderen Säugetieren eine erhöhte Fähigkeit, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren ^1,2,3. Um die molekularen Mechanismen, die dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit zugrunde liegen, besser zu verstehen, wurden kürzlich vergleichende Analysen der Geweberegeneration mit Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt ^4,5,6. Die Gehirnstrukturen bei Zebrafischen und Tetrapoden sind sehr unterschiedlich ^7,8,9. Dies bedeutet, dass mehrere Hirnverletzungsmodelle mit kleinen Fischen mit ähnlichen Gehirnstrukturen und biologischen Merkmalen entwickelt wurden, um die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erleichtern, die zu dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit beitragen.

Darüber hinaus ist Medaka (Oryzias latipes) ein beliebtes Labortier mit einer geringen Kapazität für die Herz- und neuronale Regeneration^10,11,12,13 im Vergleich zu Zebrafischen. Zebrafische und Medaka haben ähnliche Gehirnstrukturen und Nischen für adulte neurale Stammzellen (NSCs)^14,15,16,17. Im Zebrafisch und in der Medaka umfasst das optische Tectum zwei Arten von NSCs, neuroepithelähnliche Stammzellen und radiale Gliazellen (RGCs)^15,18. Eine Stichwundenverletzung für das optische Tectum von erwachsenen Zebrafischen wurde zuvor entwickelt, und dieses Modell wurde verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Gehirnregeneration bei diesen Tieren regulieren 19,20,21,22,23. Dieses junge, erwachsene Zebrafisch-Stichverletzungsmodell induzierte eine regenerative Neurogenese aus RGCs 19,24,25. Diese Stichwundenverletzung im optischen Tectum ist eine robuste und reproduzierbare Methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Wenn das gleiche Verletzungsmodell auf adulte Medaka angewendet wurde, wurde die geringe neurogene Kapazität von RGCs im Medaka Optic Tectum durch die vergleichende Analyse der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach der Verletzung¹³ aufgedeckt.

Stichwundenverletzungsmodelle im optischen Tectum wurden auch in Mummichog-Modellen²⁶ entwickelt, aber Details der Tectumverletzung wurden im Vergleich zur telenzephalen Verletzung²⁷ nicht gut dokumentiert. Die Stichwundenverletzung im optischen Tectum mit Zebrafisch und Medaka ermöglicht die Untersuchung der differentiellen zellulären Reaktionen und der Genexpression zwischen Arten mit unterschiedlicher Regenerationsfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Stichwunde im optischen Tectum mit einer Injektionsnadel durchgeführt wird. Diese Methode kann auf kleine Fische wie Zebrafische und Medaka angewendet werden. Die Verfahren zur Probenvorbereitung für die histologische Analyse und die zelluläre Proliferations- und Differenzierungsanalyse mittels fluoreszierender Immunhistochemie und Kryosektionen werden hier erläutert.

Protokoll

Alle Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology genehmigt. Zebrafische und Medaka wurden nach Standardverfahren gehalten²⁸.

1. Stichwundenverletzung im erwachsenen optischen Tectum

1. Bereiten Sie eine 0,4% (w/v) Tricain-Stammlösung für die Anästhesie vor. Für eine 100-ml-Stammlösung werden 400 mg Tricainmethansulfonat (siehe Materialtabelle) in 90 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) auf 7,0 eingestellt. Sobald der pH-Wert eingestellt ist, fügen Sie Wasser bis zu 100 ml hinzu, stellen Sie dann geeignete Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.
2. Um den erwachsenen Zebrafisch oder Medaka zu betäuben, bereiten Sie eine 0,02 %ige (w/v) Tricain-Lösung vor, indem Sie die 0,4 %ige Tricain-Stammlösung mit Fischwasser verdünnen.
3. Betäuben Sie den Fisch mit 0,02% iger Tricainlösung; Sie werden betäubt, wenn sie sich nicht bewegen oder auf Berührung reagieren (1-2 min).
4. Legen Sie den betäubten Fisch auf eine Styroporschale (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie den Fisch aufrecht zwischen zwei 30-G-Nadeln, die senkrecht in das Styropor eingeführt werden.
5. Halten Sie den Fischkörper fest, um zu verhindern, dass sich der Fischkopf bewegt, und führen Sie vertikal eine 30-G-Nadel durch den Schädel in den medialen Bereich einer der optischen Tectum-Hemisphären ein (Abbildung 1A, B). Die Einstecktiefe beträgt ~0,75 mm und entspricht damit fast der halben Länge der 30-G-Fase. Diese Einstichtiefe führt aufgrund der ähnlichen Körpergröße dieser Fische zu Hirnverletzungen bei Zebrafischen und Medaka.
   HINWEIS: Medaka hat Schuppen auf dem Schädel. Kratzen und entfernen Sie die Schuppen mit der 30-G-Nadel, um die Stichwunde effizient und genau zu induzieren (Abbildung 1C).
6. Bringen Sie die verletzten Fische in ein Aquarium mit frischem Fischwasser und bringen Sie das Aquarium in das Fischzuchtsystem, sobald sie sich vollständig von der Narkose erholt haben.
   HINWEIS: Die Fische erholen sich und beginnen sich innerhalb weniger Minuten frei zu bewegen.
7. Für die Abstammungsanalyse nach der Verletzung bereiten Sie frisches Fischwasser mit 5 mM Bromdesoxyuridin (BrdU) vor (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie die Fische dann mit dieser 5 mM BrdU-Lösung für eine vorbestimmte Zeitspanne^13,19 (wie durch ein Versuchsdesign bestimmt). Dann sezieren Sie diese Fische gemäß Schritt 2 und bewerten Sie gegebenenfalls den BrdU-Einbau und die Identität der Zelllinie.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für die Analyse der Zelllinie. Um BrdU-Signale zu erkennen, führen Sie den Antigenabruf wie in Schritt 4.3 gezeigt durch.

2. Dissektion des Gehirns

1. Bereiten Sie eine 0,02%ige Tricainlösung, eine Styroporschale zur Dissektion und eine 10-ml-Spritze mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (1x PBS) mit einem Verlängerungsschlauch und 30 G-Nadeln (siehe Materialtabelle) für die intrakardiale Perfusion vor.
2. Betäuben Sie die verletzten Fische zu ausgewählten Zeitpunkten.
3. Legen Sie Papiertücher auf die Styroporschale und legen Sie den betäubten Fisch auf die Papiertücher.
4. Halten Sie den Fischkörper an Ort und Stelle, indem Sie zwei 30-G-Nadeln auf beiden Seiten der Afterflosse vertikal einführen (Abbildung 2A).
5. Machen Sie einen ventralen Schnitt vom Anus zum Herzen (Abbildung 2B) und halten Sie das Herz sichtbar, indem Sie auf jeder Seite dieses Organs zwei weitere 30-G-Nadeln einführen (Abbildung 2C).
   HINWEIS: Das Herz ist sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka mit der silbrigen Epithelschicht der Hypodermis bedeckt (Abbildung 2C).
6. Entfernen Sie vorsichtig die Silberepithelschicht mit der Spitze der Pinzette (Abbildung 2D).
7. Führen Sie die 30-G-Nadel unter Beibehaltung der Abschrägung in den Ventrikel ein und machen Sie mit der Pinzette einen Schnitt in den Vorhof (Abbildung 2E). Drücken Sie vorsichtig auf die Spritze, um das 1x PBS zu drücken, und bestätigen Sie, dass der Vorhof das Blut gespült hat.
   HINWEIS: Um zu verhindern, dass die Nadel in den Ventrikel eindringt, führen Sie die Nadel vorsichtig bis zur Tiefe der halben Fase ein und stellen Sie dann die Einstichtiefe ein. Wenn die Perfusion gut ist, färben sich die Kiemen weiß (Abbildung 2F,G).
8. Stoppen Sie die Perfusion, nachdem das Blut abgelassen wurde und die Kiemen weiß werden.
9. Entfernen Sie die Nadeln, mit denen der Fischkörper fixiert ist, und fixieren Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten (Abbildung 2H). Schneiden Sie das Rückenmark ab und entfernen Sie den Schädel aus dem optischen Tectum und dem Telencephalon (Abbildung 2I). Schneiden Sie dann die Sehnerven ab und sezieren Sie das Gehirn vorsichtig.
   HINWEIS: Achten Sie während der Dissektion auf die Sehnerven, da die Nerven mit dem Tectum verbunden sind. Wenn der Sehnerv gezogen wird, kann das optische Tectum vom Gehirn gelöst werden. Wenn die Blutentnahme nicht abgeschlossen ist, sieht das Gehirn hellrosa aus (die rechte Gehirnhälfte in Abbildung 2J).
10. Das Gehirn wird in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 4 % Paraformaldehyd in 1x PBS überführt und über Nacht bei 4 °C fixiert.

3. Vorbereitung von Tiefkühlschnitten

1. Waschen Sie die fixierten Gehirne dreimal in 1x PBS für jeweils 5 Minuten.
2. Um das Gehirn zu kryoprotektieren, überführen Sie es in 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 30 % (w/v) Saccharose in 1x PBS und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C. Die Einbettmasse (2:1-Mischung aus OCT-Verbindung und 30 % Saccharose, siehe Materialtabelle) wird durch Kombinieren von 30 ml OCT und 15 ml 30 %iger Saccharose hergestellt. Lagern Sie diese bei 4 °C.
   HINWEIS: Um die Blasen aus der gemischten Masse zu entfernen, zentrifugieren Sie die 50-ml-Röhrchen bei 10.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur oder stellen Sie die Röhrchen über Nacht aufrecht auf.
3. Inkubieren Sie einen Aluminiumblock über Nacht bei -80 °C, um den Kryomold (siehe Materialtabelle) unmittelbar nach dem Einbetten des präparierten Gehirns in den Kryomold mit der Einbettungsmasse zu kühlen.
   HINWEIS: Flüssiger Stickstoff kann auch zur Kühlung des Aluminiumblocks verwendet werden. In diesem Fall sollte der Aluminiumblock in eine Styroporbox gelegt werden, die mit genügend flüssigem Stickstoff gefüllt ist, um den Aluminiumblock kurz vor dem Einbetten abzudecken. Nachdem Sie die Flüssigstickstoffsublimation bestätigt haben, legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock. Es ist besser zu bestätigen, wie viele Kryoformen gleichzeitig auf dem Aluminiumblock platziert werden können. Es ist ratsam, flüssigen Stickstoff oder einen zusätzlichen vorgekühlten Block zu verwenden, um genügend Platz für eine schnelle Kühlung aller Proben zu gewährleisten.
4. Legen Sie den vorgekühlten Aluminiumblock in eine Styroporbox. Verwenden Sie eine Styroporbox mit Deckel, um ein Erwärmen des Aluminiumblocks zu verhindern.
5. Für koronale Schnitte betten Sie das Gehirn in einen Kryomold ein und passen Sie die Ausrichtung mit einer Pinzette unter dem Mikroskop an (Abbildung 3A).
6. Legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock in der Styroporbox und lassen Sie die OCT-Verbindung einfrieren (Abbildung 3B). Wenn die OCT-Verbindung zu gefrieren beginnt, wird sie weiß.
7. Tragen Sie einen kleinen Kreis OCT-Verbindung auf eine Probenscheibe auf und montieren Sie den Kryoblock, um den Kryoblock an der Probenscheibe zu befestigen.
8. Legen Sie die Probenscheibe in den Kryostaten und frieren Sie die OCT-Verbindung vollständig ein.
9. Legen Sie die Probenscheibe auf den Probenkopf im Kryostat.
10. Legen Sie die Ausrichtung des Kryoblocks fest und schneiden Sie das OAT zu, um zusätzliche Bereiche zu entfernen.
    HINWEIS: Passen Sie die Ausrichtung der Schnittebene an, während Sie das Telencephalon schneiden. Die Klinge ist mit einem Kryostaten ausgestattet. Es ist möglich, die Ausrichtung der Schnittebene durch Ändern des Winkels des Probenkopfes anzupassen.
11. Schneiden Sie 14 μm dicke Serienschnitte mit einem Kryostaten durch das gesamte optische Tectum. Lagern Sie die Objektträger bei -25 °C.
    HINWEIS: Die Langzeitlagerung sollte bei -80 °C erfolgen.

4. Fluoreszierende Immunfärbung

1. Trockene Glasobjektträger in einem Objektträgergestell für 30 min bei Raumtemperatur (RT). Objektträger in 1x PBS für 30 min bei RT waschen. Wenn eine Immunfärbung mit Anti-PCNA- oder BrdU-Antikörpern durchgeführt werden soll, fahren Sie mit Schritt 4.2 oder Schritt 4.3 fort.
2. Bereiten Sie 500 ml 10 mM Natriumcitrat in einem 500-ml-Becherglas vor und erwärmen Sie den Citratpuffer auf einem Heizplatten-Magnetrührer auf 85 °C, legen Sie dann die Objektträger in ein Objektträger-Färbegestell und inkubieren Sie das Gestell im Citratpuffer bei 85 °C für 30 Minuten. Um ein Kochen zu vermeiden, halten Sie die Temperatur bei etwa 85 °C. Nach der Antigenentnahme werden die Objektträger dreimal in 0,1 % Triton in 1x PBS (PBSTr) gewaschen, wobei jeder Waschgang 5 min bei RT dauert.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für den Abruf des proliferierenden Zellkernantigens (PCNA).
3. Bereiten Sie eine 2 N HCl-Lösung vor, indem Sie 12 N HCl in destilliertem Wasser verdünnen. Zeichnen Sie mit einem Flüssigkeitsblocker (siehe Materialtabelle) eine Linie als hydrophobe Barriere, um die 2 N HCl-Lösung um die Abschnitte herum zu halten.
   1. Legen Sie die Objektträger auf Immunfärbungsschalen und tragen Sie 200-300 μl der 2N HCl-Lösung auf. Inkubieren Sie die Schalen bei 37 °C für 30 Minuten. Nach der Antigengewinnung dreimal in 0,1 % PBSTr waschen, wobei jede Wäsche 5 Minuten bei RT dauert.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist ein optionaler Schritt für den Abruf des BrdU-Antigens.
4. Nehmen Sie die restliche Lösung auf und entfernen Sie sie mit Papiertüchern. Verwenden Sie dann einen Flüssigkeitsblocker, um eine hydrophobe Barriere zu ziehen, um die Antikörperlösung bei Bedarf um die Abschnitte herum zu halten.
5. Legen Sie die Objektträger auf Tabletts und tragen Sie 200-300 μl Blockierlösung, 3% (v/v) Pferdeserum in PBSTr) auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie die Objektträger 1 Stunde lang bei RT.
6. Waschen Sie die Abschnitte mit PBSTr für 5 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
7. Bereiten Sie die Primärantikörper (siehe Materialtabelle) mit der Blockierlösung (200-300 μl Antikörperlösung für jeden Objektträger) vor. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die primäre Antikörperlösung auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie die Schalen über Nacht bei 4 °C.
8. Waschen Sie die Abschnitte mit PBSTr für 5 Minuten bei RT und wiederholen Sie den Vorgang dreimal.
9. Fluoreszierende sekundäre Antikörperlösung (siehe Materialtabelle) wird mit dem Blockierungspuffer (1:500) hergestellt. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die sekundäre Antikörperlösung auf jeden Objektträger auf und beschatten Sie sie mit Aluminiumfolie. 1-2 h bei RT inkubieren.
10. Waschen Sie die Schnitte dreimal 5 Minuten lang mit PBSTr bei RT, ohne sie dem Licht auszusetzen.
11. Hoechst-Lösung (1:500 Verdünnung in 1x PBS, siehe Materialtabelle) für die Kernfärbung vorbereiten. Entfernen Sie die restlichen PBSTr mit Küchenpapier und legen Sie die Objektträger auf die Immunfärbungsschalen. Tragen Sie die Hoechst-Lösung auf jeden Objektträger auf und decken Sie die Schalen mit Alufolie ab. 30 Minuten bei RT inkubieren.
12. Waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 10 min bei RT, ohne sie dem Licht auszusetzen.
13. Absorbieren und entfernen Sie die restlichen 1x PBS mit Papiertüchern und montieren Sie die Abschnitte auf Objektträgern mit einem wasserlöslichen Einbettmedium (siehe Materialtabelle) für die fluoreszierende Immunfärbung. Setzen Sie langsam ein 24 x 45 mm großes Deckglas auf die Abschnitte. Bei 4 °C lagern, ohne die Objektträger dem Licht auszusetzen.
14. Beobachten und befotografieren Sie die Schnitte unter Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler Mikroskopie.

Ergebnisse

Eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum durch Einführen der Nadel in die rechte Hemisphäre (Abbildung 1, Abbildung 4A und Abbildung 5A) induziert verschiedene zelluläre Reaktionen, einschließlich der Proliferation radialer Gliazellen (RGC) und der Bildung neugeborener Neuronen. In ähnlicher Weise wurden gealterte Populationen von Zebrafischen und Medaka verwendet, um Alterungseffekten in der regenerativen Reaktion entgeg...

Diskussion

Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die verwendet werden können, um Stichwundverletzungen im optischen Tectum unter Verwendung einer Nadel zu induzieren, um die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach einer Hirnverletzung zu erleichtern. Nadelvermittelte Stichwunden sind eine einfache, effizient implementierte Methode, die mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden kann. Es wurden Stichwundenmodelle für verschiedene Regionen des Zebrafischgehir...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringe	TERUMO	SS-10ESZ
1M Tris-HCl (pH 9.0)	NIPPON GENE	314-90381
30 G needle	Dentronics	HS-2739A
4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution	Wako	163-20145
Aluminum block			115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds
Anti-BLBP	Millipore	ABN14	1:500
Anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:500
Anti-HuC	Invitrogen	A21271	1:100
Anti-PCNA	Santa Cruz Biotechnology	sc-56	1:200
Brmodeoxyuridine	Wako	023-15563
Confocal microscope C1 plus	Nikon
Cryomold	Sakura Finetek Japan	4565	10 x 10 x 5 mm (W x D x H)
Cryostat	Leica	CM1960
Danio rerio WT strains RW
Extension tube	TERUMO	SF-ET3520
Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues	SIGMA-ALDRICH	F4680-25ML
Forceps	DUMONT	11252-20
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32723
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035
Hoechst 33342 solution	Dojindo	23491-52-3
Hydrochloric Acid	Wako	080-01066
Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange	COSMO BIO CO., LTD.	10DO
MAS coat sliding glass	Matsunami glass	MAS-01
Micro cover glass	Matsunami glass	C024451
Microscopy	Nikon	SMZ745T
Normal horse serum blocking solution	VECTOR LABRATORIES	S-2000-20
O.C.T Compound	Sakura Finetek Japan	83-1824
Oryzias latipes WT strains Cab
PAP Pen Super-Liquid Blocker	DAIDO SANGYO	PAP-S
Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4	TaKaRa	T9181
Styrofoam tray			100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray
Sucrose	Wako	196-00015	30 % (w/v) Sucrose in PBS
Tricaine (MS-222)	nacarai tesque	14805-24
Trisodium Citrate Dihydrate	Wako	191-01785
Triton X-100	Wako	04605-250