Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

Resumen

La interacción de la susceptibilidad genética, la inmunidad de la mucosa y el entorno microecológico intestinal está involucrada en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En este estudio, aplicamos el trasplante de microbiota fecal a ratones deficientes en IL-10 e investigamos su impacto en la inflamación del colon y la función cardíaca.

Resumen

Con el desarrollo de la microecología en los últimos años, la relación entre las bacterias intestinales y la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) ha atraído una atención considerable. La evidencia acumulada sugiere que la microbiota disbiótica desempeña un papel activo en el desencadenamiento o empeoramiento del proceso inflamatorio en la EII y que el trasplante de microbiota fecal (TMF) es una estrategia terapéutica atractiva, ya que la transferencia de una microbiota sana al paciente con EII podría restaurar la comunicación adecuada entre el huésped y la microbiota. Sin embargo, los mecanismos moleculares no están claros, y la eficacia del TMF no ha sido muy bien establecida. Por lo tanto, se necesitan más estudios en modelos animales de EII. En este método, aplicamos FMT de ratones C57BL / 6J de tipo salvaje a ratones deficientes en IL-10, un modelo de ratón de colitis ampliamente utilizado. El estudio elabora la recolección de gránulos fecales de los ratones donantes, la fabricación de la solución / suspensión fecal, la administración de la solución fecal y el monitoreo de la enfermedad. Encontramos que el FMT mitigó significativamente el deterioro cardíaco en ratones knockout IL-10, lo que subraya su potencial terapéutico para el tratamiento de la EII.

Introducción

El microecosistema intestinal humano es extremadamente complejo, con más de 1000 especies de bacterias en el intestino de una persona sana¹. La flora intestinal está involucrada en el mantenimiento de las funciones fisiológicas normales del intestino y la respuesta inmune y tiene una relación inseparable con el cuerpo humano. La evidencia acumulada sugiere que el microbioma intestinal constituye el último órgano humano, que es parte del cuerpo humano, no solo un grupo de parásitos². Una relación simbiótica "saludable" entre la microbiota intestinal, sus metabolitos y el sistema inmune del huésped establecida en la vida temprana es fundamental para mantener la homeostasis intestinal. En algunas condiciones anormales, como la inflamación crónica, los cambios en el entorno interno y externo del cuerpo alteran seriamente la homeostasis intestinal, lo que resulta en un desequilibrio persistente de la comunidad microbiana del intestino, llamado disbiosis³. De hecho, la exposición a múltiples factores ambientales, incluida la dieta, los medicamentos y los patógenos, puede provocar cambios en la microbiota.

La disbiosis se asocia con la patogénesis de una variedad de enfermedades intestinales, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), el síndrome del intestino irritable (SII) y la enteritis pseudomembranosa, así como una creciente lista de trastornos extraintestinales, incluyendo enfermedades cardiovasculares, obesidad y alergia⁴. El perfil de la microbiota reveló que los pacientes con EII tienen una disminución dramática de la diversidad bacteriana, así como alteraciones marcadas en las poblaciones de algunas cepas bacterianas específicas ^5,6. Estos estudios demostraron menos Lachnospiraceae y Bacteroidetes pero más Proteobacteria y Actinobacteria en pacientes con EII. Se cree que la patogénesis de la EII está relacionada con diversos factores patogénicos, incluyendo flora intestinal anormal, respuesta inmune desregulada, desafíos ambientales y variantes genéticas⁷. Abundante evidencia sugiere que las bacterias intestinales desempeñan un papel en las fases de inicio y aplicación de la EII^8,9, lo que indica que la corrección de la disbiosis intestinal puede representar un enfoque novedoso para la terapia y / o el tratamiento de mantenimiento de la EII.

El prototipo del trasplante de microbiota fecal (TMF) comenzó en la antigua China¹⁰. En 1958, el Dr. Eiseman y sus colegas trataron con éxito cuatro casos de enteritis pseudomembranosa severa con materia fecal de donantes sanos a través de enema, abriendo un nuevo capítulo en la medicina occidental moderna utilizando heces humanas para tratar enfermedades humanas¹¹. Se ha encontrado que la infección por Clostridium difficile (ICD) es la principal causa de enteritis pseudomembranosa¹² y FMT es altamente efectiva en el tratamiento de la ICD. En los últimos ocho años, el TMF se ha convertido en una terapia estándar para el tratamiento de la ICD^{recurrente 13}, lo que ha dado lugar a nuevos estudios que investigan el papel del TMF en otros trastornos, como la EII. En los últimos veinte años, numerosos informes de casos y estudios de cohortes han documentado el uso de FMT en pacientes con EII¹⁴. Un metanálisis, que incluyó 12 ensayos, mostró que el 62% de los pacientes con enfermedad de Crohn (EC) lograron la remisión clínica después del TMF, y el 69% de los pacientes con EC tuvieron respuesta clínica¹⁵. A pesar de estos hallazgos alentadores, el papel del TMF en el tratamiento de la EII sigue siendo incierto, y los mecanismos por los cuales el TMF mejora la inflamación intestinal son poco conocidos. Se necesita más investigación antes de que el TMF pueda unirse al arsenal actual de opciones de tratamiento para la EII en las clínicas.

En este protocolo, aplicamos FMT en ratones IL-10-^/-, que desarrollan colitis espontáneamente después del destete y han servido como un estándar de oro para reflejar la naturaleza multifactorial de la EII^16,17,18. Los ratones IL-10−^/− se han utilizado ampliamente para diseccionar la etiología de la EII porque presentan características moleculares e histológicas similares a las de los pacientes con EII y, al igual que los pacientes, la enfermedad puede mejorarse con terapia anti-TNFα¹⁶. Los ratones IL10^−/− envejecidos (>9 meses de edad) tienen un mayor tamaño cardíaco y una función cardíaca deteriorada en comparación con los ratones de tipo salvaje de la misma edad¹⁹, lo que lo convierte en un excelente modelo para estudiar las enfermedades cardíacas inducidas por colitis. Sin embargo, también se pueden usar otros modelos murinos de colitis, como el modelo de sulfato de sodio de dextrano y el modelo de colitis inducida por células T. Administramos suspensión fecal por sonda oral, que demostró ser una ruta efectiva y mejor que el enema en humanos²⁰.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Rama Médica de la Universidad de Texas en Galveston (Protocolo # 1512071A).

1. Recogida de pellets fecales frescos

1. Prepare toallas de papel estériles, pinzas romas y tubos cónicos de 50 ml.
   1. Coloque algunas toallas de papel y fórceps en bolsas de autoclave separadas y autoclave a 180 °C a fuego seco durante 30 min. Use tubos cónicos estériles también. Pese los tubos cónicos y anote su peso en los tubos.
2. Encienda el gabinete de bioseguridad en la habitación del animal.
3. Tome una jaula de ratón limpia esterilizada en autoclave sin ropa de cama y colóquela en el gabinete de bioseguridad. Retire la tapa y el estante de comida y colóquelos dentro del gabinete.
4. Coloque algunas toallas de papel estériles en la parte inferior de la jaula y vuelva a colocar la rejilla de metal en la parte superior de la jaula.
5. Identifique a los donantes fecales de la misma edad y coloque la jaula del ratón en el gabinete de bioseguridad. Abra la jaula y agarre suavemente un ratón donante (C57BL / 6J) por la cola y colóquelo en la rejilla metálica en la parte superior de la jaula limpia.
6. Coloque la cubierta de la jaula en la parte superior del estante y espere a que el animal (s) defequen.
   NOTA: Coloque algunos compañeros de camada de ratón en el estante simultáneamente.
7. Recoja los gránulos fecales y colóquelos en un tubo cónico estéril de 50 ml. Pool los pellets por sexo. No mezcle pellets fecales recolectados de machos y hembras.
8. Pesa el tubo de nuevo y calcula el peso de los gránulos fecales.

2. Preparación de la suspensión fecal

1. Prepare una solución estéril (glicerol al 10% en solución salina normal).
2. Agregue 10 ml de glicerol/solución salina normal al tubo cónico por cada gramo de gránulos fecales.
   NOTA: Aumente el volumen de la solución a 20 ml si es necesario. Este estudio utilizó 1 ml de solución por cada pellet (5-10 mg) también.
3. Homogeneice la mezcla a baja velocidad con un homogeneizador de sobremesa o una licuadora dentro de una campana extractora para resuspender las heces (3 X 30 s).
4. Filtrar la suspensión fecal a través de 2 capas de gasa de algodón estéril (10,2 cm x 10,2 cm). Guarde el filtrado temporalmente en un refrigerador durante un máximo de 6 h o envasarlo en viales criogénicos estériles y guárdelo en un congelador de -80 °C.
5. Limpie a fondo el homogeneizador o la licuadora siguiendo un procedimiento estándar.

3. Administración de suspensión fecal por sonda oral

1. Descongele la suspensión fecal congelada en hielo si usa muestras congeladas. Mezclar la suspensión fecal descongelada mediante vórtice.
2. Transfiera la suspensión fecal fresca o descongelada a jeringas de 1 ml.
   NOTA: Cada ratón recibirá un total de 200 μL de suspensión fecal, y cada ratón IL-10-/- en el grupo de control obtendrá 200 μL de 10% de glicerol^/ solución salina normal¹⁷.
3. Pese los ratones y elija el tamaño correcto de la aguja de sonda y el volumen máximo de dosificación.
   NOTA: Para ratones con un peso corporal entre 20-25 gramos, use una aguja de sonda curva de 20 G 3.81 cm con una bola de 2.25 mm. Consulte gavageneedle.com para obtener más información.
4. Pruebe la aguja nasogástrica midiendo la longitud desde la punta de la nariz del ratón hasta el proceso xifoide (parte inferior del esternón). Llene la jeringa con glicerol/solución salina al 10% o suspensión fecal y retire las burbujas de aire dentro de la jeringa y la aguja.
   NOTA: Si la aguja es más larga que la longitud, coloque una marca en el eje / tubo de la aguja al nivel de la nariz. No pase la aguja/tubo a través del animal más allá de ese punto para evitar la perforación gástrica.
5. Coloque una jaula para ratones en el gabinete de bioseguridad, retire la cubierta plástica de la jaula y deje la rejilla metálica en su lugar.
6. Agarre un mouse por la cola y colóquelo en el estante de metal. Sostenga el mouse por la cola con una mano y use el pulgar y los dedos medios de la otra mano para sujetar al animal agarrando la piel sobre los hombros. De esta manera, las patas delanteras se estiran hacia un lado, lo que evitará que los pies delanteros empujen la aguja hacia afuera. Extienda suavemente la cabeza del animal hacia atrás y sostenga la cabeza en su lugar con una mano.
   NOTA: Practique el manejo del ratón hasta que el experimentador tenga plena confianza antes de continuar con el experimento.
7. Coloque la aguja nasogástrica en la parte superior de la lengua dentro de la boca. Avance suavemente a lo largo del paladar superior hasta que la aguja llegue al esófago. Pase la aguja suavemente en un solo movimiento. No fuerce la aguja si se siente resistencia. Saque la aguja e inténtelo de nuevo.
8. Una vez que la aguja esté colocada y verificada correctamente, administre lentamente el material empujando la jeringa conectada a la aguja. No gire la aguja ni empuje la aguja hacia adelante, ya que puede romper el esófago. Después de la dosificación, saque suavemente la aguja.
9. Devuelva el ratón a su jaula de origen. Controle al animal durante 5-10 minutos buscando signos de dificultad para respirar o angustia. Monitoree los ratones nuevamente entre 12-24 h después del FMT.

4. Vigilancia de enfermedades y eutanasia

1. Monitorear longitudinalmente los ratones para el inicio de la EII mediante sangre fecal oculta y/o colonoscopia²¹. Evaluar la función cardíaca por ecocardiografía transtorácica^22,23.
2. Eutanasia a los animales por decapitación bajo un plano profundo de anestesia con isoflurano (1%-4%).
3. Recoger la sangre en tubos de microcentrífuga con anticoagulante y centrifugar a 1000-2000 x g durante 10 min en una centrífuga refrigerada (4 °C). Guarde el sobrenadante, designado plasma en un congelador de -80 ° C.
4. Tras la eutanasia, preparar el colon del ratón utilizando la técnica Swiss-roll²⁴ para el análisis histopatológico (tinción H&E)²⁵.
5. Medir el péptido natriurético (BNP) tipo B en plasma utilizando un kit de inmunoensayo enzimático (EIA)²³.

Resultados

Realizamos FMT de donante sano 3 veces (una vez al mes durante 3 meses) en ratones C57BL / 6J de tipo salvaje (WT) e IL-10 de 2 meses de edad. Los ratones C57BL / 6J de la misma edad (la diferencia de edad debe ser de <2 meses) sirvieron como donantes fecales y se usaron gránulos fecales frescos cada vez. Los ensayos de EIA revelaron que el BNP estaba marcadamente elevado en el plasma de ratones con deficiencia de IL-10 y que el FMT de donante sano mitigó significativamente el aumento en los niveles de BNP (

Discusión

Como tratamiento innovador en investigación, el TMF se ha convertido en un tema candente en el tratamiento de diversos trastornos en los últimos años, ya que la disbiosis de la microbiota comensal está implicada en la patogénesis de múltiples enfermedades humanas, incluyendo EII, obesidad, diabetes mellitus, autismo, enfermedades cardíacas y cáncer²⁶. Aunque el mecanismo no se ha determinado, se cree que el FMT funciona construyendo una nueva flora biológica y evitando la pérdida de bact...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA