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요약

유전 적 감수성, 점막 면역 및 장내 미세 생태 학적 환경의 상호 작용은 염증성 장 질환 (IBD)의 발병 기전에 관여합니다. 이 연구에서는 IL-10 결핍 마우스에 분변 미생물 이식을 적용하고 결장 염증 및 심장 기능에 미치는 영향을 조사했습니다.

초록

최근 몇 년 동안 미세 생태학의 발달로 장내 박테리아와 염증성 장 질환 (IBD)의 관계가 상당한 관심을 끌었습니다. 축적된 증거에 따르면 dysbiotic microbiota는 IBD에서 염증 과정을 유발하거나 악화시키는 데 적극적인 역할을 하며 분변 미생물총(FMT)은 건강한 미생물총을 IBD 환자에게 전달하면 적절한 숙주-미생물 통신을 복원할 수 있기 때문에 매력적인 치료 전략입니다. 그러나 분자 메커니즘이 불분명하고 FMT의 효능이 잘 확립되지 않았습니다. 따라서, IBD의 동물 모델에 대한 추가 연구가 필요하다. 이 방법에서는 야생형 C57BL/6J 마우스의 FMT를 대장염의 널리 사용되는 마우스 모델인 IL-10 결핍 마우스에 적용했습니다. 이 연구는 기증자 마우스에서 대변 알갱이를 수집하고, 대변 용액 / 현탁액을 만들고, 대변 용액을 투여하고, 질병을 모니터링하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 우리는 FMT가 IL-10 녹아웃 마우스의 심장 손상을 유의하게 완화하여 IBD 관리에 대한 치료 잠재력을 강조한다는 것을 발견했습니다.

서문

인간의 장내 미세 생태계는 매우 복잡하며 건강한 사람의 장에 1000 종 이상의 박테리아가 있습니다1. 장내 세균총은 장의 정상적인 생리 기능과 면역 반응을 유지하는 데 관여하며 인체와 불가분의 관계가 있습니다. 축적된 증거는 장내 미생물군집이 단순한 기생충 그룹이 아니라 인체의 일부인 마지막 인간 기관을 구성한다는 것을 시사합니다2. 장내 미생물총, 대사산물 및 초기 생애에 확립된 숙주 면역 체계 사이의 '건강한' 공생 관계는 장 항상성을 유지하는 데 중요합니다. 만성 염증과 같은 일부 비정상적인 상태에서 신체의 내부 및 외부 환경의 변화는 장 항상성을 심각하게 방해하여 dysbiosis3라고하는 장의 미생물 군집의 지속적인 불균형을 초래합니다. 사실,식이 요법, 약물 및 병원체를 포함한 여러 환경 요인에 노출되면 미생물 총이 변할 수 있습니다.

Dysbiosis는 염증성 장 질환 (IBD), 과민성 대장 증후군 (IBS) 및 위 막성 장염과 같은 다양한 장 질환의 발병 기전뿐만 아니라 심혈관 질환, 비만 및 알레르기를 포함한 장 외 질환의 증가하는 목록과 관련이 있습니다4. 미생물군 프로파일링에 따르면 IBD 환자는 박테리아 다양성이 급격히 감소하고 일부 특정박테리아 균주의 개체군이 현저하게 변화하는 것으로 나타났습니다5,6. 이 연구는 IBD 환자에서 라크노스피라세아과 박테로이데테스와 박테로이데테스가 적지만 프로테오박테리아와 악티노박테리아가 더 많다는 것을 보여주었습니다. IBD의 발병기전은 비정상적인 장내 세균총, 조절되지 않는 면역 반응, 환경 문제 및 유전적 변이를 포함한 다양한 병원성 요인과관련이 있는 것으로 믿어집니다7. 풍부한 근거는 장내 박테리아가 IBD8,9의 개시 및 적용 단계에서 역할을 한다는 것을 시사하며, 이는 장내 dysbiosis를 교정하는 것이 IBD의 치료 및/또는 유지 치료를 위한 새로운 접근 방식을 나타낼 수 있음을 시사한다.

분변 미생물 이식 (FMT)의 원형은 고대 중국에서 시작되었습니다10. 1958 년 Eiseman 박사와 그의 동료들은 관장을 통해 건강한 기증자의 대변으로 중증 위 막성 장염 4 건을 성공적으로 치료하여 인간의 대변을 사용하여 인간 질병을 치료하는 현대 서양 의학의 새로운 장을 열었습니다11. 클로스트리디움 디피실 감염(CDI)은12 번 위막성 장염의 주요 원인으로 밝혀졌으며 FMT는 CDI 치료에 매우 효과적입니다. 지난 8년 동안 FMT는 재발성 CDI13의 치료를 위한 표준 치료 요법이 되었으며, IBD와 같은 다른 장애에서 FMT의 역할을 조사하는 추가 연구가 촉발되었습니다. 지난 20년 동안 수많은 사례 보고서와 코호트 연구에서 IBD14 환자에서 FMT 사용이 문서화되었습니다. 12건의 시험을 포함한 메타 분석에 따르면 크론병(CD) 환자의 62%가 FMT 후 임상적 관해를 달성했으며 CD 환자의 69%가 임상 반응15를 보였습니다. 이러한 고무적인 결과에도 불구하고 IBD 관리에서 FMT의 역할은 여전히 불확실하며 FMT가 장 염증을 개선하는 메커니즘은 잘 이해되지 않았습니다. FMT가 클리닉에서 IBD에 대한 치료 옵션의 현재 군비에 합류하기 전에 추가 조사가 필요합니다.

이 프로토콜에서 우리는 이유 후 자발적으로 대장염이 발생하는 IL-10-/- 마우스에 FMT를 적용했으며 IBD16,17,18의 다인성 특성을 반영하는 황금 표준 역할을 했습니다. IL-10-/- 마우스는 IBD 환자와 유사한 분자 및 조직학적 특징을 나타내고, 환자와 마찬가지로 항-TNFα 요법으로 질병을 개선할 수 있기 때문에 IBD 병인을 해부하기 위해 광범위하게 사용되었습니다16. 노화 IL10-/- 마우스(생후 >9개월)는 연령이 일치하는 야생형 마우스(19)에 비해 심장 크기가 증가하고 심장 기능이 손상되어 대장염으로 인한 심장 질환을 연구하는 데 탁월한 모델이 됩니다. 그러나, 덱스트란 황산나트륨 모델 및 T 세포 유도 대장염 모델과 같은 대장염의 다른 쥐 모델도 사용될 수 있다. 우리는 경구 위관을 통해 대변 현탁액을 투여했으며, 이는 인간20의 관장보다 효과적이고 더 나은 경로로 입증되었습니다.

프로토콜

동물에 대해 수행 된 모든 절차는 갤버스턴에있는 텍사스 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 # 1512071A)의 승인을 받았습니다.

1. 신선한 분변 알갱이 수집

  1. 멸균 종이 타월, 무딘 끝 집게 및 50mL 원추형 튜브를 준비하십시오.
    1. 종이 타월과 집게를 별도의 오토클레이브 백에 넣고 180°C에서 30분 동안 건열로 오토클레이브합니다. 멸균 원추형 튜브도 사용하십시오. 원추형 튜브의 무게를 측정하고 튜브에 무게를 기록하십시오.
  2. 동물 실에서 생물 안전 캐비닛을 켭니다.
  3. 침구없이 오토 클레이브 된 깨끗한 마우스 케이지를 가져 와서 생물 안전 캐비닛에 넣으십시오. 덮개와 식품 선반을 제거하고 캐비닛 안에 넣습니다.
  4. 케이지 바닥에 멸균 종이 타월을 놓고 금속 랙을 케이지 위에 다시 놓습니다.
  5. 연령이 일치하는 대변 기증자를 식별하고 마우스 케이지를 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 케이지를 열고 기증자 마우스(C57BL/6J)의 꼬리를 부드럽게 잡고 깨끗한 케이지 상단의 금속 랙에 놓습니다.
  6. 케이지 덮개를 랙 위에 놓고 동물이 배변할 때까지 기다립니다.
    참고: 몇 개의 마우스 쓰레기를 동시에 랙에 놓습니다.
  7. 분변 펠릿을 모아 멸균 된 50mL 원추형 튜브에 넣습니다. 성별로 펠릿을 풀링합니다. 수컷과 암컷에서 수집 한 분변 알갱이를 혼합하지 마십시오.
  8. 튜브의 무게를 다시 측정하고 분변 펠릿의 무게를 계산하십시오.

2. 분변 현탁액의 제조

  1. 멸균 용액 (생리 식염수에 10 % 글리세롤)을 준비하십시오.
  2. 분변 펠릿 10g당 원뿔형 튜브에 10% 글리세롤/생리 식염수 10mL를 추가합니다.
    알림: 필요한 경우 용액 부피를 20mL로 늘립니다. 이 연구에서는 각 펠릿(5-10mg)에 대해서도 1mL의 용액을 사용했습니다.
  3. 벤치탑 균질화기 또는 흄 후드 내부의 블렌더로 혼합물을 저속으로 균질화하여 대변을 재현탁합니다(3 X 30초).
  4. 멸균면 거즈 (10.2cm x 10.2cm) 2 층으로 분변 현탁액을 여과하십시오. 여과액을 냉장고에 최대 6시간 동안 임시로 보관하거나 멸균 극저온 바이알에 포장하여 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
  5. 표준 절차에 따라 균질화기 또는 블렌더를 철저히 청소하십시오.

3. 경구 위관 영양에 의한 분변 현탁액 투여

  1. 냉동 샘플을 사용하는 경우 얼린 분변 현탁액을 얼음에서 해동하십시오. 해동 된 분변 현탁액을 와동하여 혼합하십시오.
  2. 신선하거나 해동된 분변 현탁액을 1mL 주사기로 옮깁니다.
    알림: 각 마우스는 총 200μL의 분변 현탁액을 받고 대조군의 각 IL-10-/- 마우스는 200μL의 10% 글리세롤/생리 식염수17을 받게 됩니다.
  3. 마우스의 무게를 측정하고 올바른 위관 영양 바늘 크기와 최대 복용량을 선택하십시오.
    알림: 체중이 20-25g 사이인 마우스의 경우 20mm 볼이 있는 3.81g 곡선형 위관 바늘을 2.25g 사용하십시오. 자세한 내용은 gavageneedle.com 확인하시기 바랍니다.
  4. 쥐의 코 끝에서 xiphoid 과정 (흉골의 바닥)까지의 길이를 측정하여 위관 영양 바늘을 테스트하십시오. 주사기에 10% 글리세롤/식염수 또는 대변 현탁액을 채우고 주사기와 바늘 내부의 기포를 제거합니다.
    알림: 바늘이 길이보다 길면 코 높이의 바늘 샤프트/튜브에 표시를 하십시오. 위 천공을 방지하기 위해 바늘/튜브를 그 지점을 지나서 동물을 통과시키지 마십시오.
  5. 생물 안전 캐비닛에 마우스 케이지 하나를 놓고 플라스틱 케이지 덮개를 제거한 다음 금속 랙을 제자리에 두십시오.
  6. 꼬리로 마우스 한 마리를 잡고 금속 선반에 놓습니다. 한 손으로 꼬리로 마우스를 잡고 다른 손의 엄지와 중지를 사용하여 어깨 너머의 피부를 잡고 동물을 제지하십시오. 이렇게하면 앞다리가 옆으로 뻗어 앞발이 바늘을 밀어내는 것을 방지합니다. 동물의 머리를 부드럽게 뒤로 뻗고 한 손으로 머리를 제자리에 고정하십시오.
    참고: 실험을 진행하기 전에 실험자가 완전히 확신할 수 있을 때까지 마우스 취급을 연습하십시오.
  7. 입안의 혀 위에 위관 바늘을 놓습니다. 바늘이 식도에 도달 할 때까지 입천장을 따라 부드럽게 전진하십시오. 바늘을 한 번에 부드럽게 통과시킵니다. 저항이 느껴지면 바늘에 힘을 가하지 마십시오. 바늘을 빼고 다시 시도하십시오.
  8. 바늘이 제대로 배치되고 확인되면 바늘에 부착 된 주사기를 밀어 재료를 천천히 투여하십시오. 식도가 파열 될 수있는 바늘을 돌리거나 바늘을 앞으로 밀지 마십시오. 투약 후 바늘을 부드럽게 잡아 당깁니다.
  9. 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다. 힘든 호흡이나 고통의 징후를 찾아 5-10 분 동안 동물을 모니터링하십시오. FMT 후 12-24 시간 사이에 마우스를 다시 모니터링하십시오.

4. 질병 모니터링 및 안락사

  1. 잠혈 분변 및/또는 대장 내시경 검사에 의한 IBD 발병에 대해 마우스를 종방향으로 모니터링합니다21. 경 흉부 심 초음파로 심장 기능 평가22,23.
  2. 이소 플루 란 (1 % -4 %)으로 깊은 마취 하에서 참수하여 동물을 안락사시킵니다.
  3. 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 10 분 동안 1000-2000 x g 의 항응고제 및 원심 분리기가 포함 된 미세 원심 분리기 튜브에 혈액을 수집합니다. 지정된 혈장인 상청액을 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
  4. 안락사 시, 조직병리학적 분석(H&E 염색)25을 위해 스위스-롤 기술24를 사용하여 마우스 결장을 준비한다.
  5. 효소면역분석(EIA) 키트23을 사용하여 혈장 중 B형 나트륨이뇨 펩티드(BNP)를 측정합니다.

결과

2개월 된 C57BL/6J 야생형(WT) 및 IL-10 녹아웃 마우스에 대해 건강한 기증자 FMT를 3회(3개월 동안 한 달에 한 번) 수행했습니다. 연령 일치 C57BL/6J 마우스(연령 차이는 <2개월이어야 함)를 대변 기증자로 제공하고 매번 신선한 분변 펠릿을 사용했습니다. EIA 분석에 따르면 BNP는 IL-10 결핍 마우스의 혈장에서 현저하게 상승했으며 건강한 공여자 FMT는 BNP 수준의 증가를 유의하게 완화했습니다 (

토론

혁신적인 연구 치료제로서 FMT는 IBD, 비만, 당뇨병, 자폐증, 심장병 및 암을 포함한 여러 인간 질병의 발병 기전에 공생 미생물총의 dysbiosis가 연루되어 있기 때문에 최근 몇 년 동안 다양한 장애 치료에서 뜨거운 주제가 되었습니다26. 메커니즘은 결정되지 않았지만 FMT는 새로운 생물학적 식물상을 구축하고 잔류 박테리아의 손실을 방지함으로써 작동하는 것으로 믿어집니다. 본?...

공개

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 부분적으로 국립 보건원 (R01 HL152683 및 R21 AI126097에서 Q. Li로) 및 미국 심장 협회 보조금 17GRNT33460395 (Q. Li에게) (heart.org).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Syringe, 1 mLFisher Scientific14-829-10F
Blunt end forcepsKnipex926443
Brain natriuretic peptide EIA kitSigmaRAB0386
C57BL/6J miceJackson Lab000664
CentrifugeEppendorf5415R
Conical tubesThermoFisher339650
Curved feeding NeedlesKent ScientificFNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizerOmni InternationalGLH-115
GlycerolMilliporeSigmaG5516
IL-10 knockout miceJackson Lab004366
IsofluranePiramal Critical careNDC66794-017-10
USP normal salineGrainger6280
VaporizerEuthanex Corp.EZ-108SA

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