インターロイキン10欠損マウスモデルにおける糞便微生物叢移植の治療的評価

要約

炎症性腸疾患(IBD)の病因には、遺伝的感受性、粘膜免疫、腸の微小生態学的環境の相互作用が関与しています。本研究では、糞便微生物叢移植をIL-10欠損マウスに適用し、結腸の炎症と心機能への影響を調べました。

要約

近年の微生物生態学の発展に伴い、腸内細菌と炎症性腸疾患(IBD)の関係が注目されています。蓄積された証拠は、ジスバイオティクス微生物叢がIBDの炎症プロセスの誘発または悪化に積極的な役割を果たし、健康な微生物叢をIBD患者に移すと宿主と微生物叢のコミュニケーションを回復できるため、糞便微生物叢移植(FMT)が魅力的な治療戦略であることを示唆しています。しかし、その分子メカニズムは不明であり、FMTの有効性はあまり確立されていません。したがって、IBDの動物モデルにおけるさらなる研究が必要である。この方法では、野生型C57BL/6JマウスのFMTを、大腸炎の広く使用されているマウスモデルであるIL-10欠損マウスに適用しました。この研究では、ドナーマウスから糞便ペレットを収集し、糞便溶液/懸濁液を作成し、糞便溶液を投与し、病気を監視する方法について詳しく説明します。FMTはIL-10ノックアウトマウスの心機能障害を大幅に軽減し、IBD管理の治療の可能性を強調していることがわかりました。

概要

ヒトの腸内微小生態系は非常に複雑で、健常人の腸内には1000種以上の細菌が存在する¹。腸内細菌叢は、腸の正常な生理機能と免疫応答の維持に関与しており、人体と不可分の関係にあります。蓄積された証拠は、腸内細菌叢が寄生虫のグループだけでなく、人体の一部である最後の人間の臓器を構成することを示唆しています²。腸内細菌叢、その代謝物、および幼少期に確立された宿主免疫系の間の「健全な」共生関係は、腸の恒常性を維持するために重要です。慢性炎症などのいくつかの異常な状態では、体の内部および外部環境の変化が腸の恒常性を深刻に破壊し、腸の微生物群集の持続的な不均衡^{を引き起こします。}実際、食事、薬物、病原体などの複数の環境要因にさらされると、微生物叢の変化につながる可能性があります。

嚥下障害は、炎症性腸疾患(IBD)、過敏性腸症候群(IBS)、偽膜性腸炎などのさまざまな腸疾患の病因、および心血管疾患、肥満、アレルギーなどの腸外疾患のリストの増加に関連しています⁴。微生物叢プロファイリングにより、IBD患者は細菌の多様性が劇的に減少し、特定の細菌株の集団に著しい変化があることが明らかになりました^5,6。これらの研究では、IBD患者では、クモ膜科とバクテロイデスは少ないが、プロテオバクテリアと放線菌が多いことが示されました。IBDの病因は、異常な腸内細菌叢、調節不全の免疫応答、環境上の課題、遺伝的変異など、さまざまな病原性因子に関連していると考えられています⁷。豊富な証拠は、腸内細菌がIBD ^8,9の開始および適用段階で役割を果たすことを示唆しており、腸内細菌叢症の矯正がIBDの治療および/または維持治療のための新しいアプローチを表す可能性があることを示しています。

糞便微生物叢移植(FMT)のプロトタイプは古代中国で始まりました¹⁰。1958年、アイズマン博士と彼の同僚は、浣腸を介して健康なドナーからの糞便で重度の偽膜性腸炎の4例を治療することに成功し、人間の糞便を使用して人間の病気を治療する現代西洋医学の新しい章を開きました¹¹。 クロストリジウム・ディフィシル 感染症(CDI)が偽膜性腸炎の主な原因であることが判明しており¹² 、FMTはCDIの治療に非常に効果的です。過去8年間で、FMTは再発性CDI¹³の治療のための標準治療療法になり、IBDなどの他の障害におけるFMTの役割を調査するさらなる研究を促しています。過去20年間、多数の症例報告とコホート研究が^IBD14患者におけるFMTの使用を文書化しています。12件の試験を含むメタアナリシスでは、クローン病(CD)患者の62%がFMT後に臨床的寛解を達成し、CD患者の69%が臨床反応を示した¹⁵。これらの有望な発見にもかかわらず、IBDの管理におけるFMTの役割は依然として不明であり、FMTが腸の炎症を改善するメカニズムはほとんど理解されていません。FMTが診療所でのIBDの治療オプションの現在の兵器庫に参加する前に、さらなる調査が必要です。

このプロトコルでは、離乳後に自然に大腸炎を発症し、IBD ^16,17,18の多因子性を反映するゴールドスタンダードとして機能している^IL-10-^/-マウスにFMTを適用しました。IL-10-^/-マウスは、IBD患者と同様の分子的および組織学的特徴を示し、患者と同様に抗TNFα療法で疾患を改善できるため、IBD病因を解剖するために広く使用されています¹⁶。老化したIL10-^/-マウス(>9ヶ月齢)は、年齢が一致した野生型マウスと比較して心臓のサイズが大きく、心機能障害があり¹⁹、大腸炎誘発性心疾患を研究するための優れたモデルとなっています。ただし、デキストラン硫酸ナトリウムモデルやT細胞誘発大腸炎モデルなど、大腸炎の他のマウスモデルも使用できます。経口強制経口投与で糞便懸濁液を投与し、ヒトの浣腸よりも効果的で優れた経路であることが証明されました²⁰。

プロトコル

動物に対して行われたすべての手順は、ガルベストンのテキサス大学医学部の施設動物管理および使用委員会によって承認されました(プロトコル#1512071A)。

1.新鮮な糞便ペレットの収集

1. 滅菌ペーパータオル、鈍端鉗子、および50mLの円錐管を準備します。
   1. ペーパータオルと鉗子を別々のオートクレーブバッグに入れ、180°Cの乾熱で30分間オートクレーブします。滅菌コニカルチューブも使用してください。円錐形のチューブの重量を量り、チューブにその重量を書き留めます。
2. 動物室のバイオセーフティキャビネットの電源を入れます。
3. 寝具なしでオートクレーブ滅菌した清潔なマウスケージを取り、バイオセーフティキャビネットに入れます。カバーとフードラックを取り外し、キャビネット内に置きます。
4. 滅菌ペーパータオルをケージの底に置き、金属製ラックをケージの上に戻します。
5. 年齢が一致した糞便ドナーを特定し、マウスケージをバイオセーフティキャビネットに入れます。ケージを開き、ドナーマウス(C57BL / 6J)の尾をそっとつかみ、クリーンケージの上にある金属製のラックに置きます。
6. ケージカバーをラックの上に置き、動物が排便するのを待ちます。
   注意: 数匹のマウスリッターを同時にラックに置きます。
7. 糞便ペレットを収集し、滅菌済みの50 mLコニカルチューブに入れます。性別でペレットをプールします。男性と女性から集めた糞便ペレットを混ぜないでください。
8. チューブを再度重量を量り、糞便ペレットの重量を計算します。

2.糞便懸濁液の調製

1. 滅菌溶液(生理食塩水中の10%グリセロール)を調製する。
2. 糞便ペレット1グラムごとに10mLの10%グリセロール/生理食塩水を円錐管に追加します。
   注意: 必要に応じて、溶液容量を20mLに増やします。この研究では、各ペレットに1 mLの溶液(5〜10 mg)も使用しました。
3. ベンチトップホモジナイザーまたはヒュームフード内のブレンダーを使用して混合物を低速で均質化し、糞便を再懸濁します(3 X 30秒)。
4. 糞便懸濁液を2層の滅菌綿ガーゼ(10.2 cm x 10.2 cm)でろ過します。ろ液を冷蔵庫に一時的に最大6時間保管するか、滅菌極低温バイアルに包装して-80°Cの冷凍庫に保管します。
5. 標準的な手順に従って、ホモジナイザーまたはブレンダーを完全に清掃します。

3.経口強制経口投与による糞便懸濁液の投与

1. 凍結サンプルを使用する場合は、凍結糞便懸濁液を氷上で解凍します。解凍した糞便懸濁液をボルテックスで混合します。
2. 新鮮または解凍した糞便懸濁液を1 mLシリンジに移します。
   注:各マウスは合計200μLの糞便懸濁液を受け取り、対照群の各IL-10-/^- マウスは200μLの10%グリセロール/生理食塩水¹⁷を取得します。
3. マウスの体重を量り、適切な経管栄養針のサイズと最大投与量を選択します。
   注:体重が20〜25グラムのマウスの場合、20 G 3.81 cmの湾曲した経管栄養針と2.25 mmのボールを使用します。詳しくは gavageneedle.com をご確認ください。
4. マウスの鼻の先端から剣状突起(胸骨の底)までの長さを測定して、経管栄養針をテストします。シリンジに10%グリセロール/生理食塩水または糞便懸濁液を満たし、シリンジと針内の気泡を取り除きます。
   注意: 針が長さよりも長い場合は、針のシャフト/チューブの鼻の高さに印を付けます。胃の穿孔を防ぐために、そのポイントを過ぎて動物に針/チューブを通過させないでください。.
5. マウスケージを1つバイオセーフティキャビネットに入れ、プラスチック製ケージカバーを取り外して、金属製ラックをそのままにしておきます。
6. 1匹のマウスの尻尾をつかみ、金属製のラックに置きます。片手でマウスの尾を持ち、もう一方の手の親指と中指を使って、肩の上の皮膚をつかんで動物を拘束します。このようにして、前足が横に伸び、前足が針を押し出すのを防ぎます。動物の頭をゆっくりと後方に伸ばし、片手で頭を所定の位置に保持します。
   注意: 実験に進む前に、実験者が完全に自信を持つまでマウスの取り扱いを練習してください。
7. 経管針を口の中の舌の上に置きます。針が食道に到達するまで、上口蓋に沿ってゆっくりと進みます。一気に針をスムーズに通します。抵抗が感じられる場合は、針を無理に押し込まないでください。針を取り出して、もう一度やり直してください。
8. 針が適切に配置され、確認されたら、針に取り付けられたシリンジを押してゆっくりと材料を投与します。食道を破裂させる恐れがあるため、針を回転させたり、針を前方に押したりしないでください。投与後、針をそっと引き抜きます。.
9. マウスをホームケージに戻します。呼吸困難や苦痛の兆候を探して、動物を5〜10分間監視します。FMT後12〜24時間の間にマウスを再度監視します。.

4.病気のモニタリングと安楽死

1. 潜伏性糞便および/または大腸内視鏡検査によるIBD発症についてマウスを縦方向に監視する²¹。経胸郭心エコー検査による心機能の評価^22,23.
2. イソフルラン(1%〜4%)による麻酔の深い面下での断頭によって動物を安楽死させる。
3. 抗凝固剤と遠心分離機を含む微量遠心チューブに血液を1000〜2000 x g で冷蔵遠心分離機(4°C)で10分間収集します。上清、指定された血漿を-80°Cの冷凍庫に保存します。
4. 安楽死させたら、組織病理学的分析(H&E染色)²⁵ のためにスイスロール法²⁴を使用してマウス結腸を調製します。
5. 酵素免疫測定法(EIA)キット²³を用いて血漿中のB型ナトリウム利尿ペプチド(BNP)を測定する。

結果

健康なドナーFMTを2ヶ月齢のC57BL/6J野生型(WT)およびIL-10ノックアウトマウスに3回(月に1回、3ヶ月間)実施した。年齢を一致させたC57BL / 6Jマウス(年齢差は<2か月)を糞便ドナーとして使用し、毎回新鮮な糞便ペレットを使用しました。EIAアッセイは、BNPがIL-10欠損マウスの血漿中で著しく上昇し、健康なドナーFMTがBNPレベルの増加を有意に緩和することが明らかになりました(図1A

ディスカッション

FMTは、共生微生物叢の嚥下障害がIBD、肥満、糖尿病、自閉症、心臓病、癌などの複数のヒト疾患の病因に関与しているため、革新的な治験治療として近年さまざまな疾患の治療で話題になっています²⁶。そのメカニズムは解明されていませんが、FMTは新たな生物フローラを構築し、残存菌の損失を防ぐことで機能していると考えられています。本明細書に提示された方法は?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Syringe, 1 mL	Fisher Scientific	14-829-10F
Blunt end forceps	Knipex	926443
Brain natriuretic peptide EIA kit	Sigma	RAB0386
C57BL/6J mice	Jackson Lab	000664
Centrifuge	Eppendorf	5415R
Conical tubes	ThermoFisher	339650
Curved feeding Needles	Kent Scientific	FNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizer	Omni International	GLH-115
Glycerol	MilliporeSigma	G5516
IL-10 knockout mice	Jackson Lab	004366
Isoflurane	Piramal Critical care	NDC66794-017-10
USP normal saline	Grainger	6280
Vaporizer	Euthanex Corp.	EZ-108SA