JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Взаимодействие генетической предрасположенности, иммунитета слизистой оболочки и микроэкологической среды кишечника участвует в патогенезе воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК). В этом исследовании мы применили трансплантацию фекальной микробиоты мышам с дефицитом IL-10 и исследовали ее влияние на воспаление толстой кишки и функцию сердца.

Аннотация

С развитием микроэкологии в последние годы связь между кишечными бактериями и воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) привлекла значительное внимание. Накопленные данные свидетельствуют о том, что дисбиотическая микробиота играет активную роль в запуске или ухудшении воспалительного процесса при ВЗК и что трансплантация фекальной микробиоты (FMT) является привлекательной терапевтической стратегией, поскольку передача здоровой микробиоты пациенту с ВЗК может восстановить соответствующую связь между хозяином и микробиотой. Тем не менее, молекулярные механизмы неясны, и эффективность FMT не была очень хорошо установлена. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования на животных моделях ВЗК. В этом методе мы применили FMT от мышей дикого типа C57BL / 6J к мышам с дефицитом IL-10, широко используемой мышиной модели колита. Исследование подробно описывает сбор фекальных гранул у мышей-доноров, изготовление фекального раствора / суспензии, введение фекального раствора и мониторинг заболевания. Мы обнаружили, что FMT значительно смягчает сердечные нарушения у нокаутирующих мышей IL-10, подчеркивая его терапевтический потенциал для лечения ВЗК.

Введение

Микроэкосистема кишечника человека чрезвычайно сложна, с более чем 1000 видами бактерий в кишечнике здорового человека1. Кишечная флора участвует в поддержании нормальных физиологических функций кишечника и иммунного ответа и имеет неразрывные отношения с организмом человека. Накопленные данные свидетельствуют о том, что кишечный микробиом представляет собой последний орган человека, который является частью человеческого тела, а не просто группу паразитов2. «Здоровые» симбиотические отношения между кишечной микробиотой, их метаболитами и иммунной системой хозяина, установленные в раннем возрасте, имеют решающее значение для поддержания гомеостаза кишечника. При некоторых аномальных состояниях, таких как хроническое воспаление, изменения во внутренней и внешней среде организма серьезно нарушают гомеостаз кишечника, что приводит к постоянному дисбалансу микробного сообщества кишечника, называемому дисбактериозом3. Фактически, воздействие нескольких факторов окружающей среды, включая диету, лекарства и патогены, может привести к изменениям в микробиоте.

Дисбактериоз связан с патогенезом различных кишечных заболеваний, таких как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), синдром раздраженного кишечника (СРК) и псевдомембранозный энтерит, а также с растущим списком внекишечных расстройств, включая сердечно-сосудистые заболевания, ожирение и аллергию4. Профилирование микробиоты показало, что у пациентов с ВЗК наблюдается резкое снижение бактериального разнообразия, а также заметные изменения в популяциях некоторых специфических бактериальных штаммов 5,6. Эти исследования продемонстрировали меньше Lachnospiraceae и Bacteroidetes, но больше протеобактерий и актинобактерий у пациентов с ВЗК. Считается, что патогенез ВЗК связан с различными патогенными факторами, включая аномальную кишечную флору, дисрегулируемый иммунный ответ, экологические проблемы и генетические варианты7. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что кишечные бактерии играют роль в фазах инициации и применения ВЗК 8,9, что указывает на то, что коррекция дисбактериоза кишечника может представлять собой новый подход к терапии и / или поддерживающему лечению ВЗК.

Прототип трансплантации фекальной микробиоты (FMT) начался в древнем Китае10. В 1958 году доктор Эйсман и его коллеги успешно лечили четыре случая тяжелого псевдомембранозного энтерита фекалиями от здоровых доноров с помощью клизмы, открыв новую главу в современной западной медицине с использованием человеческих фекалий для лечения заболеваний человека11. Было обнаружено, что инфекция Clostridium difficile (CDI) является основной причиной псевдомембранозного энтерита12 , и FMT очень эффективен при лечении CDI. За последние восемь лет FMT стал стандартом терапии для лечения рецидивирующего CDI13, что побудило к дальнейшим исследованиям, изучающим роль FMT в других расстройствах, таких как IBD. За последние двадцать лет многочисленные отчеты о случаях заболевания и когортные исследования документировали использование FMT у пациентов с IBD14. Мета-анализ, включающий 12 испытаний, показал, что 62% пациентов с болезнью Крона (БК) достигли клинической ремиссии после ТФМ, а 69% пациентов с БК имели клинический ответ15. Несмотря на эти обнадеживающие выводы, роль FMT в лечении ВЗК остается неопределенной, а механизмы, с помощью которых FMT улучшает воспаление кишечника, плохо изучены. Необходимо провести дальнейшее исследование, прежде чем FMT сможет присоединиться к нынешнему арсеналу вариантов лечения ВЗК в клиниках.

В этом протоколе мы применили FMT на мышах IL-10-/-, у которых колит развивается спонтанно после отъема и которые служили золотым стандартом для отражения многофакторной природы IBD 16,17,18. Мыши IL-10−/− широко использовались для препарирования этиологии ВЗК, поскольку они имеют сходные молекулярные и гистологические особенности с пациентами с ВЗК, и, как и пациенты, заболевание может быть улучшено с помощью анти-TNFα терапии16. Стареющие мыши IL10−/− (>9 месяцев) имеют увеличенный размер сердца и нарушенную сердечную функцию по сравнению с соответствующими возрасту мышами дикого типа19, что делает его отличной моделью для изучения сердечных заболеваний, вызванных колитом. Тем не менее, другие мышиные модели колита, такие как модель декстрана сульфата натрия и модель Т-клеточного колита, также могут быть использованы. Мы вводили фекальную суспензию через пероральный прием, что оказалось эффективным и лучшим способом, чем клизма у людей20.

протокол

Все процедуры, выполненные на животных, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского отделения Техасского университета в Галвестоне (Протокол No 1512071A).

1. Сбор свежих фекальных гранул

  1. Приготовьте стерильные бумажные полотенца, тупые щипцы и конические трубки объемом 50 мл.
    1. Поместите несколько бумажных полотенец и щипцов в отдельные автоклавные пакеты и автоклавируйте их при 180 °C в сухом огне в течение 30 минут. Используйте также стерильные конические трубки. Взвесьте конические трубки и запишите их вес на трубках.
  2. Включите шкаф биобезопасности в комнате для животных.
  3. Возьмите автоклавную чистую клетку для мыши без подстилки и поместите ее в шкаф биобезопасности. Снимите крышку и стойку для еды и поместите их внутрь шкафа.
  4. Поместите несколько стерильных бумажных полотенец на дно клетки и поместите металлическую стойку обратно поверх клетки.
  5. Определите доноров фекалий, соответствующих возрасту, и поместите клетку мыши в кабинет биобезопасности. Откройте клетку и осторожно возьмите донорскую мышь (C57BL/6J) за хвост и поместите ее на металлическую стойку поверх чистой клетки.
  6. Поместите крышку клетки на верхнюю часть стойки и подождите, пока животное (животные) испражняется.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите несколько мышечных однопометников на стойку одновременно.
  7. Соберите фекальные гранулы и поместите их в стерильную коническую трубку объемом 50 мл. Объединяйте гранулы по полу. Не смешивайте фекальные гранулы, собранные у самцов и самок.
  8. Снова взвесьте трубку и рассчитайте вес фекальных гранул.

2. Приготовление фекальной суспензии

  1. Готовят стерильный раствор (10% глицерин в обычном физиологическом растворе).
  2. Добавьте 10 мл 10% глицерина / обычного физиологического раствора в коническую трубку для каждого грамма фекальных гранул.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости увеличьте объем раствора до 20 мл. В этом исследовании также использовали 1 мл раствора на каждую гранулу (5-10 мг).
  3. Гомогенизируйте смесь на низкой скорости с помощью настольного гомогенизатора или блендера внутри вытяжного шкафа для повторного суспендирования кала (3 X 30 с).
  4. Процедить фекальную суспензию через 2 слоя стерильной хлопчатобумажной марли (10,2 см х 10,2 см). Храните фильтрат временно в холодильнике до 6 ч или упаковывайте его в стерильные криогенные флаконы и храните в морозильной камере при температуре -80 °C.
  5. Тщательно очистите гомогенизатор или блендер в соответствии со стандартной процедурой.

3. Введение фекальной суспензии пероральным приемом

  1. Разморозьте замороженную фекальную суспензию на льду при использовании замороженных образцов. Смешайте размороженную фекальную суспензию путем вихря.
  2. Переложить свежую или размороженную фекальную суспензию на шприцы по 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая мышь получит в общей сложности 200 мкл фекальной суспензии, а каждая мышь IL-10-/- в контрольной группе получит 200 мкл 10% глицерина / нормальный физиологический раствор17.
  3. Взвесьте мышей и выберите правильный размер иглы и максимальный объем дозировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для мышей с массой тела от 20 до 25 граммов используйте изогнутую иглу 20 г 3,81 см с шариком 2,25 мм. Пожалуйста, проверьте gavageneedle.com для получения дополнительной информации.
  4. Проверьте иглу, измерив длину от кончика носа мыши до мечевидного отростка (дно грудины). Наполните шприц 10% глицериновой/солевой или фекальной суспензией и удалите пузырьки воздуха внутри шприца и иглы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если игла длиннее длины, поставьте отметку на стволе иглы / трубке на уровне носа. Не пропускайте иглу / трубку через животное мимо этой точки, чтобы предотвратить перфорацию желудка.
  5. Поместите одну клетку для мыши в шкаф для биобезопасности, снимите пластиковую крышку клетки и оставьте металлическую стойку на месте.
  6. Возьмите одну мышь за хвост и положите ее на металлическую стойку. Держите мышь за хвост одной рукой и используйте большой и средний пальцы другой руки, чтобы сдерживать животное, захватывая кожу через плечи. Таким образом, передние ноги вытягиваются в сторону, что не позволит передним ногам вытолкнуть иглу. Осторожно вытяните голову животного назад и одной рукой держите голову на месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Практикуйте работу с мышью до тех пор, пока экспериментатор не получит полную уверенность, прежде чем приступить к эксперименту.
  7. Поместите иглу на верхнюю часть языка внутри рта. Осторожно продвигайтесь вдоль верхнего неба, пока игла не достигнет пищевода. Проведите иглу плавно одним движением. Не форсируйте иглу, если чувствуется какое-либо сопротивление. Выньте иглу и повторите попытку.
  8. Как только игла будет правильно помещена и проверена, медленно вводите материал, толкая шприц, прикрепленный к игле. Не вращайте иглу и не толкайте иглу вперед, что может разорвать пищевод. После дозирования аккуратно вытащите иглу наружу.
  9. Верните мышь в ее домашнюю клетку. Наблюдайте за животным в течение 5-10 минут, ища признаки затрудненного дыхания или дистресса. Снова наблюдайте за мышами через 12-24 часа после FMT.

4. Мониторинг заболеваний и эвтаназия

  1. Мониторинг мышей продольно на предмет начала ВЗК с помощью скрытой фекальной крови и/или колоноскопии21. Оцените функцию сердца с помощью трансторакальной эхокардиографии22,23.
  2. Усыпляют животных путем обезглавливания под глубокой плоскостью анестезии изофлураном (1%-4%).
  3. Соберите кровь в микроцентрифужные пробирки с антикоагулянтом и центрифугой при 1000-2000 х г в течение 10 мин в охлажденную центрифугу (4 °C). Сохраните супернатант, назначенную плазму, в морозильной камере -80°C.
  4. После эвтаназии подготовьте толстую кишку мыши с помощью швейцарской ролловой техники24 для гистопатологического анализа (окрашивание H&E)25.
  5. Измерьте натрийуретический пептид B-типа (BNP) в плазме с помощью набора23 для иммуноферментного анализа (EIA).

Результаты

Мы проводили здоровый донорский FMT 3 раза (один раз в месяц в течение 3 месяцев) на 2-месячных мышах C57BL/6J дикого типа (WT) и IL-10. Соответствующие возрасту мыши C57BL/6J (разница в возрасте должна составлять <2 месяца) служили донорами фекалий, и каждый раз использовались свежие фекальные гранулы. А...

Обсуждение

Как инновационное исследовательское лечение, FMT стал горячей темой в лечении различных расстройств в последние годы, поскольку дисбактериоз комменсальной микробиоты участвует в патогенезе множественных заболеваний человека, включая ВЗК, ожирение, сахарный диабет, аутизм, болезни сер...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана, в частности, грантами Национальных институтов здравоохранения (R01 HL152683 и R21 AI126097 для Q. Li) и грантом Американской кардиологической ассоциации 17GRNT33460395 (для Q. Li) (heart.org).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Syringe, 1 mLFisher Scientific14-829-10F
Blunt end forcepsKnipex926443
Brain natriuretic peptide EIA kitSigmaRAB0386
C57BL/6J miceJackson Lab000664
CentrifugeEppendorf5415R
Conical tubesThermoFisher339650
Curved feeding NeedlesKent ScientificFNC-20-1.5-2
GLH-115 homogenizerOmni InternationalGLH-115
GlycerolMilliporeSigmaG5516
IL-10 knockout miceJackson Lab004366
IsofluranePiramal Critical careNDC66794-017-10
USP normal salineGrainger6280
VaporizerEuthanex Corp.EZ-108SA

Ссылки

  1. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clinica Chimica Acta. 451, 97-102 (2015).
  2. Baquero, F., Nombela, C. The microbiome as a human organ. Clinical Microbiology and Infection. 18, 2-4 (2012).
  3. Hawrelak, J. A., Myers, S. P. The causes of intestinal dysbiosis: a review. Alternative Medcine Review. 9 (2), 180-197 (2004).
  4. Carding, S., Verbeke, K., Vipond, D. T., Corfe, B. M., Owen, L. J. Dysbiosis of the gut microbiota in disease. Microbial Ecology in Health and Disease. 26 (1), 26191 (2015).
  5. Ma, H. Q., Yu, T. T., Zhao, X. J., Zhang, Y., Zhang, H. J. Fecal microbial dysbiosis in Chinese patients with inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 24 (13), 1464-1477 (2018).
  6. Chu, Y., et al. Specific changes of enteric mycobiota and virome in inflammatory bowel disease. Journal of Digestive Diseases. 19 (1), 2-7 (2018).
  7. Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F., Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature reviews Gastroenterology and Hepatology. 9 (10), 599-608 (2012).
  8. Podolsky, D. K. Inflammatory bowel disease. The New England Journal of Medicine. 347 (6), 417-429 (2002).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53 (1), 1-4 (2004).
  10. Shi, Y. C., Yang, Y. S. Fecal microbiota transplantation: Current status and challenges in China. JGH Open: An Open Access Journal of Gastroenterology and Hepatology. 2 (4), 114-116 (2018).
  11. Markley, J. C., Carson, R. P., Holzer, C. E. Pseudomembranous enterocolitis: A clinico pathologic study of fourteen cases with a common etiologic factor. AMA Archives of Surgery. 77 (3), 452-461 (1958).
  12. Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection and pseudomembranous colitis. Best Practice and Research Clinical Gastroenterology. 17 (3), 475-493 (2003).
  13. Kelly, C. R., de Leon, L., Jasutkar, N. Fecal microbiota transplantation for relapsing Clostridium difficile infection in 26 patients: methodology and results. Journal of Clinical Gastroenterology. 46 (2), 145-149 (2012).
  14. Borody, T. J., Warren, E. F., Leis, S., Surace, R., Ashman, O. Treatment of ulcerative colitis using fecal bacteriotherapy. Journal of Clinical Gastroenterology. 37 (1), 42-47 (2003).
  15. Cheng, F., Huang, Z., Wei, W., Li, Z. Fecal microbiota transplantation for Crohn's disease: a systematic review and meta-analysis. Techniques in Coloproctology. 25 (5), 495-504 (2021).
  16. Scheinin, T., Butler, D. M., Salway, F., Scallon, B., Feldmann, M. Validation of the interleukin-10 knockout mouse model of colitis: antitumour necrosis factor-antibodies suppress the progression of colitis. Clinical and Experimental Immunology. 133 (1), 38-43 (2003).
  17. Keubler, L. M., Buettner, M., Hager, C., Bleich, A. A multihit model: Colitis lessons from the interleukin-10-deficient mouse. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (8), 1967-1975 (2015).
  18. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  19. Sikka, G., et al. Interleukin 10 knockout frail mice develop cardiac and vascular dysfunction with increased age. Experimental Gerontology. 48 (2), 128-135 (2013).
  20. Fecal microbiota transplantation-standardization study group. Nanjing consensus on methodology of washed microbiota transplantation. Chinese Medical Journal (Engl). 133 (19), 2330-2332 (2020).
  21. Kodani, T., et al. Flexible colonoscopy in mice to evaluate the severity of colitis and colorectal tumors using a validated endoscopic scoring system). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50843 (2013).
  22. Cheng, H. -. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51041 (2014).
  23. Tang, Y., et al. Chronic colitis upregulates microRNAs suppressing brain-derived neurotrophic factor in the adult heart. PLoS One. 16 (9), 0257280 (2021).
  24. Orner, G. A., et al. Suppression of tumorigenesis in the Apc(min) mouse: down-regulation of beta-catenin signaling by a combination of tea plus sulindac. Carcinogenesis. 24 (2), 263-267 (2003).
  25. Kline, K. T., et al. Neonatal injury increases gut permeability by epigenetically suppressing E-Cadherin in adulthood. The Journal of Immunology. 204 (4), 980-989 (2020).
  26. DeGruttola, A. K., Low, D., Mizoguchi, A., Mizoguchi, E. Current understanding of dysbiosis in disease in human and animal models. Inflammatory Bowel Diseases. 22 (5), 1137-1150 (2016).
  27. Chevalier, G., et al. Effect of gut microbiota on depressive-like behaviors in mice is mediated by the endocannabinoid system. Nature Communications. 11 (1), 6363 (2020).
  28. Kao, D., et al. Effect of oral capsule- vs colonoscopy-delivered fecal microbiota transplantation on recurrent clostridium difficile infection: A randomized clinical trial. JAMA. 318 (20), 1985-1993 (2017).
  29. Cammarota, G., et al. International consensus conference on stool banking for faecal microbiota transplantation in clinical practice. Gut. 68 (12), 2111-2121 (2019).
  30. Vemuri, R., et al. The microgenderome revealed: sex differences in bidirectional interactions between the microbiota, hormones, immunity and disease susceptibility. Seminar Immunopathology. 41 (2), 265-275 (2019).
  31. Wilkinson, N. M., Chen, H. -. C., Lechner, M. G., Su, M. A. Sex differences in immunity. Annual Review of Immunology. , (2022).
  32. Lee, C. H., et al. Frozen vs fresh fecal microbiota transplantation and clinical resolution of diarrhea in patients with recurrent clostridium difficile infection: A randomized clinical trial. JAMA. 315 (2), 142-149 (2016).
  33. Hamilton, M. J., Weingarden, A. R., Sadowsky, M. J., Khoruts, A. Standardized frozen preparation for transplantation of fecal microbiota for recurrent clostridium difficile infection. American Journal of Gastroenterology. 107 (5), 761-767 (2012).
  34. Tang, G., Yin, W., Liu, W. Is frozen fecal microbiota transplantation as effective as fresh fecal microbiota transplantation in patients with recurrent or refractory Clostridium difficile infection: A meta-analysis. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 88 (4), 322-329 (2017).
  35. Cui, B., et al. Fecal microbiota transplantation through mid-gut for refractory Crohn's disease: safety, feasibility, and efficacy trial results. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 30 (1), 51-58 (2015).
  36. Li, P., et al. Timing for the second fecal microbiota transplantation to maintain the long-term benefit from the first treatment for Crohn's disease. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (1), 349-360 (2019).
  37. Moayyedi, P. Update on fecal microbiota transplantation in patients with inflammatory bowel disease. Gastroenterology and Hepatology. 14 (5), 319 (2018).
  38. Saha, S., Mara, K., Pardi, D. S., Khanna, S. Long-term safety of fecal microbiota transplantation for recurrent clostridioides difficile infection. Gastroenterology. 160 (6), 1961-1969 (2021).
  39. Perler, B. K., et al. Long-term efficacy and safety of fecal microbiota transplantation for treatment of recurrent clostridioides difficile infection. Journal of Clinical Gastroenterology. 54 (8), 701-706 (2020).
  40. Safety alert regarding use of fecal microbiota for transplantation and risk of serious adverse events likely due to transmission of pathogenic organisms. FDA Available from: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/safety-availability-biologics/safety-alert-regarding-use-fecal-microbiota-tramsplantation-and-risk-serious-adverse-events-likely (2020)

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

18210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены