Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo

Resumen

Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).

Resumen

El objetivo del presente estudio es comparar la efectividad del uso de cebos para insectos versus medio selectivo artificial para aislar hongos entomopatógenos (EPF) de muestras de suelo. El suelo es un hábitat rico en microorganismos, incluyendo EPF particularmente perteneciente a los géneros Metarhizium y Beauveria, que pueden regular las plagas de artrópodos. Los productos biológicos a base de hongos están disponibles en el mercado principalmente para el control de plagas de artrópodos agrícolas. Sin embargo, a pesar de la alta biodiversidad endémica, solo unas pocas cepas se utilizan en bioproductos comerciales en todo el mundo. En el presente estudio, se cultivaron 524 muestras de suelo en agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC). El crecimiento de colonias de hongos se observó durante 3 semanas. Todos los Metarhizium y Beauveria EPF fueron identificados morfológicamente a nivel de género. Además, algunos aislamientos fueron identificados molecularmente a nivel de especie. Veinticuatro de estas 524 muestras de suelo también fueron estudiadas para detectar la aparición de EPF utilizando el método de cebo para insectos (Galleria mellonella y Tenebrio molitor). Se aislaron un total de 51 cepas de EPF (41 Metarhizium spp. y 10 Beauveria spp.) de las 524 muestras de suelo. Todas las cepas de hongos se aislaron de tierras de cultivo o pastizales. De las 24 muestras seleccionadas para la comparación, el 91,7% fueron positivas para EPF con cebo Galleria , el 62,5% con cebo Tenebrio y el 41,7% con CTC. Nuestros resultados sugirieron que el uso de cebos de insectos para aislar el EPF del suelo es más eficiente que el uso del medio CTC. La comparación de métodos de aislamiento además de la identificación y conservación de EPF tiene un impacto positivo en el conocimiento sobre la biodiversidad. La mejora de la colección EPF apoya el desarrollo científico y la innovación tecnológica.

Introducción

El suelo es la fuente de varios microorganismos, incluidos los hongos entomopatógenos (EPF). Este grupo particular de hongos es reconocido por su capacidad para colonizar y a menudo matar a los huéspedes artrópodos, especialmente a los insectos¹. Después del aislamiento, la caracterización, la selección de cepas virulentas y el registro, los EPF se producen en masa para el control de plagas de artrópodos, lo que respalda su relevancia económica². En consecuencia, el aislamiento de EPF se considera el primer paso para el desarrollo de un bioplaguicida. Beauveria spp. (Hypocreales: Cordycipitaceae) y Metarhizium spp. (Hypocreales: Clavicipitaceae) son los hongos más comunes utilizados para el control de plagas de artrópodos³. Los EPF se han aislado con éxito del suelo, artrópodos con micosis visible, plantas colonizadas y rizosfera vegetal ^4,5.

El aislamiento de EPF también puede ser útil para estudiar la diversidad, distribución y ecología de este grupo en particular. La literatura reciente informó que el uso de EPF está subestimado, citando varias aplicaciones no convencionales de EPF, como su capacidad para mejorar el crecimiento de las plantas⁴, para eliminar contaminantes tóxicos del suelo y para ser utilizado en medicina⁶. El presente estudio tiene como objetivo comparar la eficiencia de aislar EPF del suelo utilizando cebos para insectos versus medio de cultivo artificial ^7,8,9. El uso de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) como cebo para insectos en el contexto del aislamiento de EPF ha sido bien aceptado. Estas larvas son utilizadas en todo el mundo por la comunidad científica como modelo experimental para estudiar las interacciones huésped-patógeno^10,11. La larva de Tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) se considera otro modelo de insecto para estudios que involucran virulencia y para el aislamiento de EPF ya que este insecto es fácil de rarar en el laboratorio a un bajo costo ^7,12.

Se pueden aplicar métodos independientes del cultivo, como el uso de una variedad de técnicas de PCR, para detectar y cuantificar EPF en sus sustratos, incluido el suelo^13,14. Sin embargo, para aislar adecuadamente estas colonias de hongos, su sustrato debe cultivarse en un medio artificial selectivo⁹, o los hongos presentes en las muestras pueden ser cebados utilizando insectos sensibles¹⁵. Por un lado, CTC es un medio artificial libre de dodina que consiste en agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida. Este medio fue desarrollado por Fernandes et al. ⁹ para maximizar la recuperación de Beauveria spp. y Metarhizium spp. naturales del suelo. Por otro lado, las larvas de G. mellonella y T. molitor también pueden utilizarse con éxito como cebos para obtener aislados de EPF del suelo. Sin embargo, según Sharma et ^al.15, menos estudios reportaron el uso concomitante y la comparación de estos dos insectos de cebo. Los suelos de los viñedos portugueses exhibieron recuperaciones significativas de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larvas de molitor en comparación con larvas de G. mellonella; en contraste, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) El aislamiento de Vuill se relacionó con el uso de cebos de G. mellonella ¹⁵. Por lo tanto, la decisión sobre qué método de aislamiento de EPF utilizar (es decir, G. mellonella-bait, T. molitor-bait o CTC medium) debe considerarse de acuerdo con el objetivo del estudio y la infraestructura del laboratorio. El objetivo del presente estudio es comparar la efectividad del uso de cebos para insectos versus el medio selectivo artificial para aislar EPF de muestras de suelo.

Protocolo

Como el presente estudio accedió al patrimonio genético brasileño, la investigación fue registrada en el Sistema Nacional de Gestión del Patrimonio Genético y los Conocimientos Tradicionales Asociados (Sisgen) bajo el código AA47CB6.

1. Muestreo de suelos

1. Recolecte 800 g de tierra (con o sin raíces secundarias de plantas incidentes) a una profundidad de 10 cm con una pala pequeña. Guárdelos en bolsas de polipropileno a temperatura ambiente hasta el inicio del experimento.
   NOTA: También se pueden recolectar raíces pequeñas ya que se informa que EPF tiene competencia de rizosfera. Cuanto más rápido sea el procesamiento de las muestras, mejor porque las esporas de hongos pueden ser menos viables con el tiempo. En el presente estudio, las muestras se analizaron no más de 7 días después de la recolección.
2. Utilice un GPS para identificar la ubicación de las muestras recolectadas en latitud y longitud y clasificar el área recolectada según el tipo de suelo (por ejemplo, pastizales, selva tropical nativa, orillas de lagos o tierras de cultivo).

2. Métodos de aislamiento para hongos entomopatógenos

1. Aislamiento mediante medio artificial selectivo CTC.
   1. Para preparar el medio CTC [agar de dextrosa de papa más extracto de levadura (PDAY) suplementado con 0.5 g / L de cloranfenicol, 0.001 g / L de tiabendazol y 0.25 g / L de cicloheximida⁹], pese todos los reactivos individualmente, mézclelos en agua destilada y esterilice el medio en autoclave. En un gabinete de bioseguridad, placa 23 ml del medio en placas de Petri de 60 mm x 15 mm.
      PRECAUCIÓN: Al pesar los reactivos de CTC, use una bata de laboratorio, máscara, guantes y gafas porque la cicloheximida y el cloranfenicol son tóxicos.
   2. Pesar 0,35 ± 0,05 g de cada muestra de suelo (con o sin raíces) y colocarla en un microtubo de 1,5 ml.
   3. En un gabinete de bioseguridad, agregue 1 ml de suspensión acuosa estéril de polioxietileno sorbitano monooleato al 0,01% (vol/vol) al microtubo que contiene el suelo y el vórtice durante 30 s.
   4. Retire 50 μL del sobrenadante y pipetearlo en el centro de las placas de Petri con medio CTC. Disperse homogéneamente las suspensiones sobre la superficie del medio utilizando una espátula estéril de Drigalski (6 mm de diámetro).
      NOTA: Se deben preparar al menos tres réplicas para cada muestra de suelo.
   5. Incubar las placas en cámaras climáticas (25 ± 1 °C, humedad relativa ≥80%) en la oscuridad y observar el crecimiento de colonias de hongos después de 7, 14 y 21 días de incubación.
   6. Observar la macromorfología y micromorfología de las colonias fúngicas que buscan EPF. Transfiera los cultivos de EPF al medio de agar dextrosa de papa más cloranfenicol al 0,05% (PDAC) hasta obtener cultivos puros.
      NOTA: Utilice las claves de descripción que se presentan a continuación en el paso 3 para la identificación de colonias de EPF.
2. Aislamiento mediante cebos para insectos
   1. Use larvas de etapa tardía de G. mellonella y T. molitor desinfectadas en superficie. Sumergir las larvas en hipoclorito de sodio al 0,5% durante 1 min para la esterilización. Lave las larvas dos veces con agua estéril.
      NOTA: En el presente estudio se utilizaron larvas de G. mellonella de la cuarta etapa. Los estadios larvales de T. molitor no se estandarizaron.
   2. Use macetas de plástico para ensamblar los cebos. Agregue 250 g de tierra recolectada a cada maceta de plástico (98 mm de ancho x 47 mm de alto x 142 mm de largo). Separar 15 larvas de cada especie (T. molitor y G. mellonella) y depositar cinco larvas por maceta de plástico. Guarde las macetas a 25 ± 1 °C y la humedad relativa ≥ 80% en la oscuridad.
      NOTA: Perfore 10 orificios pequeños (2 mm de diámetro) en las tapas de la olla para permitir la ventilación. Se puede usar un dispositivo de hierro calentado afilado para perforar los agujeros.
   3. Homogeneizar el suelo cada dos días para permitir el máximo contacto de las larvas con el suelo.
      NOTA: La humedad es importante para apoyar la infección por hongos de las larvas. Para mantener la humedad en el suelo, rocíe agua destilada estéril en la superficie del suelo siempre que sea necesario. No remoje la muestra de suelo en agua.
   4. Analiza las macetas diariamente buscando insectos muertos.
      NOTA: Observe las larvas restantes en la colonia diariamente para detectar signos patológicos de invertebrados para asegurarse de que los insectos no estén infectados. Como alternativa, se pueden incluir en el estudio macetas de control con suelo estéril para verificar el estado de salud de las larvas de insectos.
   5. Retire los insectos muertos y esterilícelos superficialmente con hipoclorito de sodio al 0,5% durante 1 min. Colocar los insectos estériles en una cámara húmeda (humedad relativa ≥ 80%) a 25 ± 1 °C durante 7 días para favorecer la exteriorización de hongos entomopatógenos (micosis).
   6. Tras la micosis, cosecha los conidios de la superficie del insecto. Utilice un bucle microbiológico para colocar los conidios en el medio PDAC bajo un microscopio estereoscópico. Como alternativa, coloque las larvas infectadas enteras en el medio PDAC. Incubar las placas de cultivo en una cámara climática a 25 ± 1 °C y la humedad relativa ≥ 80%.
   7. Observe la macromorfología y micromorfología de las colonias de hongos en las placas para confirmar la identidad de EPF. Repita el cultivo en PDAC hasta que se obtengan colonias de hongos puros.
      NOTA: Utilice las claves de descripción que se presentan a continuación en el paso 3 para la identificación de colonias de EPF.

3. Identificación de EPF (Metarhizium spp. y Beauveria spp.)

1. Analizar las características macromorfológicas de los cultivos fúngicos en las placas (es decir, superficie y reverso de colonias, su forma, borde, tasa de crecimiento, color, textura, pigmento difusible, exudados y conidios aéreos) después de 14 días a 25 ± 1 ° C y humedad relativa ≥ 80%.
2. Transferir los conidios aéreos a cultivos deslizantes (técnica de microcultivo)¹⁶ durante 3 días a 25 ± 1 °C y humedad relativa ≥ 80% y teñir con azul lactofenol para observar las características microscópicas (es decir, disposición de conidios, conidióforos, forma y tamaño de los conidiomas)17,18,19,20.
3. Observe las estructuras fúngicas microscópicas a 400x utilizando un microscopio óptico para confirmar la identificación de EPF.
   NOTA: Las claves morfológicas para EPF se describen en los informes de Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al. y Humber 17,18,19,20. La macro y micromorfología de las colonias de hongos son los criterios más frecuentes utilizados para identificar hongos filamentosos a nivel de género. Dependiendo del género del EPF, estas características morfológicas cambiarán. Humber²⁰ presenta una clave de identificación para los principales géneros de entomopatógenos fúngicos. Las colonias de Metarhizium spp., por ejemplo, suelen ser circulares, polvorientas, exhiben diferentes tonos de verde y pueden presentar exudado. Microscópicamente, estas colonias tienen células conidiogenas apicales en conidióforos ampliamente ramificados y densamente entrelazados que forman un himenio compacto, y conidios cilíndricos a elipsoides en cadenas paralelas que forman columnas o masas en forma de placa. Las colonias de Beauveria spp. suelen ser blancas, polvorientas o similares al algodón. Exhiben células conidiogenas con una porción basal dilatada que se extiende apicalmente en dirección zigzagueante. Los conidióforos de Beauveria forman densos grupos de conidios en forma de globo. Los análisis moleculares son necesarios para la identificación de EPF a nivel de especie.
4. Realizar análisis moleculares en los aislados para la identificación taxonómica a nivel de especie. Para las cepas de EPF aisladas en este estudio, a saber, Metarhizium spp. y Beauveria spp., realizar análisis moleculares basados en los informes de Bischoff et ^al.17 y Rehner et ^al.18.
5. Después de confirmar que los aislados son EPF, deposite los aislados en una colección de cultivos de hongos. En el presente estudio, los aislados fueron depositados en la colección de cultivos fúngicos entomopatógenos del Laboratorio de Control Microbiano (LCM) de la Universidad Federal Rural de Río de Janeiro.

Resultados

Se recolectaron un total de 524 muestras de suelo de pastizales: pastos para ganado (165 muestras), bosque tropical nativo (90 muestras), junto al lago (42 muestras) y tierras cultivadas / de cultivo (227 muestras) entre 2015 y 2018 en el estado de Río de Janeiro, Brasil. Los detalles de las coordenadas geográficas de las muestras positivas para EPF se dan en la Tabla suplementaria 1.

De las 524 muestras de suelo, 500 muestras se analizaron solo utilizando medio CTC, y 24 mu...

Discusión

Los hábitats naturales y agrícolas del suelo son ambientes típicos de EPF²² y un excelente reservorio natural. En el presente estudio, se abordaron dos métodos de aislamiento de EPF utilizando cebos de insectos versus medio selectivo. El primer paso para el aislamiento es la recolección de las muestras de suelo. El almacenamiento adecuado y la identificación de muestras de suelo son cruciales. La información sobre la latitud, longitud, tipo de suelo y bioma es esencial para los estudios que...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Autoclave	Phoenix Luferco	9451
Biosafety cabinet	Airstream ESCO	AC2-4E3
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Climate chambers	Eletrolab	EL212/3
Coverslip	RBR	3871
Cycloheximide	Sigma-Aldrich	C7698
Drigalski spatula	Marienfeld	1800024
GPS app	Geolocation app	2.1.2005
Lactophenol blue solution	Sigma-Aldrich	61335
Microscope	Zeiss Axio star plus	1169 149
Microscope camera	Zeiss Axiocam 105 color	426555-0000-000
Microscope softwere	Zen lite Zeiss 3.0
Microscope slide	Olen	k5-7105-1
Microtube	BRAND	Z336769-1PAK
Petri plates	Kasvi	K30-6015
Pipette tip	Vatten	VT-230-200C/VT-230-1000C
Pippette	HTL - Labmatepro	LMP 200 / LMP 1000
Plastic pots	Prafesta descartáveis	8314
Polypropylene bags	Extrusa	38034273/5561
Potato dextrose agar	Kasvi	K25-1022
Prism software 9.1.2	Graph Pad
Shovel	Tramontina	77907009
Tenebrio mollitor	Safari	QP98DLZ36
Thiabendazole	Sigma-Aldrich	T8904
Tween 80	Vetec	60REAVET003662
Vortex	Biomixer	QL-901
Yeast extract	Kasvi	K25-1702